[DOC] 移植途径对大鼠骨髓间充质干细胞归巢及肝功能恢复的影响

[DOC] 移植途径对大鼠骨髓间充质干细胞归巢及肝功能恢复的影响 移植途径对大鼠骨髓间充质干细胞归巢及 肝功能恢复的影响 2011l期(创刊县)ChinJCellStemCell(ElectronicEdition).Aug2011,Vo1.1.No.1 移植途径对大鼠骨髓问充质干细胞归巢 及肝功能恢复的影响 何秀华李东良江军徐颖范敬静陈娟陈胜平 【摘要】目的探讨移植途径对骨髓间充质干细胞(MSCs)归巢及促进肝切除大鼠肝 再生的影响.方法建立肝切除大鼠模型,随机分为3组,即肝切除对照组,尾静脉移植组 和门静脉移植组.移植组分别经尾静脉和门静脉注射4’,6一二脒基一2一苯基吲哚(DAPI)标 ,分别于第3天和第9天后采血清检测肝功 记的MSCs约1.5×10/只 能,第9天处死大鼠 取肝脏标本,并通过荧光显微镜观察两种移植途径对MSCs向肝脏迁移的影响.结果门 静脉移植组(18.14-3.4)个细胞/lO0倍视野到肝脏归巢及定植的MSCs多于尾静脉移植组 (7.64-2.0)个细胞/1【)(】倍视野,差异有统计学意义(P<0.01).术后 第9天各组大鼠肝功 能均有好转,丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)3组之间对比差异无 统计学意义(F=2.822,1.046;P=0.057,0.365);但两移植组与单纯肝切除组比较血浆白蛋 白(ALB)均有明显升高,差异具有统计学意义(F=6.259,P=0.006);尾静脉移植组与门静 脉移植组两移植组之间相比,差异无统计学意义(P>0.05).结论移植途径对MSCs归巢, 定植到肝脏有一定影响,门静脉途径优于外周静脉,MSCs移植对肝大部切除大鼠肝功能 恢复具有促进作用. 【关键词】骨髓间充质干细胞;4’,6一二脒基一2一苯基吲哚;肝切除术;干细胞移植 EffectoftransplantatiOnapproachonhomingofbonemarrowmesenchymal stemcells andrecoveryofliverfunctioninratsHEXiu—hua*,LIDong—liang,JIANGJun.XUYing,FAN Jing-jing,CHENJuan,CHENSheng-ping.*DepartmentofHepatobiliaryM edicineofFuzhou GeneralHospitalFuzhou350025,China Correspondingauthor.”LIDong-liang,E—mail..dongliangli@gmail.corn 【Abstract】 ObjectiveToobservetheeffectoftransplantationapproachonhoming ofbonemarrowmesenchymalstemcellsandpromotingliverregenerationinratsafter hepatectomy.MethodsBonemarrowmesenchymalstemcells(about1.5×10eachrat)labeled withDAP1wereinjectedviathetailorportalveinofratsafterhepatectomy.Serumwas collectedtoevaluateliverfunctiononthe3rddayandthe9thdayafterhepatectomy.Animals weresacrificedonthe9thdaytocollectliversamples.Fluorescencemicroscopywasusedto observecellmigration.ResultsThenumberofbonemarrowmesenchymalstemcellshoming toliverwassignificantlyhigherintheratsreceivingtransplantationviatheportalveinthanthose viathetailveinf18.1-4-3.4VS7.6士 2.0/HPFx100).Thedifferencewasstatisticallysignificant fP<0.O1).Theliverfunctionofallgroupsimprovedonthe9thdayafterhepatectomy.There