载脂蛋白B基因与胆石病患者血脂水平的关系研究

载脂蛋白B基因与胆石病患者血脂水平的关系研究 载脂蛋白B基因与胆石病患者血脂水平的 关系研究 肝胆外科杂志2005年8月第13卷第4期JournalofHepatobiliarySurgery,Vo1.13,No.4,Aug.2005309 ? 研究简报? 载脂蛋白B基因与胆石病患者血脂水平的关系研究 龚伟达,谈永飞,杨松,周苏君,莫锦良,喻荣彬,沈冲,丁伟良,姚才良 【关t词】胆石病;载脂蛋白B基因;多态性;血脂 【中圈分类号】R657.42【文献标识码】B【文章编号】1006—4761(2005)O4—0309—03 胆石病(Gallstonedisease,GD)是一种外科常见病,多发 病,常呈现一定的家族聚集性,明其具有遗传倾向.胆石的 形成与脂质代谢和血脂成分的改变关系密切.近年来,有关 血脂代谢的相关基因与胆石病关系问受到国内外学者的 关注?.本研究应用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态 性(PcR—RFLP)技术,探索载脂蛋白B(ApolipoproteinB, ApoB)基因XbaI,EcoRI位点多态性与胆石病患者血脂成 分的关系. l材料与方法 1.1研究对象 于2001年12月至2002年3月,选择江苏省宜兴市人民 医院的住院和门诊病人作为研究对象.病例组106例,均经B 超诊断后行胆囊切除手术确诊对照组在同一医院选择,经B 超检查排除胆石病者.计105例. 1.2研究方法 1.2.1基因组DNA抽提 抽取5ml空腹静脉血.用酚一氯仿法抽提DNA. 1.2.2按文献的报道合成引物_2 (上海生工) XbaI一5'=GGAGACTATTCAGAAGCTAA; XbaI一3'一GAAGAGCCTGAAGACTGACT;EcoRI一5' =CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG:EcoRI一3'一 CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC. 1.2.3PCR扩增反应 反应管中依次加入1O×PCR缓冲液3ul,25mmol/L MgC123ul,2mmol/LdNTP3ul,20pmol/L引物各lu1.模板 DNA0.4ug,Taq聚合酶2U,加灭菌去离子水使总反应体积 为30ul.反应条件;95C预变性5min,继之95C变性lmin, 58C退火lmin,72C延伸1.5min,为一个循环,共3O个循环, 最后一个循环再延伸5min.扩增在PTC一200Peltier ThermalCycler上进行,用2%琼脂糖凝胶(含0.5g/L溴乙 【基金项目】江苏省社会发展科技指导性项目(BS99322) 【作者单位】1.江苏省宜兴市人民医院,无锡2l4200 2.南京医科大学流行病与卫生统计学系 【作者简介】龚伟达,男,副主任医师,研究方向t腹部外科. 【收稿日期】2004—09—2l 【惨回日期】2004一l1—2O 锭)电泳,鉴定上述产物. 1.2.4限制性内切酶酶切反应 在XbaI和EcoRI多态位点的PCR扩增产物中分别加 入对应的限制性内切酶20U(Promega公司),37C消化过夜 后,以2%的琼脂糖凝胶电泳酶切产物.存在XbaI酶切 位点者酶切后显示433bp和277bp两条片段,缺乏该酶切位 点者仅有1条710bp片段,相应有3种基因型:X+X+,X+X 一 和X—X一.存在EcoRI酶切位点者酶切后显示253bp和 227bp2条片段,缺乏酶切位点者仅显示1条长480bp的片 段,相应的基因型有3种:E+E+,E+E一和E—E一. 1.2.5血脂成分测定 方法分别为总胆固醇(Tc):cH0D—PAP酶法;甘油三 酯(TG):GP0一PAP酶法;高密度脂蛋白胆固醇(HDLc):磷 钨酸一镁(PTA—Mg)酶法;低密度脂蛋白胆固醇(LDLc): 用Friedewald公式计算,以mmol/L计LDLc—TC—HDLc — TG/2.2;ApoA,ApoB:ELISA法,以上指标均用 Olympus640生化分析仪测定. 1.3统计分析 原始数据核对后输入微机用EpiData软件建立数据库, 采用SAS6.12软件包进行统计分析.计量资料采用t检验,计 数资料采用)C检验. 2结果 2.1一般情况 病例组男性29例,女性77例,平均年龄52.17士13.O2 岁.对照组男性32例,女性73例,平均年龄51.3O土12.91岁. 两组性别构成(一0.249,P一0.617)和平均年龄(t=0. 485,P一0.628)差异不显着. 2.2酶切多态性分析结果 存在XbaI酶切位点者酶切后显示433bp和277bp两条 片段,缺乏该酶切位点者仅有1条710bp片段,相应有3种基 因型;X+X+,X+X一和X—X一.存在EcoRI酶切位点者 酶切后显示253bp和227bp2条片段,缺乏酶切位点者仅显示 1条长480bp的片段,相应的基因型有3种:E+E+,E+E一 和E—E一.