手机辐射对小鼠学习记忆的影响

手机辐射对小鼠学习记忆的影响 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 宋欣阳 谭丽 王令 杨中堂 指导老师：金国琴教授 （上海中医药大学02中医七、中西七、针推英七专业，201203） ：探索手机辐射是否对小鼠学习记忆能力造成不良影响。 雄性昆明种小鼠40只，随机分设4个实验小组：（1）青年对照组，5月龄；（2）青年辐射组，5月龄；（3）老年对照组，10月龄；（4）老年辐射组，10月龄。造模条件如下：将（2）和（4）实验小鼠置于手机机站环境下饲养接受辐射刺激， 同时用两部确有辐射的手机置于鼠群中，每天对打5小时，以加强对小鼠的辐射 刺激，连续50天；（1）和（3）两组对照小鼠置于无辐射环境下饲养。采用Morris水迷宫测试各组小鼠空间学习记忆能力，分光光度法测定各组小鼠颞叶与海马区 的乙酰胆碱酯酶（AchE）活性变化，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法观察各组小鼠脑组织蛋白表达变化，光学显微镜下观察各组小鼠颞叶与海马区细胞形 态结构变化，。 ：与青年对照组比较,老年对照组小鼠水迷宫潜伏期延长； 脑部海马和颞叶区AchE活性均明显增高；脑组织大分子蛋白（60KD,90KD）和中分子蛋白(25KD,40KD)表达呈降低趋势；颞叶脑细胞数量略减少，海马区细胞层次 清晰，细胞数略微减少；青年辐射组小鼠水迷宫潜伏期无明显差异；脑部海马区 AchE活性较高，颞叶区AchE活性呈增高趋势，但无统计学意义；青年辐射组小鼠 脑组织大分子蛋白（60KD,90KD）和中分子蛋白(25KD,40KD)的含量均较青年对照组小鼠有降低趋势，而小分子蛋白(14KD,20KD)表达呈增高趋势；颞叶脑细胞不但 体积缩小，还发现有细胞损伤，海马区细胞层次紊乱，有萎缩现象，数量减少。 与老年对照组比较：老年辐射组小鼠水迷宫潜伏期缩短，脑部海马和颞叶区AchE活性均明显降低，大分子蛋白（60KD,90KD）和中分子蛋白(25KD,40KD)的表达均呈现下降趋势，小分子蛋白(14KD,20KD)表达组间变化不明显；颞叶脑细胞没有发 6 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 现明显病灶，但海马区细胞层次呈现紊乱和细胞体积缩小、数量减少。 随着个体衰老，学习记忆能力下下降。手机辐射对青年小鼠学习记忆能力可能产 生不良影响，对老年小鼠学习记忆能力的影响不大，甚至可能造成正面影响。 手机辐射；小鼠；学习记忆；海马；颞叶；AchE；脑细胞形态结构 目前我国的移动电话用户已逾1.8亿，根据美国权威预测机构Strategy Analysis预测到2006年底全球手机用户可达19亿人，可以说手机已与我们每个人的日常 生活息息相关。移动电话电磁辐射是否会影响人体健康已成为世界卫生组织和各 国政府关注的热点问。世界移动通信论坛秘书长麦克先生指出：过去二十多年 中，全世界关于手机辐射对人体健康影响的实验共有289项，但没有一项证实手机辐射对人体到底有害还是无害。 在国外有很多研究结果是相互矛盾的：如意大利波伦亚国家科研理事会理事菲奥 伦佐?马里内利教授领导的科研小组，所做的一项实验表明：手机辐射可助长肿 瘤细胞生长。然而据新华网报道，美国华盛顿大学 2002 年6月25日公布的一项实验报告表示：手机长期辐射一般不会使老鼠患上癌症。这一实验报告提示人在 使用手机时基本上是安全的。 在国内也有同样的矛盾现象存在：浙江大学有实验报道手机微波辐射对中枢神经 系统有影响 [1] ，微波辐射对完整颅骨大鼠的神经细胞凋亡状态未产生明显影响， [2]而在去颅骨大鼠中则促进了细胞凋亡的发生。武汉大学有学者研究提出手机电 [3]磁辐射对小鼠产生自由基的不良影响；还有一些案例和实验结果已表明，手机 辐射对人体产生的有害影响,可能会引起神经、心血管、免疫系统、生殖系统及眼 [4、5]睛等的病理改变。同时也有一些实验结果显示，手机辐射对人体并无有害影响， 或影响很小。例如，有实验研究观察不同手机对鼠脑的电磁影响，结果仅有一只 老鼠的额叶和颞叶皮层内的ＥＢ密度过度增大,另仅有一只老鼠的大脑着色极少 7 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） (即ＥＢ密度极低)。其他的老鼠未见变化。得出的结论是该实验不能证实手机对 [6]人体有害。还有实验表明，在强辐照条件下(2450ＭＨｚ),微波可使脑中自由基 产生过量，进而参与脑损伤;而在手机弱辐照条件下(870、450、45ＭＨｚ),微波 [7]辐照对脑基本无损伤,手机使用是安全的。还有学者采用Meta analysis,对现有文献进行系统、定性、定量、客观和全面的综合评价,以期探询手机电磁辐射与脑肿瘤之间是否存在直接或间接关系，得出结论是：就现有资料不支持手机 [8]电磁辐射致脑肿瘤，该观点与世界卫生组织近期公布的结论基本一致。 究竟事实是怎样的？我们希望能通过自己的实验加以探索、验证！