werenosignificantdifferenceinALTandASTamongthreegroupsfF=2.822,1.046;P= 0.057.0.365).ALBofthetwocelltransplantationgroupsweresignificantlyhigherthancontrol group(F6.259,P=0.006),whiletherewerenosignificantdifferencebetweentwocell transplantationgroups(P>0.05).ConclusionsTransplantationapproachmayinfluenceMSCs homing’toliver.Thetransplantationviatheportalveinissuperiortothatviathe tai1vein.MSC transplantationtoratsaftermajorhepatectomycanpromoterecoveryof1iverfunction. 【Keywords】Bonemarrowmesenchymalstemcells;4’,6一 diamindino-2-phenylindole; Hepatectomy:Stemcelltransplantation 37 实验研究 DOI:10.3877/cma.j.issn.20951221.2011.01.008 基金项日:南京军区医学科学创新基金(联卫2007534) 作者单位:350025福州,南京军区福州总医院肝胆内科[何秀华(现在 福建省泉州市第一一医院工作),李东良,徐颖,范敬静,陈娟,陈 胜平)];解放军第一三医院感染科(江军) 通讯作者:李东良,Email:dongliangli@gma订.com 中华细胞与干细胞杂志(电子版)2011年8月第1卷第1期(创刊 号)ChinJCellStemCell(ElectronicEdition),Aug20l1,Wo1.1,No.! 活体肝移植是近年来发展起来的,种治疗 终末期肝病的新技术,为解决供肝来源的短缺开 拓了新的途径.活体肝移植的关键性技术之一是 使移植到受体的肝组织块以及供体剩余的肝组织 能尽快再生,以满足机体代谢所需有效的肝体积. 因此,促进部分肝移植肝再生的研究也就成了近 年来器官移植领域一个新的研究热点.骨髓间充 质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),是中 胚层分化而成的一种非造血成体干细胞,近年来 发现其不仅具有强大的潜在自我更新能力,并且 在特定条件下可以分化成脂肪细胞,成骨细胞和 肝细胞等多种细胞,动物实验亦明MSCs可以 修复损伤或基因突变的骨,软骨和心肌等组织[11. 但MSCs促进肝再生的确切作用尚不十分明确. 本研究建立肝大部切除大鼠模型,将体外培养的 骨髓MSCs分别通过尾静脉及门静脉两种途径 移植到肝脏,观察其在肝脏的归巢,定植及对肝再 生的作用,为骨髓干细胞(bonemarrowstemcell, BMSCs)治疗肝病提供理论依据. 材料和方法 一 ,材料 清洁级Sprague—Dawley(SD)大鼠共36只, 其中10周龄(体重180,220g)31只,4周龄(体 重60,8Og)5只,均购白上海斯莱克实验动物有 限责任公司,许可证号SCXK(沪)2007,0005,饲 养于南京军区福州总医院比较医学中心IVC清 洁级实验动物饲养系统;DMEM/F12培养基及 胰酶均购自美国Gibico公司;胎牛血清购自奥 地利PAA公司;仓鼠抗大鼠CD29.PE,小鼠抗大 鼠CD45一PE,小鼠抗大鼠CD90.1PE均购白美 国BioLegend公司;小鼠抗大鼠CD34一PE购自美 国SantaCruz公司;4’,6一二脒基一2一苯基吲哚 (4’,6-diamidino一2一phenylindole,DAPI)购白美 国Roche公司. 二,大鼠骨髓MSCs的分离与培养 将体重6O,8OgSD大鼠,用10%水合氯醛 按0-3ml/100g剂量腹腔注射麻醉,置于75%酒 精浸泡约20min,头部露于酒精液面以上,无菌 条件下分离出大鼠的股骨和胫骨,用注射器冲出 骨髓细胞后经4号针头吹打,制成单细胞悬液,用 加10%胎牛血清DMEM/F12重悬细胞,接种于 25cm2的培养瓶,置于37?,5%CO饱和湿度的 恒温培养箱中培养,3d后首次换液,以后每2,3d 换液1次,7,10d细胞生长融合,经0.25%胰酶 消化,1:2传代,其后一般3d传代1次,选取生长 良好的P3代细胞进行下列实验. 