如图1: 2.3血脂成分(X土)与ApoB基因多态性的关系 2.3.1由表1可见,ApoB基因XbaI位点X+X一基因型 者,胆石病组的LDLc,ApoB水平显着高于对照组(t分别2. O5,2.25,P分别为0.049,0.031),HDL水平显着低于对照组 310肝胆外科杂志2005年8月第13卷第4期 JournalofItepatobiliarySurgery,Vo1.13,No.4,Aug.2005 0:2.74,P一0.010).X—X一基因型者,胆石病组LDLc水 平显着高于对照组(f一2.55,P一0.011),HDLc水平显着低 于对照组(f=1.99,P一0.048). 2.3.2ApoB基因EcoRI位点E+E+基因型者,胆石病组 LDLc,ApoB水平显着高于对照组(t分别为3.65,2.61,P分 别为0.003,0.009),HDLc水平显着低于对照组(,一2.03,P 一0.044);E+E一基因型者各血脂水平两组差异均无显着 性. 12345678 480bp 253bp 227bp 100bp 注:l,3,5,6泳道为E+E+,4,7泳道为E+E一,未见E—E一,8泳道 为Marker 表1胆石病组和对照组ApoB基因XbaI位点多态性与血脂水平的关系 注:*表示同一基因型两组比较有显着性(尸<O.05),下同. 表2胆石病组和对照组ApoB基因EcoRI位点多态性与血脂水平的关系 3讨论 大量的流行病学表明胆石病的发生与机体的脂质代谢 关系密切,与血脂蛋白水平的改变有关.尤其是HDL胆固醇 水平的降低和LDL胆固醇和甘油三脂水平的升高可增加胆 石病发生的风险.ApoB是LDL的主要载脂蛋白,在肝细胞 表面特异的受体结合,以参加和维持胆固醇代谢平衡,肝 LDL—apoB受体的活性是肝脏胆固醇摄入和血清胆固醇水 平的主要决定因素L3].载脂蛋白的形态多样性与脂蛋白水 平,胆固醇及胆酸代谢密切相关,可能影响胆石的形成 人类ApoB基因定位在第2号染色体短臂末端,包含29 各外显子和28各内含子.其中位于第26外显子的XbaI的多 态性位点,是ApoB蛋白第2488位氨基酸的编码基因密码 子,该氨基酸为苏氨酸,由于发生C—T的碱基替换,致使 XbaI的一个酶切位点产生,从而形成多态位点.国外报道 XbaI酶切位点多态性明显影响血脂水平,纯合子X+x+基 因血浆中TC,LDL,ApoB100水平最高,x+x一杂合子次 之x—x一纯合子最低].本组血脂水平分析显示,ApoB 基因XbaI位点x+X一基因型者,胆石病组的LDLc,ApoB 水平显着高于对照组,HDL水平显着低于对照组,提示 ApoB基因XbaI位点的变异导致血脂代谢异常,在胆石病的 发生中可能具有一定的作用.在胆石病组X+X+基因型者 各项血脂水平在两型之间差异均不显着.Renges等认为,虽 然XbaI位点变异并未改变氨基酸序列,不能直接影响体内 脂质代谢,但其可作为一个标记,与ApoB基因本身的功能 性突变或l临近胆固醇水平的序列发生连锁不平衡,减弱了 LDL与其受体结合,影响LDL的分解代谢率,导致体内脂质 水平异常j. 近年来研究认为胆结石.尤其是胆固醇结石的形成,主 要与胆固醇过饱和有关.机体血脂水平直接影响胆汁的代谢 和分泌,使胆囊胆汁的化学成分发生改变,如果胆固醇含量 升高,且胆汁酸和(或)磷脂含量下降,胆汁胆固醇过饱和,容 易形成结石L】].有学者认为X+等位可能通过增加ApoB的 肝胆外科杂志2005年8月第13卷第4期 JournalofHepatobiliarySurgery,Vo1.13,No.4,Aug.2005311 分子数量而导致结石的形成.ApoB分子数量的增加,血浆 中TC,LDLc和ApoB也升高;由于ApoB分子数量增加,其 通过肝细胞表面LDL受体向肝内转运的胆固醇增加,使分 泌入胆汁的胆固醇增多,并进一步使胆汁酸合成减少,导致 胆汁胆固醇过饱和,从而增加胆汁的致石性. ApoB基因EcoRI位点多态性是由于eDNA第12669位 核苷酸G--~A突变,使原有的EcoRI酶切点消失,即E一等 位基因,并使第4154位的氨基酸残基谷氨酸为赖氨酸所取 代,使GAA被AAA取代.国内外有关EcoRI位点多态性与 冠心病,动脉粥样硬化,脂质代谢紊乱等关系的报道多见,和 胆石病之间关系报道少见,且未得出确切的关联l5.本研 究显示胆石病组和对照组ApoB基因EcoRI位点E+E一和 E+E+基因型频率构成差异显着,未发现有E—E一基因型 存在;病例组E一等位基因频率显着高于对照组].有研究证 实EcoRI位点多态性与血浆TG,VLDL的水平变化有关, 推测可能影响血脂代谢而有利于结石的形成_1.本研究得 胆石病组LDLc,ApoB水平显着高于对 出E+E+基因型者, 照组(t分别为3.65,2.61,P分别为0.003,0.009),HDLc水 平显着低于对照组(t一2.03,P一0.044);E+E一基因型者 各血脂水平两组差异均无显着性.在胆石病组中E+E一基 因型LDLc水平(2.77mmol/L)高于E+E+基因型者(2. 32mmol/L),接近统计学显着性(f一1.91,P一0.059),其它 各项血脂水平两型之间差异无显着性,提示E一等位基因的 变异影响LDLc代谢,从而有利于胆石的形成. 参考文献: 1沈世鹏,萧蓉葆编着.