β射线敷贴照射治疗增生性瘢痕治疗前后组织中TNF-α表达变化观察研究（可编辑）

β射线敷贴照射治疗增生性瘢痕治疗前后组织中TNF-α表达变化观察研究（可编辑） β射线敷贴照射治疗增生性瘢痕治疗前后组织中 TNF-α表达变化观察研究 6 门300j 分类号 密级 UDC 编号―― 中南大学 CENTRAI。SoUTHUNIVERSITY 硕士学位论文 论文题目: 13射线敷贴照射治疗增生性瘢痕 治疗前后组织中TNF(Q表达变化的 ?? 观察研究 学科、 专业: 影像医学与核医学 研 究生: 支科 学院 系、所 湘雅三医院 导师姓名及其 专业技术职称: 石光清教授 中南大学 二。一。年五月 分类号VDC 密级 硕士学位论文 13身寸线敷贴照身寸; 后 组织中TNF-Q The onthe ofTNF―Qin changesexpression patients with scarsafter hypertrophicp―rayapplication therapy 作者姓名: 支科 学科专业: 影像医学与核医学 学院 系、所 :湘雅三医院 指导教师: 石光清 昌IJ指导教师: 答辩委员会主席 中 南 大 学 二。一。年五月 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名: 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 „名蜱铈签名舛 硕t学位论文 中文摘要 摘 要 目的:本研究从在体瘢痕水平上，用不同剂量的13射线对增生性瘢痕进行 敷贴照射治疗，运用免疫组化方法增生性瘢痕组织中的TNF(Q表达情况， 比较治疗前后的检测结果，分析瘢痕组织中TNF―Q表达水平的变化，探讨B射 线敷贴照射治疗增生性瘢痕的机理，以及作为评价疗效指标的可行性。 方法:本研究来自湘雅三医院核医学科门诊病人，瘢痕时间1,6月，瘢痕 高度介于5,10mm之间，最短长径大于2cm。共治疗10例病人，根据不同的B射线 敷贴照射剂量，将病人分为2组――30 Gy组与60Gy组，每组各5例病人。在每个 常皮肤的瘢痕边缘处，用穿刺针取13射线敷贴照射病人瘢痕组织靠近J下 治疗后1 周的瘢痕组织各l块，每块组织取连续3张切片，每张切片取5个高倍镜视野拍照 作为治疗组。取每个病人相同部位的治疗前的增生性瘢痕组织各1块，每块组织 取连续3张切片，每张切片取5个高倍镜视野拍照作为对照组。同时取每个病人的 每块组织取连续3张切片，每张切片取距瘢痕5cm处的正常皮肤组织l块， 5个高 倍镜视野拍照作为正常组。分别记录每例病人治疗前与治疗后l周瘢痕表面反应。 用免疫组化分析瘢痕组织中TNF一0【表达情况，以胞浆染成棕黄色表示阳性。采用 ProPlus 计算机图像分析系统Image 6(0软件分别统计各视野阳性面积百分比。阳 性面积百分比 阳性染色面积,该视野总面积×100,，用算术平均值表示，评价 TNF(a在组织中的表达变化。采用Excel软件对各组织的TNF(a表达进行统计。数 11(0统计软件进行处理。 据以均数?标准差 x士s 表示，采用t检验，用SPSS 结果:13射线敷贴照射治疗前增生性瘢痕组织中耵旺(伐表达水平很低，明 疗后，增生性瘢痕组织中TNF(a表达水平较治疗前升高，30Gy组对照组TNF(0c 硕十学位论文 中文摘要 照射剂量的增大，增生性瘢痕组织中TNF(a表达水平有增高的趋势，30 Gy 组治 疗组TNF―a阳性百分比 0(72_-L0(07 ,，60 Gy组治疗组TNF(a阳性百分比 0(91+0(08 ,，差异有统计学意义 t 14(40，P 0(001 。 结论:l、TNF(cc参与了增生性瘢痕的形成和发展;2、13射线敷贴照射治 疗是一种有效的治疗增生性瘢痕的方法;3、TNF。a表达水平在13射线敷贴照射 治疗村后出现了动态变化，TNF(((0t对增生性瘢痕的恢复具有一定的作用， 为以后的临床治疗提供了方向;4、B射线敷贴照射治疗可引起组织中n师吨表 达水平的变化，可将TNF(a作为评价B射线敷贴照射治疗疗效的客观指标。 