三,大鼠骨髓MSCs的鉴定 胰酶消化P3代细胞,PBS洗涤2次,分别加 入PE标记CD29,CD34,CD45和CD90单克隆 荧光抗体,同型对照,室温避光孵育,应用流式细 胞仪检测MSCs的表面标志. 四,DAPI标记MSCs 取P3代MSCs,待细胞60%,70%融合时, 培养液中加入终浓度为1g/mlDAPI溶液,孵 育12h后用PBS洗涤至少6次,去除未与细胞结 合的DAPI,在荧光显微镜下观察细胞标记情况. 五,肝大部切除模型构建 体重18O,220g的SD大鼠31只,乙醚持续 吸入麻醉,仰卧位固定,于剑突下O.5cm腹中线 剪开约6cm长切口,打开腹腔,从肝蒂处结扎并 切除肝左叶,中叶约70%肝体积.观察创面无渗 血后缝合关闭腹腔,24h未死亡,活力及饮食基本 恢复正常的3O只肝大部切除大鼠用于实验研究. 六,分组处理 (1)肝切除组:9只,肝大部切除;(2)MSCs 尾静脉移植组:1】只,肝大部切除后24h,乙醚适 度麻醉大鼠,将1.5ml约含1.5x10的MSCs悬液 从大鼠尾静脉缓慢注入;(3)MSCs门静脉移植 组:10只,肝大部切除后,即将0.15ml约含1.5X l0的MSCs悬液从大鼠门静脉缓慢注入. 七,MSCs归巢情况观察 取术后9d肝组织制作冰冻切片,于荧光显 微镜下肝组织中DAPI标记的细胞计数. 八,大鼠肝功能检测 术后第3天,眼眶后静脉采血1,2ml, 经5000r/min离心3min获血清0.5ml,全自 动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT),天冬氨酸氨基转移酶 (aspartateaminotransferase,AST)和血浆白蛋白 (albumin,ALB).术后第9天采用10%水合氯 醛0-3ml/100g麻醉后,下腔静脉采血l,5ml做 ALT,AST和ALB检测. 中华细胞与干细胞杂志(电子版)2011年8月第l卷第1期(创刊 号)ChinJCellStemCell(ElectronicEdition).Au22011.Vo1.1.No.1 九,统计学处理 采用SPSS11.5统计软件包,肝功能检测结果 用士S表示,组问均数比较采用ANOVA方法,以 尸<O.05为差异具有统计学意义. 结果 一 ,MSCs的分离培养 分离培养的细胞早期呈圆形,随后逐渐伸展, 呈成纤维细胞样,并逐渐生长排列为漩涡状(图1). 二,MSCs表面标志物测定 流式细胞仪结果显示细胞均一性较好, CD34,CD45的阳性率分别为O.32%,0.60%, CD29,CD90的阳性率分别为98.6%,99.5%,说 明传代贴壁生长的梭形细胞为MSCs(图2). 三,大鼠术后一般情况 大鼠于术后半天内开始活动,进食和饮水. 对照组9只大鼠均存活.门静脉移植组中1只大 鼠因门静脉注射细胞后止血不彻底而死亡,成活 9只.尾静脉移植组中有2只大鼠于注射细胞后 即出现呼吸困难,四肢无力而死亡,成活9只.术 后9d,对照组中3只,门静脉组和尾静脉组中1只 出现腹部显着膨隆,解剖发现腹腔大量清亮腹水. 四,MSCs归巢情况 MSCs移植术后第9天,荧光显微镜观察肝组 织中带有蓝色荧光的DAPI标记阳性的MSCs细 胞,尾静脉移植组大鼠肝组织可见较少量的DAPI 标记细胞;尾静脉组(7.6-4-2.0)个细胞/100倍视 野,门静脉组(18.1士3.4)个细胞/100倍视野.两 组比较差异具有统计学意义(尸<O.01).说明移 植等量MSCs,门静脉移植组到肝脏定归巢及定植 的MSCs多于尾静脉移植组(图3). 五,大鼠肝功能变化 术后第3天检查各组大鼠均出现不同程度 的血清转氨酶升高及ALB降低,各组之间相比 均无统计学意义(P>0.05).术后第9天各组大 鼠肝功能均有好转,ALT及AST3组之间差异无 统计学意义(尸>0.05),但两个移植组与单纯肝切 除组比较ALB均有明显升高,差异具有统计学 意义(F=6.259,P=O.006),尾静脉移植组与门静 脉移植组两移植组之间相比差异无统计学意义 (尸>0.05,表1). 讨论 BMSCs是具有自我更新,高度增生和多向分 化潜能的细胞群体.BMSCs主要包括造血干细 胞(hemopoieticstemcells.HSCs)和MSCs.骨髓 MSCs是骨髓基质中主要的干细胞,参与基质微环 境的组成和造血功能的调控,并且可以跨越胚层 横向分化为各种组织细胞[2-61,包括向肝样细胞分 化,具备取材方便,体外培养技术成熟,以及自体 移植潜能等优点,可为组织损伤和疾病治疗提供 一 种理想的”种子”细胞.