白芍总苷和当归提取物对离体肝细胞凋亡的保护作用【文库论文】

白芍总苷和当归提取物对离体肝细胞凋亡的保护作用【文库论文】 白芍总苷和当归提取物对离体肝细胞凋亡的保护 作用 ====================================================================== 作者:陈象青 谢军 方焱 张善堂 刘圣 【摘要】 目的观察白芍总苷和当归提取物合用对离体肝细胞凋亡的保护作用。方法采用甲醛诱导小鼠离体肝细胞凋亡。 结果白芍总苷和当归提取物合用可抑制小鼠肝细胞凋亡。 结论白芍总苷和当归提取物合用对小鼠离体肝细胞凋亡有一定的保护作用。 【关键词】 白芍总苷 当归提取物 甲醛 凋亡 Abstract:ObjectiveTo study the protective effects of total glucosides of Paeony and extract from Angelica sinensis on hepatocyte apoptosis. MethodsHepatocyte apoptosis of mice was induced by Hcho.ResultsTGP and EAS could inhibit hepatocyte apoptosis of mice in vitro.ConclusionTGP and EAs have a protective effect on the hepatocyte apoptosis. Key words:Total glucosides of paeony; Extract from Angelica sinensis; Hcho; Apoptosis 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)引起的一种严重的世界范围内危害人类健康的疾病，HBV持续感染会导致肝硬化和原发性肝细胞肝癌等肝脏疾病，死亡率很高。WTO已把乙肝列为世界第九死因，寻找安全有效的抗HBV药物已成为当今医药学界一项迫切任务。由于中药治疗能有效地改善症状体征，副作用少，医疗费用较低，使用方便，因而是目前治疗乙肝患者及无症状病毒携带者的主要方法之一。有研究表明，病毒性肝炎的发病机制与肝细胞凋亡密切相关,1，2,，目前认为,病毒感染后,产生肝细胞凋亡的机制可能有以下几个方面:?CTL可通过Fas/FasL及穿孔素/端粒酶B途径引起肝细胞凋亡。暴发性肝衰竭早期, CTL的这种作用,使肝细胞大量凋亡,继而出现肝细胞坏死,肝功能衰竭。?亚急性和慢性重型肝炎时,一些肝细胞增殖抑制因子分泌升高,如TGFβ、TNF-α等对增殖的肝细胞也有很强的诱导凋亡作用,肝细胞的大量凋亡可能是肝再生不良的重要原因之一。?实验性暴发性肝衰竭中,乙肝病毒抗原特异性CTL同乙肝病毒转基因小鼠肝细胞作用,可引起大量肝细胞迅速凋亡。因此，本人拟通过对小鼠离体肝细胞凋亡保护作用的研究，寻找安全有效的抗HBV中药。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 白芍总苷(TGP)由安徽医科大学馈赠;当归提取物(EAS)由大东方药业有限责任公司提取，批号:20040816，每克相当于生药 5.9 g，比重为1.30;云芝多糖由南京同仁堂药业有限责任公司馈赠，批号:050124;甲醛由蚌埠生化试剂厂出品，批号:050407;Coulter DNA-Prep Reagents Kit 试剂盒(DNA-Prep LPR固定液、 DNA-Prep stain染料)为法国库尔特公司产品。 1.2 仪器自动平衡微型离心机(北京医用离心机厂); Coulter-XL/EPICS型流式细胞仪(美国贝克曼公司)。 1.3 动物昆明种小鼠，雄性，4周龄，安徽省医学研究所动物科提供，合格证:皖医实动准字第01号。 1.4 甲醛致小鼠离体肝细胞凋亡模型的制备选用4周龄的昆明系雄性小鼠，脱颈椎处死后，取2 mm×2 mm×1 mm左右小块肝左叶组织，加5 ml NS，在 上研磨，并不断过滤，吹打成单细胞，4 000 r/min离心5 min，弃200目滤网 去上清液，残液振匀，取10 μl细胞液，加5ml 1%甲醛，2,4?冷藏15 min，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液分别加5 ml NS清洗，离心，去上清液，各管均洗2次，弃去上清液，残液加50 μl DNA-Prep LPR固定液，振荡，加450 μl DNA-Prep stain染料，避光30 min，用流式细胞仪检测,3，4,，并与加5 ml NS组比较。 1.5 TGP+EAS 预防治疗甲醛诱导的肝细胞凋亡用药取4周龄的昆明系雄性健康小鼠24只，随机分为4组:?正常对照组，?模型组，?TGP+EAS组，?云芝多糖组，每组6只。??组每天ig相应药物，容积为0.2 ml/10 g体质量，??组每天ig给予等容量NS，连续7d，第7天给药前禁食(自由饮水)12 h，给药2 h后，脱颈椎处死动物。