关键词:13射线;敷贴照射治疗;增生性瘢痕;肿瘤坏死因子 硕士学位论文 英文摘要 ABSTRACT in thisarticleweresearch scars Objective:In hypertrophicpatients，and the ofleveloftumournecrosisfactor??aintissueof analyzechanges hypertrophic scars monoclonalantibodiesand of tissue using immunoperoxidasestainingparaffin sectionaftedifferentdosesof to the B-rayapplication try therapy(Andexplore Mechanismsof for scars( B-rayapplicationtherapyhypertrophic Methods:Thereare10 ondifferentdosesof patients(Base B-ray,allpatients ??aredividedintotwo and are5 in groups:30Gygroup60Gygroup(Therepatients takecollection tissuesafter every(group("We using(‘transfixionpin(The BTray(?? in consist thetissueswithno ， therapy raygroup B-rayapplicationtherapy in consistcontrol the ofleveloftumournecrosisfactor―a group(Weanalyzechanges intissueof scars and monoclonalantibodies hypertrophicusing immunoperoxidase of tissue the of area section，and stainingparaffin analyzepercentagepositiveusing Excel( Results:Theleveloftumournecrosisfactor-aintissueof scarsis hypertrophic lowerthannormalskin(After leveloftumour obviously B-rayapplicationtherapy，the necrosisfactor―aintissueof scarsis thanbefore(Themore hypertrophichigher doses of leveloftumournecrosis intissueof higher factor―a scars( B-ray,the hypertrophic Conclusion:Tumournecrosisfactor―aisan inthe importantcytokines formationand of isa development hypertrophicscars(B-rayapplicationtherapy effectivetreatmentof scars(Theleveloftumournecrosisfactor―acan hypertrophic make after restitutionof scars changesB-rayapplicationtherapy(The hypertrophic be a ofa amountoftumournecrosis mightlyparticallyconsequencerelativelyhigh an which effectiveof tocurethe scars( factor―a，inexplore waytherapy hypertrophic canresultinthe theleveltumour of of necrosis B-rayapplicationtherapy changes factor-aintissueof