因此成为近年来再生 医学和组织工程研究的热点之一. 内环境和肝脏本身微环境是促进骨髓 MSCs向肝样细胞转化的关键因素,分化的肝样 细胞能够对损伤的肝脏起到一定的修复作用. Arikura等将先天性白蛋白缺乏症大鼠肝脏 做70%切除后,立即通过门静脉植入正常大鼠 骨髓MSCs,4周后在受体肝脏检测到白蛋白阳 性并表达白蛋白mRNA的肝细胞,血清中也检 测到白蛋白.AbdelAzizet等[8]将雄性大鼠骨髓 中CD29MSCs通过尾静脉移植入肝纤维化模 型雌性大鼠体内,研究结果提示MSCs在体内可 以分化为肝样细胞,并通过减少胶原沉积来发挥 其抗纤维化作用.这些研究为MSCs治疗肝病 提供了理论依据.但也有相反的研究报道,例如 在Cantz等[.的研究中没有发现骨髓MSCs向肝 细胞分化,并促进其再生作用.包括MSCs在内 表1术后不同时间各组肝功能比较(土) 注:与对照组相比,<O.05 40?虫绁胞王细胞圭i电壬)年簋鲞箜1期(创干lJ曼 jChinJCellStemCell(ElectronicEdition),Aug2011,Vo1.1,No.1 的干细胞治疗肝脏疾病还有许多问需要研究和 探讨. 本实验建立肝大部切除大鼠模型,通过尾 静脉和门静脉两种不同途径输注DAPI标记的 MSCs,主要观察DAPI阳性MSCs在肝脏的归 巢,定植和对肝功能恢复的影响.结果移植等量 MSCs,门静脉移植组到肝脏归巢及定植的MSCs 多于尾静脉移植组,移植途径对MSCs归巢,定 植到肝脏有一定影响;另外,移植组肝脏合成白 蛋白功能恢复的较快,提示MSCs具有促进肝细 胞再生的能力.但是,两种移植途径相比在肝功 能改善方面并没有显示出明显差异,其原因和机 制值得进一步研究和探讨,推测可能与观察时问 较短有一定关系,但也不排除MSCs只起到一个 刺激肝细胞或肝卵圆细胞活化的作用,因此肝脏 合成能力的改善与归巢定植到肝脏的MSCs数 量不一致.一般认为肝部分切除后的肝再生主要 由肝细胞再生完成,只有在大部分肝细胞死亡或 肝毒性物质持续作用时,卵圆细胞才快速增殖,参 与肝再生[1.骨髓细胞向肝细胞转化仅在严 重急性肝损伤的情况下发生,如卵圆细胞死亡时, BMSCs或定居于骨髓的肝干细胞迅速发生迁移, 在肝脏中增殖分化为肝细胞m].MSCs在肝大 部切除术后是否也有促进肝再生的作用尚不明 确,本研究结果提示骨髓MSCs具有促进肝大部 切除大鼠肝再生的作用.这为活体部分肝移植术 后迅速促进肝再生,防治小肝综合征的发生提供 了一条新的思路,值得进一步深入研究. (本文图1,3见光盘) 2 参考文献 何秀华,李东良.骨髓干细胞治疗肝病研究进展[J]. 国际消化病杂志,2010,30(3):129—131. HayaseM.KitadaM.WakaoS.eta1.Committedneura1 progenitorcellsderivedfromgeneticallymodified bonemarrowstromalcellsamelioratedeficitsinarat modelofstroke[J1.JCerebBloodFlowMetab2009, 29f8,:1409—1420. Tokcaer.KeskinZ.AkarARAyaloglu.ButunF.eta1. Timingofinductionofcardiomyocytedifferentiationfor invitroculturedmesenchymalstemcells:aperspective foremergencies[J].CanJPhysiolPharmacol,2009, 87f21:143?150. GeindreS,Serre—Beiniereta1. LiuJW,Dunoyer— CharacterizatiOnOfendothelia1.1ikecellsderivedfrom humanmesenchymalstemcells[J].JThrombHaemost. 2007,5(4):826—834. HuJ,FengK,LiuX,eta1.ChondrogeniCand osteogenicdifferentiationsofhumanbonemarrow— derivedmesenchymalstemcellsonananofibrous scaffoldwithdesignedporenetwork[J].Biomaterials, 2009,30(28):5061—5067. 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