移植非洲爪蟾胚胎细胞核引起花背蟾蜍成熟卵单性发育的研究

移植非洲爪蟾胚胎细胞核引起花背蟾蜍成熟卵单性发育的研究 () 动物学报 46 2: 183 ,189 , 2000 A ct a Zoologica S i nica 移植非洲爪蟾胚胎细胞核引起花背蟾蜍 3成熟卵单性发育的研究 梁桂霞 司克媛 李 荔 陈永龙 ( )西北师范大学生物学系 , 兰州 730070 摘 要 将非洲爪蟾胚胎细胞核移入花背蟾蜍成熟未受精卵后 , 得到了发育至各期的胚胎 。 对发育不同时期的胚胎 , 进行了乳酸脱氢酶同工酶谱及染色体组型分析 , 结果显示其均与 受体一致 。根据实验分析认为 , 非洲爪蟾的胚胎细胞核进入花背蟾蜍成熟卵后 , 引起的是 花背蟾蜍的单性发育 。 关键词 非洲爪蟾 花背蟾蜍 胚胎细胞核 单性发育 利用细胞核移植的方法研究细胞分化 、核质关系等方面的问题 , 已有许多报道 。其 () () () 中 King 和 Briggs 1953、Moo re 1958、Gurdo n 1962等分别以两栖类为材料 , 进 ( ) ( ) 行了不同种间的细胞核移植 ; 童第周等 1973、严绍颐等 1984用鱼类进行了不同 亚科间的细胞核移植 , 并得到发育至性成熟期的核质杂种鱼 。上述工作为研究发育生物 学 、遗传学问题奠定了一定的工作基础 。 1980 年以来 , 我们以无尾两栖类的花背蟾蜍和中华大蟾蜍为材料 , 进行了种内 、 () 种间的细胞核移植 毛铭廷和梁桂霞 , 1987 ; 梁桂霞和毛铭廷 , 1990, 并对移植胚胎 ( 进行了染色体和乳酸脱氢酶同工酶谱分析 梁桂霞和毛铭廷 , 1991 ; 张遵义和梁桂霞 , ) 1993。结果表明 , 在两个种间正反组合的移核胚胎中 , 供体核乳酸脱氢酶基因均从 17 () 期 尾芽期开始在异种细胞质中得到表达 。染色体组型分析的结果表明 , 移植胚胎的 染色体从数目上和形态上均有变化 。近年来 , 我们又进行了无尾两栖类不同科目间的细 胞核移植实验 , 试图了解无尾类远缘核质组合下 , 移核卵发育的前途及命运 , 为进一步 探讨动物早期发育中的核质关系 、发育机理等提供实验证据 。以下我们报道将非洲爪蟾 胚胎细胞核移入花背蟾蜍成熟未受精卵后的胚胎发育情况 , 及其乳酸脱氢酶同工酶谱及 染色体组型等方面的分析结果 。 1 材料和方法 111 材料 ( ) 实验用非洲爪蟾 Xenop us L aev is 由中国科学院发育生物学研究所引入 、在本室饲养的个体 ; ( ) ( )花背蟾蜍 B uf o R ad dei 系采自兰州地区自然界性成熟个体 , 中华大蟾蜍 B uf o buf o ga rga ri z ans 1998204222 收稿 , 1999206223 修回 3 甘肃省教委科学基金资助项目 第一作者简介 梁桂霞 , 女 , 45 岁 , 高级实验师 。研究方向 : 发育生物学 。 ( ) () 采自西安市郊 。前者为无尾类负子蟾科 Pipidae, 后两者为蟾蜍科 Bufo nidae。 112 方法 () ( ) 实验分 4 组 : 1非洲爪蟾囊胚细胞核移入花背蟾蜍成熟未受精卵 ; 2非洲爪蟾囊胚细胞核移 ( ) ( ) 入花背蟾蜍成熟去核未受精卵 ; 3中华大蟾蜍囊胚细胞核移入花背蟾蜍成熟去核未受精卵 ; 4花 背蟾蜍囊胚细胞核移入花背蟾蜍成熟去核未受精卵 。后两组为对照组 。对 4 个组中移核后发育不同时 期的胚胎进行了乳酸脱氢酶同工酶 、染色体等方面的检测及分析 。有关细胞核移植 、乳酸脱氢酶同工 ( 酶检测 、染色体标本的制作及分析等方法同前文 毛铭廷和梁桂霞 , 1978 ; 梁桂霞和毛铭廷 , 1991 ; ) 张遵义和梁桂霞 , 1993。 2 结 果 211 4 个组别中移核胚胎发育的结果 表 1 列出了 4 个组别中移核卵发育至不同时期的比例数 。移核胚胎发育时期分为卵 裂期 、囊胚期 、原肠胚期 、神经胚期 、蝌蚪期及变态后幼体 。 表 1 中所列出的各期胚胎数 , 以胚胎发育的外部形态进入该期的初期之后被计入 。 其中卵裂期及囊胚期 , 以正常卵裂和正常囊胚计算 ; 原肠期以背唇出现为标志 ; 幼体指 完全变态后的幼蟾 。 表 1 四个组移核胚胎发育结果 Ta ble 1 Developmental results of nucleus2transplanted embryos in f our groups 移核胚胎发育至各期的比例数 移核卵数 ( )组 别 核质搭配 Develop ment al ratio of embryo s at different st ages Number of ( Gro up Nucleocytoplasmic t ransplanted 卵裂期 囊胚期 原肠期 神经胚 尾芽期 蝌 蚪 幼 蟾 )co mbinatio n egg ( ) () ( ) ( ) ( ) ( ) ( )CleavageBlast ulaGast rulaNeurulaTail2budTo dpoleMetam ( ) 1爪蟾核 ?