scarsthatbeindexofevaluation( hypertrophic necrosis words:B-ray;applicationscars;tumour Key therapy;hypertrophic factor III 硕十学何论文 目录 目 录 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(1 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(III 第一章前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„l 第二章 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„3 2(1 一般资料„„„„„„„„„„„„„„„„((3 2(2 治疗方法„„„„„„„„„„„„„„„„((5 2(3 治疗后护理„„„„„„„„„„„„„„„„6 2(4 n师(0c表达的测定„„„„„„„„„„„„„„6 第三章结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 3(1 治疗后瘢痕表面反应„„„„„„„„„„„„„(8 3(2 n吓(Q单克隆抗体染色光镜观察„„„„„„„„„„8 3(3 组织中TNF(a表达水平的比较„„„„„„„„„„((8 第四章讨论„„„„„„„„„„„„„„„„„„14 第五章结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„20 附图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((2l 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(24 附录„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((28 综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((29 致i射„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((41 攻读学位期间主要的研究成果„„„„„„„„„„„„„(42 IV 硕一f:学位论文 第 一章 前言 第一章 前言 瘢痕形成是高等哺乳动物特有的创伤愈合形式。但由于瘢痕异常增生所形成 的增生性瘢痕，不但影响美观，还会引起痛、痒等症状，更有可能导致组织和器 程度的功能障碍。BockOtIJ报道，增生性瘢痕甚至对患者的心理也官不同 会造成 影响。增生性瘢痕是创伤局部上皮化以后，组织继续增生的病理改变，是临床上 常见的一种病理性瘢痕。其形成是由于创伤愈合过程中成纤维细胞合成与分解代 谢紊乱，导致细胞外基质合成增多和过度沉积，其中胶原为其主要成份。成纤维 细胞是产生胶原的主要细胞。发病与遗传因素、内分泌、自身免疫等有关，可继 发于外伤、烧伤、烫伤、感染、耳环刺激、注射和手术后等。 13射线敷贴照射治疗是临床上常用的一种治疗方法。应用13射线对病变组织 进行敷贴照射，由于13射线有较强的电离能力，通过13射线对病变部位的电离辐 射生物效应，可抑制成纤维细胞增殖分化，阻断瘢痕血液供应，具有显著抑制瘢 痕过度增生的效果眨1。但对应给予的13射线的敷贴照射治疗剂量、起始及持续时 间等，目前尚无一致结论。再者，由于患者存在个体差异性，应用同剂量 13射线 敷贴照射治疗后患者治疗效果并不同，这是否存在射线剂量效应关系仍不确定。 目前，对13射线敷贴照射治疗增生性瘢痕的研究多集中在临床研究上，基础理论 断仅凭经验凭肉眼观察，缺乏一种统一指标来判断p研究很少。其疗效判 射线治 疗瘢痕的疗效。因此，探讨D射线敷贴照射治疗增生性瘢痕的机理，并寻找一个 可靠、客观的指标来观察不同时间、不同治疗剂量下的疗效具有重要的临床意义。 