胆石病[M].人民卫生出版社.2000;32—44. 2RengesHH,WileDB,Mckeigueeta1.Ap0lip0pr0teinBgene polymorphismsareassociatedlipidlevelsinmenofSouthAsia descent[J].Atherosderosis.1991;91:267-275. 3HanT,JiangZ,SuoGeta1.Ap0lip0pr0teinB100geneXbaI polymorphismandcholesterolgallstonedisease[J].Clin—Genet. 2000Apr;57(4):304—308. 4张红军.胆石症的某些分子生物学研究进展[J].国外医学消化系 疾病分册.1998;18(1):33—36. 5AnneTH,BorgeGN,LarsUG.eta1.Variationofapolipoprotein Bgeneisassociatedwithmyocardialinfarctionandlipoprotein levelsinDanes[J].Atherosderosis.1991;89:69—81. 6魏家宾,林琦远.程南生.载脂蛋白B基因多态性与胆囊结石病 关系的研究[J].中华医学遗传学杂志.2001;18(1):66—67. 7PingYe,BaoshengChen,ShiwenWang.Associationof polymorphismsofap0lip0pr0teinBgenewithcoronaryheart diseaseinHanChinese[J].Atherosclerosis.1995;117:43—5O. 8喻荣彬,沈冲,谈永飞,等.载脂蛋白B基因XbaI,EcoRI位点 多态性与胆石病关系的研究[J].中国临床医学.2002;9(3): 608—610. (本文编辑朱立新) ) (上接第264页 后严重肺部感染后和移植后相关性肾功能衰竭的发 生率,又可以预防术后HBV再感染.对于糖皮质激 素,有研究表明肾上腺皮质激素可以直接促进HBV 的复制,其机理是因为HBV基因组中存在糖皮质激 素反应元件,可与激素受体结合,增强HBV基因的 转录水平,病毒复制增强,加速乙肝病毒再感染的进 程[6].对此我们选择术中甲基强的松龙500mg静滴, 术后1个月左右停用强地松;FK5O6与骁悉均于术 后第2,4天开始用,并保持在较低剂量上使用. 综上所述,拉米夫定+HBIG或拉米夫定+阿 德夫韦+HBIG联合应用以及合理的使用免疫抑制 剂,可以成功地防治重型乙型肝炎肝移植后乙型肝 炎病毒的再感染.当然也有报道称5o乙肝患者肝 移植后1O年仍可在体内检测到低水平的HBV DNAL7],所以如何能使患者真正脱离HBV的威胁 仍将成为今后需要解决的问题. 参考文献: 1茹素娟.暴发性肝功能衰竭的原位肝移植[J].国外医学消化系统 分册,1995,15:212—214. 2中华医学会传染病与寄生虫分会,肝病学分会联合修订.病毒性 肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志.2000,8(6):324—329. 3SamuelD.FerayC,BismuthH.Hepatitisvirusesandliver transplantati0n[J].JGastroHepat,1997,12(Supp1):335—341. 4MarzanoA.SalizzoniM.Debernardi—VenonW.Preventionof hepatitisBvirusrecurrenceafterlivertransplantati0nincirrhotic patientstreatedwithlamivudineandpassiveimmunoprophylaxis [J].JHepato1.2001Jun;34(6):903—10. 5RosenauJ.BahrMJ,TillmannHL.Lamivudineandlow—dose hepatitisBimmuneglobulinforprophylaxisofhepatitisB reinfectionafterlivertransplantati0npossibleroleofmutationsin theYMDDmotifpriortotransplantati0nasariskfactorfor reinfection[J].JHepato1.2001Jun;34(6):895—902. 6SuzukiH,SataM.SasakiM.eta1.Mutationsofglucocorticoid responsiveelementofHBVDNA[J].KurumeMedJ.1998.45: 171—174. 7SamuelD.Livertransplantati0nandhepatitisBvirusinfection: thesituationseemstobeundercontrol,butthevirusisstillthere [J].JHepato1.2001,34(6):943—945. (本文编辑耿小平)