但作为学生， 我们更想知道手机辐射对于学生学习生活密切相关的学习记忆是否有不良影响。 如果确有一定影响，可以敦促生产商对手机作进一步改进，同时对广大用户提出 一定的防护建议。 业已证实，对学习记忆能力减退机制影响较大的有：(1)学习记忆相关脑分区突触 的形态学改变；(2)中枢胆碱能系统、单胺类神经递质和兴奋性氨基酸递质等的变 化；(3)长时程突触后电位增强（LTP）变化等。目前，国内外对手机辐射影响的 机制研究主要以微波辐射研究动物的环磷酸腺苷（cAMP）、儿茶酚胺类（CAs）、超氧化物歧化酶（SOD）、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮合酶(NOS)、垂体内亮脑啡肽（L-ENK）等变化指标为主。在对与学习记忆有关 的神经递质方面多以乙酰胆碱(Ach)、乙酰胆碱酯酶(AchE) 、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺类（DA）等为主。水迷宫试验测定大、小鼠空间记忆 能力则是国内外比较公认的行为学指标。 本实验在综合各方面研究报道基础上，结合实际研究条件，主要以小鼠为研究对 象，给予一定强度的手机辐射源刺激，从与学习记忆关系密切的大脑颞叶与海马 区细胞形态结构变化、相关脑区乙酰胆碱酯酶活性变化、蛋白电泳图谱和水迷宫 实验等为主要测试指标，观察手机辐射对小鼠学习记忆的影响。为进一步评价手 机辐射是否会影响学习记忆提供部分科学的实验依据。 8 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 2.1材料 2.1.1实验动物 雄性昆明种小鼠40只，清洁级，5月龄20只，和10月龄20只，购于上海中医药大学实验动物中心。 2.1.2主要试剂 乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒： 购于南京建成生物工程研究所 SDS－PAGE所需的主要试剂: 购于北京鼎国生物技术发展中心 2.1.3 SDS－PAGE所需的主要试剂 RIPA： Nacl (0.88g), NP-40（1ml），10％SDS（1ml），1MTris（PH7.2 5ml），0.5MEDTA（PH8.0 1ml），加ddH 5×LB： O至100ml 2 2MTris（PH6.8 1.56ml），SDS（1g），丙三醇（5ml），二 硫苏糖醇（0.12g），巯基乙醇（2.5ml），溴酚蓝（1mg）， 分离胶： 2.1.4主要仪器 定容至10ml 手机两部： ddH SRM3000电磁选频仪： O（5.2ml），10％SDS（0.1ml），3MTris（PH8.8 1.25ml），2 MORRIS水迷宫： 40％Acrylaimide（2.84ml），10％APS（75ul），TEMED堆积胶: 5417R低温高速离心机： （5-10ul） 超低温冰箱： ddH O（4.1ml），10％SDS（0.05ml），2MTris（PH6.8 0.31ml），2 电泳缓冲液: UV754N分光光度计： 40％Acrylaimide（0.47ml），10％APS（75ul），TEMED BIO—RAD电泳仪： （5-10ul） 脱色液: JA2003电子分析天平： Tris（12.11g），Glycine（57.6g），SDS（4g），加ddHO2 至4L 无水乙醇（50ml）冰醋酸（50ml），加水至500ml FJ—200高速分散均质机，GNP—9270隔水式恒温培养箱，HZS—H水浴振荡器， 9 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） DK—522电热恒温水浴锅，LXJ—?离心沉淀机，TDL—60B离心机，TS—1脱色摇床， WH—861漩涡混合器，生物沉淀图像分析系统，等。 2.2方法 2.2.1动物分组及造模 2.2.1.1动物分组 随机分为4组：（1）青年对照组10只 （2）青年辐射组10只 （3）老年对照组10只 （4）老年辐射组10只 2.2.1.2造模方法： 4组小鼠分养于4个鼠笼中，都置于我校图书馆楼顶饲养。（2）和（4）两组实验小鼠安置在有手机辐射的（已测值为3）位置，对照组(1)和（3）安置在无辐射处（已测值为0）饲养。每天给予各组小鼠相同的饲料和水，对辐射组小鼠每天 另给予加强手机辐射5小时，加强辐射采用两只手机置于鼠笼内相互打，连续50天，造模结束。 2.2.2 Morris水迷宫测试各组小鼠学习记忆能力 2.2.2.1 Morris水迷宫装置 水迷宫由一个直径为130cm，高50cm的圆形水池组成.池壁由灰色塑料板组成，板厚3mm，池内水深30cm，水温保持26士l?，水中均匀悬浮大小相似的墨汁颗 粒。池壁上标有东南西北等多个入水点，它们将水池等分为四个象限，分别称SW、MW、SE及NE象限，在SW象限正中离池壁33cm处放一个直径为14.3cm，高29cm的圆形透明平台，其顶端连接显示系统。