TNF(a是影响瘢痕形成的一种非常重要的细胞因子，由激活的单核,巨噬细 胞和激活T淋巴细胞产生，对成纤维细胞胶原合成与分解代谢发挥了重要作用。 增生性瘢痕组织中，TNF(a阳性浸润细胞比例明显降低 增生性瘢痕组织中为 8,，正常瘢痕为35(4, b1。这种改变是由于n师一仅mRNA生物合成降低，即 转录水平受抑制所导致的M1。目前认为，TNF(0【对成纤维细胞具有双向作用:低 浓聚时刺激成纤维细胞增殖，高浓聚时则抑制成纤维细胞的增殖。其原因可能与 0t作用于成纤维细胞介导不同的信号传导途径有关。 不同浓度的TNF( 在行13射线敷贴照射治疗过程中，一定剂量的13射线照射可引起免疫功能的 增强，其中心环节是T淋巴细胞激活与增箔加快b1。T细胞激活可能受低剂量照 射后巨噬细胞变化的制约。由于T淋巴细胞激活、增殖加快和功能增加，使其 硕十学位论文 第一章 前言 分泌的TNF(a浓度增加，抑制增生性瘢痕的进展。由此，我们推断在这一 治疗 过程中瘢痕组织中TNF(0【含量可由低到高呈现出动态变化。如果TNF(a含量与 13射线照射剂量有一定的相关性，则有可能以TNF(a作为13射线敷贴照射治疗剂 同时，如果在B射线敷贴照射治疗过程中TNF(伐表达水平量的判断指标。 出现 升高，说明TNF(a在增生性瘢痕的恢复中发挥了一定的作用。 本研究以患者的在体瘢痕为研究对象，运用不同剂量的13射线――30Gy与 60Gy，对增生性瘢痕进行敷贴照射治疗。治疗后一周取该瘢痕标本，运用免疫 组化方法分析增生性瘢痕组织中的TNF(a表达情况，并与治疗前相同区域标本 (a表达水平的变化，探讨p射比较两者的检测结果，分析瘢痕组织中TNF 线敷 贴照射治疗增生性瘢痕的机理，以及作为评价疗效指标的可行性。 2 硕十学位论文 第_二章材料与方法 第二章材料与方法 2(1 一般资料 本研究一般资料来自湘雅三医院核医学科门诊病人，瘢痕时间1,6月，瘢痕 高度介于5,10mm之间，最短长径大于2cm。增生性瘢痕是因愈合瘢痕高出创面 数毫米至数十毫米而得名，区别于J下常愈合瘢痕，但一般不超过创缘，区别于瘢 病人治疗前无长期服用免疫调节剂，无长期局部外用治疗瘢痕药物痕疙瘩。 史， 不伴肿瘤及自身免疫性疾病。 90Sr B射线照射治疗可分为多次小剂量法和少次大剂量法。多次小剂量法的 优点是患处吸收剂量较小，在治疗中便于观察病人的敏感程度和病情变化，并根 可减少局部不良反应的发生。少次大剂据治疗情况而随时延长或终止治疗， 量法 的优点是减少病人往返的麻烦和费用，适合远距离就医的病人;缺点是不易随时 观察治疗效果，因一次性使用剂量较大，易造成局部灼伤或感染婚1。由于该研究 是在体水平的研究，需取病人的活体组织，且门诊病人来源复杂，为便于采集标 大剂量法。 本故该实验采用少次 2(1(1选择理由 l,6月的瘢痕组织相对比较新鲜，质地较软，方便采取标本;且瘢痕 组织内 细胞数量相对较多，能相对更可靠地得到相关数据。 由于90sr其13射线最大穿透距离为1lmm，如瘢痕太厚不能穿透至瘢痕深层， 故将选择的瘢痕厚度定为5,10ram之间。 2(1(2实验分组 共治疗10例病人，根据不同的13射线敷贴照射剂量，将病人分为2组:30Gy 组与60 Gy组，每组各5例病人。在每个病人瘢痕组织靠近正常皮肤的瘢痕边缘 处，用穿刺针取13射线敷贴照射治疗后1周的瘢痕组织各l块，每块组织取连续 3张切片，每张切片取5个高倍镜视野拍照作为治疗组。取每个病人相同部位的 治疗前的增生性瘢痕组织各1块，每块组织取连续3张切片，每张切片取5个高 42 硕 学位论文 第一二章材料与方法 倍镜视野拍照作为对照组。同时取每个病人的距瘢痕5cm处的正常皮肤组织l 块，每块组织取连续3张切片，每张切片取5个高倍镜视野拍照作为正常组。观 察TNF(a表达情况。 30 Gy组 ?治疗组 位:胸前3例，腹部1例，耻骨联合1例。瘢痕形成原因:外伤2例，手术2 例，烫伤1例。使用同一90Sr放射性核素皮肤敷贴器，同样的剂量和方法治疗 敷 贴器面积2cmX2cm，剂量率根据半衰期28(1年进行校正，治疗同一部位，总剂 量为30Gy 。 ?对照组 取每个病人相同部位的治疗前的增生性瘢痕组织各1块纳入对照组。 ?正常组 取每个病人距瘢痕5cm处的萨常皮肤组织各l块纳入正常组。 