花背去核卵 554 247 202 80 31 19 8 2 ( )X . n ?B . nucleated 100 % 44 . 6 % 36 . 5 % 14 . 4 % 5 . 6 % 3 . 4 % 1 . 4 % 0 . 36 % ( ) 2爪蟾核 ?花背未去核卵 121 49 38 30 9 5 3 1 ( )X . n ?B . non2nucleated 100 % 40 . 5 % 31 . 4 % 24 . 7 % 7 . 4 % 4 . 1 % 2 . 5 % 0 . 83 % ( ) 3中华核 ?花背去核卵 350 153 102 67 23 9 7 0 ( )B . b. n ?B . nucleated 100 % 43 . 7 % 29 . 1 % 19 . 1 % 6 . 6 % 2 . 5 % 2 . 0 % 0 ( ) 4花背核 ?花背去核卵 534 312 257 197 101 73 46 18 - ( )B . n ?B . nucleated 100 % 58 . 4 % 48 . 1 % 36 . 9 % 18 . 9 % 13 . 7 % 8 . 6 % 3 . 4 % 从表 1 中看出 , 4 个组中移核胚胎随着发育时期的进展 , 其比例数均逐步下降 , 其 中以神经胚期最为显著 , 实际上移核胚胎发育受阻表现在原肠期较为严重 , 尤其是在质 () () 核不相融的情况下 如第 3 组, 常出现外原肠胚 即植物极的细胞不能内卷, 但这样 的胚胎不能进入神经胚期 , 这些胚胎因背唇出现均被计入原肠胚期 , 结果显示出神经胚 期的比例数明显下降 。 () 移核胚胎发育的比率 , 两个实验组中 , 第 2 组高于第 1 组 未去核组高于去核组; 两个对照组中 , 花背本种移核组胚胎发育比率均高于实验组 , 而以中华蟾蜍囊胚细胞核 2 期 梁桂霞等 : 移植非洲爪蟾胚胎细胞核引起花背蟾蜍成熟卵单性发育的研究 185 作供体的对照组 , 其胚胎发育的比率均低于实验组 。 212 实验组移核胚胎乳酸脱氢酶同工酶谱分析结果 对两个实验组移核胚胎早期发育中 4 个不同阶段的全胚胎进行了乳酸脱氢酶同工酶 分析 , 酶谱比较的结果显示 4 个不同发育时期移核胚胎的乳酸脱氢酶同工酶谱类型均与 () 受体一致 图版 ?: 4。 213 实验组移植胚胎染色体组型分析结果 对两个实验组中发育至原肠后期的移核胚胎进行了染色体组型分析 , 结果显示出均 () 与受体一致 图版 ?: 1 , 2 , 3。 讨 论 3 从实验结果中看出 , 非洲爪蟾的胚胎细胞核不但引起了花背蟾蜍成熟卵的发育 , 而 且发育的比率远远超过了中华蟾蜍和花背蟾蜍的种间移核组 。此结果的反常现象 , 结合 对移核胚胎进行的乳酸脱氢酶同工酶谱及染色体组型的分析结果 , 基本上可以判断 , 非 洲爪蟾的胚胎细胞核进入花背蟾蜍成熟卵后 , 引起的是花背蟾蜍的单性发育 。然而不同 科间的胚胎细胞核能够引起异种成熟未受精卵的单性发育 , 而且有较高的发育比率 , 这 在有性杂交及有关人工单性生殖方面的工作中都是很少见的 , 为此有些问题很值得讨 论 。 311 非洲爪蟾的胚胎细胞核对受体卵所起的作用 关于无尾两栖类人工单性生殖方面的工作 , 自本世纪初开始 , 以 Bataillo n 、朱洗为 代表的许多学者在不同种上进行过大量的研究 。他们的实验证明 , 单纯的针刺只能使成 熟的卵子激动 , 而不能有正常合规的卵裂 。如果在针刺前 , 给卵外涂上血液 , 使针头入 卵时将血球带入卵内 , 这类血细胞的核不仅能够激活卵子 , 而且能产生引起正常卵裂的 (( ) () 双星光 朱洗 , 1959。后来 Heidemann 和 Kirschner 1975研究了各种植入物 四膜 ) 虫的鞭毛 、基体 、纤毛及大脑核微管等对爪蟾未受精卵内星体形成的诱导功能 , 结果 () 发现纯化的基体能导致星体的形成 。Maller 等 1976的研究结果表明 , 给爪蟾卵内注 () 入部分纯化的海胆精子 只含头部的中心粒 、基板和染色体, 可导致纺锤体的形成和 卵裂 , 并且证明破坏精子头部的染色质 , 其诱导能力不受影响 。因此 , 他认为精子头部 ( ) 的中心粒和基板是具有活性的成分 。Klot 等 1990给爪蟾卵内注入纯化的人类淋巴 细胞中心体 , 结果也产生了爪蟾的孤雌生殖 , 而且他的实验结果证明孤雌生殖并不依赖 于与中心体有关的核酸 , 但却必须有中心体结构的完整性 。 