训练期保持环境安静，训练程序为 定位航行试验(place navigation): 记录小鼠找到平台所需时间（潜伏期，单位： 秒），用于评价小鼠学习记忆能力。 2.2.2.2小鼠定位航行试验——潜伏期测定 实验前一天晚上，让小鼠熟悉水迷宫环境，然后统一编号。之后每天分上、下午 两段，每段训练1次，训练时操作者选择两个入水点（距离平台的两个直角顶点）， 将小鼠面向池壁放入水中，观察并记录小鼠寻找并爬上平台所需的时间，取两次 平均值，记为潜伏期（秒）。小鼠在70秒内找到平台，并停留10秒记为找到平台 10 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 的时间；在70秒内找不到平台，则将其引至平台并停留10秒记为70秒。Morris水迷宫连续测试4天，数据（潜伏期，秒）由电脑相应软件自动采集、记录。 2.2.3取材 Morris水迷宫测试结束后，杀小鼠取材。收集血液, 及各组织样品，包括：海马、 颞叶、剩余脑组织等。每组中抽取3只小鼠取同侧海马和颞叶各一个，置于甲醛 液中固定待光镜检测。将血液3500rpm/ min离心,收集上层血清，4?保存备用。其他样品放置在-70?的冰箱中保存待测。 2.2.4分光光度法测定各组小鼠大脑颞叶和海马区的乙酰胆碱酯酶活性 2.2.4.1样品处理 将各组小鼠海马、颞叶称重，以1：9的比例加入生理盐水，冰浴下超声匀浆，于 4?3500转/分，离心10分钟，取上清液待测。 2.2.4.2试剂的配制 按照乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书中的加样量，计算每种试剂的需要量，按要求配 制：应用液、底物缓冲液、显色应用液、抑制剂、透明剂、稳定剂。 2.2.4.3酶反应体系及条件 样本上清液（ml） 0.05 1umol/ml标准应用液（ml） 0.05 蒸馏水（ml） 0.05 底物缓冲液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 显色应用液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，37?准 确反应 6 分 钟 抑制剂（ml） 0.03 0.03 0.03 0.03 透明剂（ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 稳定剂（ml） 0.05 0.05 0.05 0.05 样本上清液（ml） 0.05 11 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 混匀，放置15分钟，采用0.5cm光径比色杯，蒸馏水调零，于412nm处测定各管吸光度。计算公式如下： 测定管吸光值 － 对照管吸光值 × 标准品浓度（1umol/ml）?蛋白含量（mg.pr/ml）标准管吸光值 － 空白管吸光值 2.2.4.4考马斯亮蓝法测定脑匀浆上清液蛋白含量 1ml蒸馏水+5ml考马斯亮蓝；1ml样品稀释液+5ml考马斯亮蓝；混匀，放置5分钟，1cm口径比色杯，于595nm处比色测定吸光度，对照蛋白标准曲线，乘以稀 释倍数算出各样品蛋白含量（mgpr/ml）。 2.2.5 SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳观察各组小鼠脑组织蛋白表达谱变化[9、10] 2.2.5.1样品预处理1 分别取各小鼠剩余脑组织100mg, 加入RIPA900ul, 冰浴下充分超声匀浆，于4? 10000转/分，离心10分钟，取上清液备用。 2.2.5.2考马斯亮蓝法测蛋白含量 同1.2.4.4 。 2.2.5.3电泳准备 试剂的配制安装电泳装置配分离胶，灌胶约3/5的体积蒸馏水液封 待凝后倾去液体配堆积胶，灌满至顶部插入梳子，待凝取胶， 装入电泳仪加入电泳液 2.2.5.4样品预处理2 按所测蛋白含量结果，确定需取蛋白值（20ug），计算各管加样品量和加入RIPA 量，按顺序加入样品（计算量）、RIPA（计算量）、LB5ul，与Mark一起95?水浴 5分钟。 2.2.5.5电泳 按指定顺序各泳道加入样品液及mark接好电源，80V电泳30min 加压 至160V电泳当指示剂接近底部时停止电泳取出胶，染色约2h脱 色至条带清晰 12 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 2.2.5.6处理 用生物沉淀图像分析系统分析四块凝胶上的各泳道蛋白表达度，取大、中、小三 段分子量约为60-90KD、25-40KD和14-20KD的蛋白以百分比值（％）比较四组小 鼠脑组织蛋白表达变化情况。 2.2.6光学显微镜观察各组小鼠大脑颞叶和海马区的形态结构变化 将甲醛液中固定的样品，交于病理教研室庞慧芳老师做病理切片观察。 2.2.7资料统计分析方法 数据采用单因素方差分析，应用SPSS11.0在计算机上进行统计处理，并进行组间 比较。 3.1定位航行试验——潜伏期变化 由表1和图1显示，在历时3天半的7次训练中，四组小鼠潜伏期的变化：各组 小鼠随训练次数的增多，潜伏期呈逐渐下降趋势，表明小鼠能学会找到平台。