各取2 mm×2 mm×1 mm左右小块肝左叶组织，加5 ml NS，在200目滤网上研磨，并不断过滤，吹打成单细胞，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液振匀，取10 μl细胞液，?组加5 ml NS，???组各加5 ml 1%甲醛，2,4?冷藏15 min，4000 r/min离心5 min，弃去上清液，残液分别加5 ml NS清洗，离心，去上清液，各管均洗2次，弃去上清液，残液加50 μl DNA-Prep LPR固定液，振荡，加450 μl DNA-Prep stain染料，避光30 min，用流式细胞仪检测。 2 结果 2.1 对1%甲醛诱导的小鼠肝细胞凋亡的保护作用由于甲醛是作用强烈的凋亡诱导剂，模型组肝细胞凋亡率达到77.1%，由于EAS+TGP和阳性药物(云芝多糖)的保护作用，这两组的肝细胞凋亡率分别为46.8%和48.4%。结果见表1及图1,4。 表1 1%甲醛对各组离体肝细胞周期和凋亡的影响(略) 图1 正常组(略) 图2 模型组(略) 图3 药物组(略) 图4 阳性对照组(略) 讨论 3 本研究首先根据Coulter 公司提供的资料，将离体小鼠肝细胞置于3%甲醛中，冷藏30 min，诱导其凋亡，但发现作用过于强烈，凋亡(或坏死)几乎达到100%，便加以改进，采用1%甲醛，冷藏15 min，由表1及图1,4可发现模型组肝细胞凋亡率为77%左右，而TGP+EAS组和阳性药物(云芝多糖)组肝细胞凋亡率明显下降(46.8%，48.4%)，同时G1 期所占比例由模型组的17.6%上升到38.7%，36.1%，G2 /M期所占比例由模型组的5.3%上升到12.3%，11.9%，说明TGP和EAS合用对离体小鼠肝细胞凋亡有一定的保护作用。 很多研究表明肝细胞凋亡是肝脏疾病病理变化过程中的普遍现象，研究肝细胞凋亡对于预防和治疗肝脏疾病极为重要，细胞凋亡过程中具有其独特和复杂的生物化学和分子生物学机制，氧自由基、核酸内切酶以及调控基因均参与细胞凋亡，寻求抗细胞凋亡的药物已受到国内外学者的关注。 近年来，随着天然药物研究热的兴起，关于中医药治疗肝炎的研究越来越多,5,7,，同时有研究表明:病毒性肝炎的发病机制与肝细胞凋亡密切相关，对肝细胞凋亡在病毒感染时肝脏病理生理变化过程中的地位,有人认为,首先肝内浸润的CTL识别被HBV感染的肝细胞,并诱导其凋亡;其次,由活化的CTL产生干扰素等使巨噬细胞在局部组织聚集,并吞噬凋亡细胞;然后γ干扰素、活化巨噬细胞及其产生的细胞因子(如TNF-α等)引起局部炎症和微循环障碍,进一步导致肝细胞广泛坏死。这种假设合理解释了肝细胞凋亡和肝脏炎症反应之间的关系及两者在肝炎病理变化中的作用,并得到动物实验的支持。凋亡失调在许多肝病的病理过程中起关键作用，凋亡增强可促进肝细胞死亡而致肝病，药物抑制凋亡可能减轻肝损害和促进组织再生，因此，有关中药或其有效成分对肝细胞凋亡影响的研究也逐渐增多,8，9,，如王福永等,10,发现丹参有抑制大鼠缺血-再灌注肝细胞凋亡作用，谭春雨等,11,发现扶正化淤方对DMN肝纤维化大鼠肝细胞有保护作用，可促进受损伤肝细胞的修复,减少肝细胞凋亡。虽然这些研究还有待于进一步深入，但它们为中医药治疗乙肝的研究提供了新的方法和思路。本实验拟通过白芍总苷和当归提取物合用对肝细胞凋亡保护作用的初步研究，可为下一步中药治疗肝炎的开发研究提供借鉴。 【参考文献】 ,1, Patel T, Gores GJ. Apoptosis and hepatobiliary disease ,J,. Hepatology, 1995;21:1725. ,2, Lemasters JJ. The mitochondrial permeability transition from biochemical curiosity to pathophysiological mechanism ,J,.Gastroenterology,1998,115,783. ,3, 姜泊,张亚历,周殿文.分子生物学常用实验方法,M,.北京:人民军医出版社,1996:177. ,4, 刘鼎新,吕证宝.细胞生物学研究方法与技术,M,.北京:北京医科大学?中国协和医科大学联合出版社,1990:140. ,5, 周清荣，张园海，申悦平(苦参素治疗慢性乙型肝炎32例,J,.中西医结合肝病杂志，2003，13(3)?50. ,6, 李季惠(疏肝健脾方治疗慢性乙型肝炎临床观察,J,.北京中医,2001，20(4):7. 7, 乐恩施，边 壮(清热利湿法在慢性乙型肝炎中的治疗作用,J,.天 , 津中医，2002，19(1)?24. ,8, 胡 聪，胡 彬. 中药复方及有效成分对肝细胞凋亡的影响,J,.中医药学报，2001，29(1)?24. ,9, 聂 广. 中药对肝脏细胞凋亡影响的研究,J,.中国中西医结合消化杂志报，2001，9(4)?249. ,10, 王福永,孙克勤(丹参对大鼠缺血-再灌注肝细胞凋亡及bcl-2表达的影响,J,.中华名医论坛，2005，(1)?38. ,11, 谭春雨,谭善忠,蒋 健,等(扶正化淤方对DMN肝纤维化模型鼠肝细胞凋亡的影响,J,.上海中医药杂志，2005，39(1)?47.