根据前人的研究工作可推测 , 本实验中 , 移植远缘胚胎细胞核引起受体卵单性发育 (的机理在于 : 其供体核与受体卵质之间亲缘关系过远 , 以至于供体核内的遗传物质 即 ) 染色体成份在受体卵质内失去活性 , 因此二者之间的矛盾不能得以产生 ; 而处于分裂 (活跃期的供体 ———囊胚细胞核外的细胞质内 在移核过程中 , 核外始终包含有一部分细 ) 胞质可能含有的中心体物质 , 为受体卵的进一步发育 , 即分裂星光的形成 , 提供了必 要的物质条件 , 从而引起了受体卵的单性发育 。 312 本实验结果的意义 () 在有关动物有性杂交方面 , 朱洗 1961曾作过详细的论述 。他认为杂交能否成功 () () ( ) 的因素在于 : 1精子能否进入卵内 ; 2精子中心体能否产生分裂星光 ; 3精子染 () 色体能否形成雄核 ; 4雄核能否与雌核结合 , 并协调一致地进入子代的发育 。如果双方的核不能协调一致 , 那么 , 杂种胚胎发育成绩的好坏 , 全看父性染色体被逐得或早 、 或晚 、或完全 、或局部而定 , 愈早 、愈完全 , 胚胎发育愈好 , 当然这几乎等于单性发育 。 本实验用的非洲爪蟾与花背蟾蜍之间 , 在进行有性杂交实验结果中 , 杂交卵不能发 生卵裂 , 此种情况有可能是精子不能入卵 , 或入卵后不能产生分裂星光 。无论哪种情况 都表明 , 此两个异种的物种之间进行有性杂交是不能成功的 。而对照组中 , 中华大蟾蜍 ( 与花背蟾蜍之间无论有性杂交还是核质组合 , 所获得的都是真正的杂种胚胎 梁桂霞 ) 等 , 1991 ; 1994。因此 , 根据上述理论 , 我们不难理解本实验结果中实验组的胚胎发育反而比中华大蟾蜍与花背蟾蜍种间移核组的胚胎发育比率高的原因所在 。然而利用移 植远缘胚胎细胞核诱导单性发育的研究 , 在有关资料中未见报道 。本实验结果揭示 , 通 过细胞核移植的方法 , 不但能够引起在有性杂交中不能发育的两个物种之间得到了发育的后代 , 而且有着较高的发育比率 。故本研究结果将为进一步研究有关人工单性生殖方 面的工作提供一个新的思路和实验方法 。 313 单性发育个体二倍体的来源 () 朱洗等 1959利用涂血针刺的方法 , 对中华蟾蜍进行的人工单性发育的实验中 ,曾得到能传种接代的单性发育个体 。他指出 , 凡是能正常生长发育的个体 , 其染色体数 目均为二倍体 。在我们的实验结果中也显示出 , 在移核胚胎发育过程中 , 凡是能够正常 () 发育 , 并达到变态的个体 , 其体形与对照组 花背蟾蜍本种受精完全相同 , 且染色体 检查结果均为二倍体 。 ()朱洗曾总结出 4 个方面 : 1 对于人工单性发育个体二倍体的来源问题 , 卵细胞未 () ()接着又产曾进行成熟分裂 ; 2第二极体返回卵内 ; 3在单星光分裂染色体增倍后 , ( ( ) 4 在无星光分裂染色体增倍后 , 又产生双星光 分 裂 朱 洗 等 ,生双星光的分裂 ; ) 1940。他在后来进行的蛙类杂交实验中见到第二极体返回的例证 , 并认为 , 这至少是 () 单性发育个体中二倍体的一种可靠来源 朱洗 , 1961。 对此问题 , 本研究不能提供更确切的例证 。然而 , 我们认为 , 无论属于上述哪种情 况 , 它们的产生是偶然的 , 随意的 , 还是受一定的条件或因素控制的 ? 这个问题有待进 一步的探讨 。 314 工作展望 实验结果显示 , 两个实验组中 , 去核组移核卵也有一定的发育比率 , 而且与未去核 ( ) ( ) 组相差不大 。对于这个问题 , 我们认为有以下几个方面的可能性 : 1挑核失败 ; 2 () 挑出的核与第二极体一同返回卵内 ; 3卵子在受到供体提供的中心体的激活下 , 卵内 重新合成和组装出新的染色体组 。对于这些问题的解决 , 需要作进一步深入细致的工 作 。我们将积极寻求机会继续进行下去 。 参 考 文 献 ( Ref erences) Gurdo n , J . 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Zhang , Z. Y. , G. X. Liang and M . T. Mao 1993 The p henot ype of L D H isozymes during early develop ment of em2 bryo s o btained by interspecific nuclear t ransplantatio n bet ween B uf o B uf o ga rga ri z a ns and B uf o ra d dei . A ct a Zool . ( ) S i n . 3: 280,286 . 张遵义 , 梁桂霞 , 毛铭廷 1993 蟾蜍种间核移植胚胎发育早期 L D H 同工酶的表现. ( ) 动物学报 39 3: 280,286 . 