但 是潜伏期没有趋于稳定，1、3、5、7（四个下午）小鼠成绩普遍高于相邻的2、4、 6（三个上午），尤其是第7次，结果除了青年对照组，其它三组都有大幅度地反 弹。据水迷宫实验经验丰富的老师说，不少小鼠是有上午成绩比下午成绩好的现 象，可能和小鼠的生活习性，一天中的身体状态，外界环境的影响以及连续训练 造成的疲惫等原因有关。与青年对照组比较，青年辐射组无明显差异，老年对照 组小鼠潜伏期有延长趋势，较青年鼠略笨；与老年对照组相比，老年辐射组小鼠 潜伏期有缩短趋势，较老年鼠略聪明，但各组间均无统计学意义(P>0.05)。由于小鼠的个体差异，实验例数有限，以及水迷宫训练时间仓促、有限，上述结果有 待于进一步实验验证。 13 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 第一次 第二次 第三次 组别 n （第一天/A.M） （第二天/A.M） （第二天/P.M） 青年对照组 8 48.91?16.17 46.77?18.29 49.01?14.58 青年辐射组 7 58.03?14.22 44.74?16.68 42.24?14.00 老年对照组 9 58.16?16.77 51.01?19.90 53.48?21..33 老年辐射组 6 58.51?12.60 43.95?17.66 47.21? 7.86 第四次 第五次 第六次 第七次 组别 n (第三天/A.M) (第三天/P.M) (第四天/A.M) (第四天/P.M) 青年对照组 8 37.29?15.36 36.54?15.24 39.76?12.66 36.78?16.00 青年辐射组 7 43.56?13.78 37.50?15.86 28.51? 9.17 43.53?12.91 老年对照组 9 49.80?25.04 41.53?22.17 36.87?19.26 50.59?18.90 老年辐射组 6 34.75?18.10 31.21?11.74 29.20?13.87 37.22 14 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） ?19.67 60 55 50青年对照组 45青年辐射组 老年对照组40 老年辐射组 35 30 25 1234567 3.2乙酰胆碱酯酶活性测定——比活性变化 3.2.1各组小鼠颞叶乙酰胆碱酯酶活性 由表2-1、图2-1可见，与青年对照组比较, 青年辐射组小鼠颞叶乙酰胆碱酯酶活性有增高趋势(Ｐ＞0.05)，而老年对照组小鼠颞叶中乙酰胆碱酯酶活性则明显 増高(Ｐ<0.025)，提示老年对照组小鼠大脑颞叶区乙酰胆碱分解速度比青年对照 组小鼠高; 与老年对照组比较, 老年辐射组小鼠颞叶中乙酰胆碱酯酶活性显著下 降(Ｐ<0.05)，提示老年辐射组小鼠大脑颞叶区乙酰胆碱分解速度低于老年对照组 小鼠。 15 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 组别 n AchE(umol/mg.Pr) 青年对照组 8 0.313?0.106 青年辐射组 7 0.344?0.075 老年对照组 9 0.453?0.119 , 老年辐射组 6 0.345?0.094 ? 3.2.2各组小鼠海马中乙酰胆碱酯酶活性 由表2-2、图2-2可见，与青年对照组比较,青年辐射组小鼠海马乙酰胆碱酯酶活 性明显增高 (Ｐ<0.05)，提示青年辐射组小鼠大脑海马区乙酰胆碱分解速度增高； 而老年对照组小鼠海马乙酰胆碱酯酶活性更高 (Ｐ<0.005)，提示老年对照组小鼠大脑海马区乙酰胆碱分解速度相对于青年对照组小鼠增高；与老年对照组比较, 老年辐射组小鼠海马乙酰胆碱酯酶活性显著降低(Ｐ<0.05)，提示老年辐射组小鼠大脑海马区乙酰胆碱分解速度下降。 组别 n AchE(umol/ mg.Pr) 青年对照组 7 0.235?0.065 青年辐射组 7 0.325?0.093 , 老年对照组 9 0.426?0.074 , 老年辐射组 6 0.353?0.074 ? 16 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 0.60.6 0.50.5 0.40.4 0.30.30.20.2 0.10.1 00青年对照组 青年辐射组 老年对照组老年辐射组青年对照组 青年辐射组 老年对照组 老年辐射组 3.3各组小鼠脑组织蛋白表达变化分析 由表3、图3-1、3-2 可见，与青年对照组比较,青年辐射组小鼠脑组织大分子蛋白（60KD,90KD）和中分子蛋白(25KD,40KD)的表达有降低趋势，而小分子蛋白 (14KD,20KD) 表达差异不大，提示青年辐射组小鼠脑组织大分子蛋白和中分子蛋 白表达比青年对照组小鼠弱；老年对照组小鼠脑组织大分子和中分子蛋白表达均 较青年对照组小鼠有降低趋势，小分子蛋白(14KD,20KD) 表达差异不大；与老年对照组比较,老年辐射组小鼠脑组织大分子蛋白（60KD,90KD）和中分子蛋白(25KD,40KD)的表达也有降低趋势，小分子蛋白(14KD,20KD)表达差异不大。 但 各组间蛋白表达均无明显统计学意义(P>0.05)。 17 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 组别 例数 大分子蛋白（％） 中等分子蛋白（％） 小分子蛋白（％） 青年对照组 7 26.86?4.53 25.97?5.26 24.51?6.51 青年辐射组 8 24.29?3.93 24.2?6.14 25.39?9.72 老年对照组 7 24.82?2.69 25.20?4.56 24.80?9.28 老年辐射组 6 23.98?7.57 23.01?7.80 24.78?9.23 28 2827272626 2525 2424 2323222221 2120青年对照组青年辐射组老年对照组老年辐射组青年对照组青年辐射组老年对照组老年辐射组 18 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 27 26 25 24 23 22 21 20青年对照组青年辐射组老年对照组老年辐射组 3.4小鼠大脑颞叶和海马区的形态结构 3.4.1各组小鼠颞叶的形态结构变化 由表4-1、图4-1可见，与青年对照组比较，青年辐射组小鼠脑细胞不但体积缩 小，还发现有细胞损伤，提示青年辐射组小鼠脑细胞受到手机辐射的影响，老 年对照组可见皮层细胞数量略微减少，这可能是神经细胞衰退的现象；与老年 对照组比，老年辐射组没有发现明显病灶，提示老年辐射组小鼠脑细胞受到的 手机辐射影响较小。 组 别 光 镜 下 形 态 结 构 青年对照组 正常（脑组织皮层各细胞数量分布密度正常，各细胞 未 见明显变性、坏死、炎症等改变） 青年辐射组 脑组织神经细 胞体积明显缩小，并见一胶质结节（即神经细 胞灶 19 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 性坏死后小胶质细胞增生修复的病灶） 老年对照组 脑组织皮层细胞除数量略微减少外，无明显异常改变 老年辐射组 脑组织皮层各细胞萎缩体积变小，数量少，排列紊乱 A. 青年对照组 B.青年辐射组 C. 老年对照组 D.老年辐射组 图4－1 各组小鼠颞叶形态结构变化的光镜图片 3.4.2各组小鼠海马的形态结构变化 由表4-2、图4-2可见，与青年对照组比较，青年辐射组海马区细胞层次紊乱， 有萎缩现象，数量减少，提示青年辐射组小鼠脑细胞受到手机辐射的影响，老 年对照组海马区细胞层次清晰，细胞数仅有略微减少，这可能是神经细胞衰退 的现象；与老年对照组比，老年辐射组也表现出海马区细胞层次的紊乱和细胞 体积缩小、数量减少，提示老年辐射组小鼠也可能受到手机辐射的一定影响。 组 别 光 镜 下 形 态 结 构 青年对照组 正常（海马组织、各层细胞排列整齐，层次厚度正常） 青年辐射组 各层细胞明显萎缩，层次变 20 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 少，数量少，排列紊乱 老年对照组 各层细胞清晰，排列整齐， 但层次略有减少 老年辐射组 海马区各层细胞显著萎缩体积变小，数量变少，排列紊 乱 A. 青年对照组 B.青年辐射组 C.老年辐射组 图4－1 各组小鼠海马形态结构变化的光镜图片 4.1辐射对小鼠空间学习记忆能力的影响 80年代初英国科学家R.G.Morris，创建了一套行为学测定方法以检测大鼠的空 间定位能力，这套实验装置被称为Morris水迷宫(MWM)。从心理学角度分析，这是一种操作式条件反射，属联合型学习(associative learning)，即在这个反射中，刺激(被放入水池中)与反应(辨认空间物体寻找平台)之间形成了联系，同时在MWM中的大鼠产生的记忆属于陈述性记忆(declarative memory)，依赖于对信息的获得和回忆的意识表达，依赖于评价、比较和推理等认知过程。由 21 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 此可见，MWM实验是测试大鼠学习和记忆(尤其空间记忆)的简便、通用、可靠的方法。 文献报道，24月龄老年大鼠在MWM中学习记忆的能力比青年鼠明显下降， [11]但保持所学得经验的记忆能力维持正常。 本实验结果显示，各实验组小鼠找到平台所需时间（潜伏期）组间没有显著的 具有统计学差异的区别。从总体趋势来看，青年辐射组和青年对照组之间没有 明显差别，至少在我们这次实验中没有看到；老年对照组潜伏期比青年对照组 和青年辐射组小鼠有延长趋势，提示老年对照组小鼠学习记忆能力有逐渐下降 趋势。而老年辐射小鼠潜伏期比老年对照组短，提示本实验中老年小鼠在一定 的手机辐射强度刺激下，可能促进了对记忆的获得和保持，这很有可能成为辐 射不影响老年小鼠学习记忆的证据，当然也可能是由于小鼠的个体差异或其他 原因造成。至于老年辐射组小鼠潜伏期比两组青年组小鼠（对照与辐射）短， 这可能是由于实验误差造成，其原因有待进一步查明。 