外 文 摘 要 ( Abstract) PA RTHENO GENESIS OF B U FO RADD EI MATURE EGGS TO W HIC H 3X EN O PUS L A EV IS BL ASTOM ERE NUCL EI WERE TRA NSPL A NTED L IAN G Gui2Xia SI Ke2Yuan L I Li CHEN Yo ng2Lo ng ( )Depa rt ment of B iology , N ort h w est N or m al U ni versi t y , L a nz hou 730070 , Chi na Embryo s at different develop mental stages are o btained by t ransplanting Xenop us l aev is blasto mere unclei to B uf o ra d dei unfertilized eggs. The L D H isozymes and chro mo so me karyot ype analysis demo nst rated t hat t he nuclear2t ranplanted embryo s exhibited t he charac2 teristics of B uf o ra d dei . The result s show t hat t he blasto mere nuclei of Xenop us l aev is in2 duces t he part henogenesis of unfertilized egg in B u f o ra d dei . Key words Xenop us l aev is , B uf o ra d dei , Blasto mere nuclei , Part henogenesis 图版 ? 梁桂霞等 : 移植非洲爪蟾胚胎细胞核引起花背蟾蜍成熟卵单性发育的研究 L IAN G Gui2Xia et al . : Part henogenesis of B uf o ra d dei mat ure eggs to w hich ? Plate Xenop us l aev is blasto mere nuclei were t ransplanted ( 11 花背蟾蜍囊胚期染色体组型 2n = 22 , 大型染色体 6 对 , 小型染色体 5 对 Karyot ype of blast ula of B uf o ra d dei ) 2n = 22 , 12 large and 10 small2sized chro mo so mes×1 000 ( 21 非洲爪蟾囊胚期染色体组型 2n = 36 , 均为中小型染色体 Karyot ype of blast ula of Xenop us l aev is 2n = 36 , which ) are all middle and small2sized chro mo so mes×400 ( 31 移核胚胎染色体组型 2n = 22 , 大型染色体 6 对 , 小型染色体 5 对 , 与受体相同 Karyot ype of nuclear t ransfer em2 ) bryo , 12 large and 10 small2sized chro mo so mes , which co nfo r ms to t hat of t he recipient ×400 41 非洲爪蟾 、花背蟾蜍及移核胚胎各期 L D H 同工酶电泳图谱 。图中 A 、B 分别为非洲爪蟾成熟卵及尾芽期胚胎电 泳图谱 ; C 、D 分别为花背蟾蜍成熟卵及尾芽期胚电泳图谱 。a,f 分别为移核胚胎囊胚晚期 、原肠晚期 、胚胎转 ( ) ( ) 动期 、肌肉感应期及心跳期胚胎的电泳图谱 均与受体一致L D H z ymogram of Xenop us pi pi dae A , B, B uf o ( ) () ra d dei C , Dand embryo by nuclear t ransfer a,f . A , C : Mat ured eggs B , D : Tail2bud stage a : Blast ula stage b : L ate gast rula stage c : Embryo rotatio n stage d : muscle reactio n stage e : Heart beat stage ; Which all co nfo r m to t hat of t he recipent