4.2辐射对小鼠大脑海马和颞叶乙酰胆碱酯酶活性的影响 业已证实，中枢胆碱能系统与学习记忆关系密切,这一领域的研究已积累了大量资料。20世纪70年代初期Deutsch等通过动物实验发现,胆碱能系统与学习、记忆的形成和储存有关,动物注射拟胆碱药物能增进学习、记忆能力,而抗胆碱药物则减弱学习、记忆能力。80年代Bartus等又提出了老年记忆障碍的胆碱能假说。 中枢胆碱能系统被认为是构成学习记忆的重要通路 [12],乙酰胆碱是该系统中重要的神经递质,它是由胆碱乙酰化酶合成,受胆碱酯酶分解,通过乙酰胆碱受体发挥生物学效应。胆碱能神经元的退化和缺失是导致学习和记忆减退的重要病理因素。 由于乙酰胆碱(ACH)性质极不稳定,容易被水解,极难准确测定其含量,而乙酰胆碱 酯酶(AchE)是Ach的降解酶,测定脑组织中AchE的活性,在一定程度上可以反映脑内Ach含量的变化。因此,目前许多研究均以AchE活性作为评价中枢胆碱能神经系统功能状态的重要指标[13]。 文献报道，大、小鼠脑内AChE纤维的分布以海马内最丰富,其次为额叶和颞叶, 顶叶及枕叶内较稀疏; SDAT和MID患者海马和额叶AchE纤维密度均比非痴呆老 22 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） [14]年人明显降低,尤以海马部位更明显。 本实验中Moris水迷宫结果显示, 老年小鼠在自然衰老过程中，学习记忆能力相 比青年对照组小鼠逐渐衰退， 而老年辐射组和老年对照组小鼠海马和颞叶AchE 活性相对于青年对照组都偏高，AchE分解Ach，使Ach含量减少，进而影响小鼠学习记忆能力，这与自然规律相符，除了个别思维活跃长期用脑的老年鼠外，学 习记忆能力的衰退是难以避免的。青年组小鼠还没有脑组织老化的危险，它们正 处于精力充沛的生长时期，所以AchE活性相对均较低。在手机辐射刺激下，青年 辐射组小鼠颞叶区的AchE活性相对偏高，但是没有统计学意义，而海马区的AchE 活性增加，且有统计学意义。所以，我们可以认为：?本实验中给予的手机辐射 刺激强度对脑功能本来就强（正常）的青年小鼠来说可能有一定影响，如果本实 验中青年辐射组小鼠AchE活性高于青年对照组结果成立，提示青年组对照组小鼠 比青年辐射组小鼠聪明。推测在生理机能都正常、脑组织功能良好基础上受到一 定强度的手机辐射刺激，对机体而言为不良刺激，对脑的学习记忆能力可能会产 生一定影响；?也有可能是由于样本例数有限，实验条件、操作技能等方面的客 观和主观因素而造成差异，本结果还需重复实验加以验证。 老年辐射组小鼠颞叶和海马AchE活性比老年对照组明显降低，具有统计学意义， 这一结果让我们很惊喜。因为，这个实验结果与水迷宫行为学实验、以及造模过 程中所观察到的小鼠活跃状况相一致。老年辐射组小鼠似乎比老年对照组小鼠聪 明，学习记忆能力增强。推测可能是因为：?在脑功能逐渐退化进程中，外界刺 激（这里是指有限强度的手机辐射）可以促进脑细胞的活动，或者可以使正在老 化的细胞处于适度兴奋状态，从而有助于提高Ach的含量和释放，提高学习和记忆能力。?从《内经》养生理论中可以看出，老年所带来的衰退变化与人体阳气 旺盛与否密切相关。张景岳先生就有“天之大宝,只此一轮红日; 人之大宝, 只此 一息真阳”的论述。手机主要通过天线向外辐射，这种辐射其本质是能量的传播， 这些微波能量具有很强的穿透力，当它们进入人体器官后，根据能量守恒定律它 不会灭亡，并转换为其它形式的能量，即产生热效应和非热效应。把手机辐射看 作为热刺激，也许有类似于给老年人补阳的效果。手机辐射产生的非热效应可能 23 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 有加快血液循环，促进脑部血流运行和新陈代谢的作用，以流通来弥补部分虚证 的不良后果，为脑部的运转提供有利的生理环境。?老年鼠由于组织器官的老化， 新陈代谢速率减慢，体内热量降低，手机辐射的电磁效应有可能为他们创造了加 速代谢产能的条件。 4.3辐射小鼠脑组织蛋白表达的影响 近年来研究生命活动直接执行体(蛋白质)已成为一个主要的热点，而电泳作为测定生物大分子特性和纯度的主要工具之一，在生化等实验中扮演了重要角色。众 多学者通过电泳：找到异常蛋白，通过蛋白显色加以对比分析，发现新蛋白的表 达等等。电泳技术被广泛应用到各种研究中，如：对脑脊液蛋白、血清蛋白、各 种组织蛋白、病原体蛋白、植物和药物蛋白等的分析研究，而有研究表明神经丝 蛋白的表达与学习记忆功能呈正相关 [15、16、17] 已有不少实验研究辐射是否造成蛋白质水平的变化。有实验证明，低剂量照射可 诱发异常蛋白，解释辐射诱导的蛋白质可能与辐射细胞效应有关，包括辐射细胞 凋亡、辐射细胞周期效应、低剂量辐射诱导的适应性反应和辐射免疫效应，以及 辐射对细胞信息传递的影响等[18]。也有实验研究和人体的观察资料证明，低剂量辐射作用于哺乳动物和人体可诱导作出适应性反应，增强免疫功能，提高抗癌能 ［19］力。 本实验结果显示，各实验组小鼠脑组织蛋白表达组间没有显著的具有统计学意义 的区别。但从总体趋势来看，老年对照组小鼠大、中两类分子量的蛋白质表达比 青年对照组小鼠含量均有降低趋势，初步判断学习记忆能力与其中某些蛋白表达 可能呈正相关；而青、老年辐射组小鼠脑组织大分子和中分子蛋白的表达均相对 于青、老年对照组有降低趋势，小分子蛋白表达各组间差异不大。这很有可能说 明手机辐射这一外部刺激，对小鼠脑组织蛋白表达可能产生一些影响，使青、老 年辐射组小鼠蛋白表达呈现下降或减弱。究竟何种蛋白表达受手机辐射影响最 大？其与学习记忆的关系如何？需进一步查阅相关文献资料及配合其他实验技术 加以证实。 4.4辐射对小鼠海马、颞叶形态结构的影响 24 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 业已证实，脑功能衰退、学习记忆功能下降的同时，脑组织形态学方面也常常发 生诸多变化，改变可通过：?神经元减少,凋亡细胞增多；?突触密度标志物—— 突触泡膜素减少,参与神经纤维缠结形成的神经元——Tau蛋白却合成增多；?海马神经元标记物、突触后致密物质(PSD)及神经元细胞骨架的组成成分——低分子 量神经丝蛋白(NFL)在脑功能衰退时表达下降；?脑功能衰退时,参与陈旧性记忆的乳头体可有明显的超微结构改变：神经元细胞皱缩,核膜扭曲变形,线粒体平均密度减少、变性甚至空泡化,高尔基复合体扩张,粗面内质网扩张并脱颗粒,脂褐素明显增多等。[20、21、22]可见，对细胞形态学变化的研究已成为证明组织有无损伤的 重要手段之一。脑组织和神经细胞形态学变化，有人认为是内外环境因素作用于 神经元,引起神经细胞凋亡的结果：老年小鼠海马神经细胞凋亡增多,bcl 2表达 [23] 下调,Bax表达增加。 但是从细胞形态结构改变方面，研究辐射对脑功能的影响实验还比较少。本次实 验仅以探索为目的。 本实验结果显示，与青年对照组比较，青年辐射组颞叶脑细胞不但体积缩小，还 发现有细胞损伤，海马区细胞层次紊乱，有萎缩现象，数量减少，老年对照组仅 见颞叶脑细胞数量略微减少，海马区细胞层次清晰，细胞数仅有略微减少；与老 年对照组比，老年辐射组颞叶脑细胞没有明显病灶，但海马区细胞层次的紊乱和 细胞体积缩小数量减少。这一结果提示，作为内部因素的机体衰老，脑功能的衰 退，可以造成小鼠大脑颞叶区和海马区细胞水平的变化；作为外部因素的一定强 度的手机辐射刺激，也有可能造成小鼠大脑颞叶区和海马区细胞水平的变化。其 损伤程度和损伤具体部位对小鼠生理功能的影响程度还有待进一步探索。 总而言之，本实验中，我们对与学习记忆能力密切相关的四个不同方面的指标进 行了初步探索，初步看出手机辐射对青年小鼠来说可能有较大影响；而对老年小 鼠来说产生的影响可能不大，甚至可能带来正面影响。?有关报道显示：手机辐 射可以影响小鼠精子形态和功能 [24、25]，手机辐射睾丸，可引起初级精母细胞、早 期和晚期精子细胞形态学异常；对胚胎、胎儿生长的发育有影响，但不一定至畸 [26]，胚胎、胎儿期是细胞分裂、分化和功能形成的关键时期，对环境因素的干扰 25 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 较为敏感，手机辐射对其造成的影响，将较少引起遗传学上的变化；而手机辐射 对年轻的大、小鼠或者人的影响要通过机体的免疫、体液等方面的屏障，才能产 生效果，所以相对而言所受影响较轻；老年大、小鼠或者老年人对环境因素的干 扰敏感性较差，手机辐射可能在遭到机体抵抗的同时，调动了某些已经衰退机能。 与现在研究结果相结合，手机辐射对机体健康的危害可能存在着不同年龄段有不 同的影响。?传统中医理论认为“心为君主之官,主神明”，与学习记忆密切相关，如《灵枢. 本神》篇记载“任物者谓之心, 心有所忆谓之意。” 而影响心神的主要因素是火，因为心在五行中属火，在生理情况下火是人体正常运转的动力，正 如朱丹溪先生认为的“天非此火不能生物，人非此火不能有生”；在病理情况下， 火性炎上，可扰动心神，如《内经》病机十九条中就有“诸禁鼓栗，如丧神守， 皆属于火” “诸躁狂越,皆属于火”的论述。火有内外之分，存在于人体外部的 六气之火为外火，而源于人体内部之气的火，是促进人体生长、发育的内在动力， 为内火。当内火亢盛，加之外火侵袭，就会使人感而发病。报道认为手机辐射对 人体的作用机制之一是其具有致热效应 [33],按中医观念属于“外火”；年青组小鼠 的“内火”要较年长组小鼠相对亢盛，所以火邪为病，扰动心神，从而对学习记 忆的影响的可能性和程度要高于年长组小鼠。而老年年长组小鼠的生理功能正在 减退，“内火”虚衰，这时“外火”对其的影响不能达到火邪致病的程度，甚至可 能在一定程度上弥补了因“内火”不足所导致的身体机能衰退的症状。 5结 论 本实验采用手机辐射青年和老年小鼠制作动物模型，同时设立相应对照组，主要 采用Morris水迷宫行为测试、生化指标胆碱脂酶活性检测、脑分区－海马和颞叶 组织形态结构观察，研究手机辐射对青、老年小鼠学习记忆能力的影响。 结果发现： 1）与青年对照组比较，老年对照组小鼠水迷宫潜伏期延长；脑部海马和颞叶中 AchE活性均较高；脑组织大分子蛋白（60－90KD）和中分子蛋白（25－40KD）的 表达均有降低趋势；颞叶脑细胞数量略微减少，海马区细胞层次清晰，细胞数仅 有略微减少。 26 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 2）与青年对照组比较，青年辐射组小鼠水迷宫潜伏期无明显差别；脑部海马中 AchE活性较高，颞叶中AchE活性有增高趋势，但无统计学意义；脑组织中大分 子蛋白（60－90KD）和中分子蛋白（60－90KD）的表达均呈下降趋势，小分子蛋 白表达呈增高趋势；颞叶脑细胞不但体积缩小，还发现有细胞损伤，海马区细胞 层次紊乱，有萎缩现象，数量减少。 3）与老年对照组比较，老年辐射组小鼠水迷潜伏期缩短；脑部海马和颞叶中AchE含量均明显降低；大分子蛋白（60－90KD）和中分子蛋白（60－90KD）的表达有下降趋势，小分子蛋白表达无明显变化；颞叶脑细胞没有发现明显病灶，但海马 区细胞层次的紊乱和细胞体积缩小数量减少 以上实验结果表明： 1）随着个体衰老，多种以机体内部因素为主的原因导致小鼠脑功能衰退，学习记 忆能力下降。 2）手机辐射对青年小鼠的学习记忆能力可能产生不良影响。 3）手机辐射对老年小鼠学习记忆能力的影响不大，甚至可能造成正面影响。 1 杨小锋， 高峰.手机微波辐射对中枢神经系统的作用.浙江创伤外科，2003，8（1）： 69-70 2 刘伟国， 杨小锋， 朱永坚，等.手机微波辐射对去颅骨大鼠神经细胞凋亡的影 响. 浙江创伤外科 ，2003，8(1)：4—7 3 史锡腾， 张华军.手机电磁辐射对小鼠自由基影响的研究.微循环学杂志，2003，13(3)：17-18 4 张中启，罗质璞.学习记忆的胆碱能机制与去甲肾上腺素能和5－羟色胺能介质系统的关系.中国药理学通报，1994，10（2）：81-83 5 曹兆进，张洪桥，徐培基，等. 微波辐射对小白鼠脂质过氧化作用及神经递质含 量的影响.卫生研究，2000，29（1）：28-29 27 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 6 翟丹.不同手机对鼠脑的电磁影响.生物磁学，2004，4（3）：41-43 7 陈瑞， 侯燕芝， 陈安宇，等.微波辐照对鼠脑MDA、NOS含量和LDH活性的影响. 首都医科大学学报，2003，24（3）：231-233 8 胡俊峰， 翟红， 王洁贞，等.手机电磁辐射与脑肿瘤关系的meta分析.中国健康教育， 2003，19（8）：567-570 9 黄文方，等.实用医学分析技术与应用.北京：人民卫生出版社,2002. 10吴冠芸,等.生物化学与分子生物学试验常用数据.北京：科学出版社,2000. 11周丽华，袁群芳.青、老年大鼠在morris水迷宫中的学习记忆行为. 解剖学研究，1995，17（1）：25-30 12裴媛，林庶茹， 李德新，等.脑老化的中医药实验研究进展.中国老年学杂志，2005，25（6）：740-742 13刘涛,卞慧敏,刘学风.改良三甲散对东莨菪碱诱导学习记忆障碍的影响.中国中医基础医学杂志,1999,5(2):18. 14洪岸，等.老年大鼠学习记忆减退的神经基础.生理科学进展1995，26（3）：240-242 15蔡军.用sds-PAGE分析国外医学.临床生物化学与检验学分册，1994，（1）： 38 16钟叔平，李伟明，曾斯明，等.癌症患者血清蛋白sds－PAGE的分离.汕头大学医学院学报，1994，（2）：25-27 17郭德玉，李斌，李林.大鼠生长及衰老过程中学习记忆能力与皮层神经丝蛋白 表达关系. 实验动物科学与管理, 2003，20 18谭焕然， 杨磊， 沈丽，等.γ射线照射孕鼠致仔鼠脑内异常改变．北京医科 大学学报，1996，28（5）：563-564 19陈沙力， 孟庆勇，刘树铮．辐射诱导小鼠免疫细胞蛋白质表达变化及酪氨酸 磷酸化．白求恩医科大学学报，1998，24（2）：117-118 20冯方俊,涂晋文.寿尔智胶囊对老年性痴呆模型小鼠海马神经元细胞凋亡及超 微结构的影响.中国中医药科技,2003，10(4):234-235 28 探索性医学综合实验—教学改革与实践（第四期） 21柯开富,周鸣鸣,强亮,等.神经生长液对衰老模型小鼠学习记忆能力的影响.中国临床康复,2003，7(25):3444 -3445 22瞿延晖,文昌湖,徐锡萍,等.七宝美髯丹对老年小鼠乳头体神经元超微结构影 响的研究.湖南中医学院学报,2001，21(4):1-4 23朱健,王闻怡,李宁丽,等.老年鼠脑老化神经细胞凋亡及基因调控的研究.中国老年学杂志,1998，18(3):161-163 24郭国祯,郭鹞. 微波照射小鼠睾丸对的影响. 中华劳动卫生职业病杂志, 1994, 12(1):49-50 25杨慧娟，姚耿东，姜槐，等.微波谐振腔体辐射小鼠睾丸对精子形态的影响.浙江医科.大学学报，1991，(1): 17-19 26赵志刚，吴芬芳.53GHz毫米波辐射孕鼠对子代的影响.中华劳动卫生职业病杂 志，1998，16（3）：155-158 29