60 Gy组 ?治疗组 位:胸前3例，后背1例，小腿1例。瘢痕形成原因:外伤l例，手术1例，烫 伤3例。使用同一90Sr放射性核素皮肤敷贴器，同样的剂量和方法治疗 敷贴器 X 面积2cm 2cm，剂量率根据半衰期28(1年进行校正，治疗同一部位，总剂量为 。 60Gy ?对照组 取每个病人相同部位的治疗前的增生性瘢痕组织各1块纳入对照组。 ?正常组 取每个病人距瘢痕5cm处的萨常皮肤组织各l块纳入正常组。 以上所有病人均签署知情同意书，以上实验均经湘雅三医院医学伦理委员会 审批通过。 42 4 硕 学何论文 第二章材料与方法 表1实验分组情况列表 2(2 治疗方法 ?设备仪器 使用中国原子能科学研究院同位素研究所提供的90Sr皮肤敷贴器，敷贴器面 射线，然后转变成子代产物90Y，,的物理半衰期为64(2h，释放出能量为 射线，因其在组织中穿透力较弱，最大射程为11mm，穿透2mm组织后能量将 消减到19,，穿过5mm组织后，能量仅剩1,，因此对深层的正常组织没有损 害。在每次治疗前根据其28(1年的半衰期校J下剂量率，确定治疗时间。 表2”Sr皮肤敷贴器情况 指标项目 参 数 生产企业 中国原子能科学研究院同位素研究所 出厂活度 1240mBq 33(5mci 测韬日期 1998年09月28日 源编号 98―040 型 号 SRSA一101 吸收剂颦率 0(033Gy,s 活度区尺寸 20×20mm 42 硕卜学何论文 第_二章 材料与方法 ?操作办法 将病变的轮廓描绘在透明纸上，然后将所描绘的轮廓在大于敷贴器尺寸 5mm厚的橡胶皮上开所描绘的病变形状的窗，窗的周围应大于病变形状5mm，即 病变四周应有5mm左右的正常皮肤暴露，以使肉眼难以观察到的潜在病变得到 避免病变的边缘型复发，治疗时敷贴器紧贴瘢痕。分野治疗时应照射治疗， 特别 注意，在分野交界处用记号笔作上标记，在下一野照射时应包含标记符号外 3mm范围，以保证交界部位也包含在有效照射剂量范围内。以上操作均有2名以 上核医学专业人员操作，所有操作按《核医学诊疗规范》盯1执行。 ?随诊 所有病人治疗后1周取组织，同时观察治疗后瘢痕表面反应情况。 2(3 治疗后护理 对已照射的局部组织要减少摩擦，保持皮肤的卫生。治疗及观察期间， 局部 皮肤出现轻度红斑是正常的，禁止用热水烫沈、搔抓，避免造成损伤和感染。若 局部表皮出现破溃，要停止治疗，在局部避免污染的同时，可以局部给予维生素E 滴丸或消炎软膏涂抹，即可很快愈合。 2(4 TNF(cc表达的测定 2(4(1试剂和仪器 兔抗人TNF(cc单克隆抗体 博士德 ;TNF(Q免疫组化试剂盒 博士德 2(4(2标本处理 la 标本包埋，液氮保存。石蜡包埋，连续3 m厚度切片，并作HE染色。对石 mmol ,L 6(0的10 蜡切片经二甲苯脱蜡和70,、90,、100,梯度酒精脱水后，用pH 柠檬酸缓冲液微波处理20 min，然后用0(5,H202处理15min，阻断内源性过氧化 切片用牛血清处理和TBS沈涤后用于检测。严格按照试剂盒说明书操物酶。 作， 免疫组化采用常规SP法，最后以DAB显色，用TBS代替一抗作阴性对照。TNF(a 以胞浆染成棕黄色表示阳性，评价TNF(0【在组织中的表达。 42 6 硕t学位论文 第二章材料与方法 2(4(3统计学处理 采用Excel软件对各组织的TNF(仅表达进行统计。先后在低倍镜及高倍镜下观 察瘢痕的组织结构、免疫细胞浸润及TNF一0【单克隆抗体染色情况。每块组织标本 连续3张切片，每张切片随机取5个高倍镜视野拍照，采用计算机图像分析系统 ProPlus Image 6(0软件分别统计各视野阳性面积百分比，用算术平均值表示，阳 性面积百分比 阳性染色面积,该视野总面积×100,。 l 数据以均数?标准差 x士s 表示，采用t检验，用SPSS1(0统计软件进行处理。 42 7 硕仁学t《7:论文 第j‘ 章 结果 第三章结果 3(1 治疗后瘢痕表面反应 30Gy组有1人瘢痕表面出现发红，无皮肤溃烂、色素沉着等副作用;患者 均未诉瘙痒、疼痛等自觉症状。 60Gy组有1人瘢痕表面出现发红，1人瘢痕表面出现色素沉着，无皮肤溃 烂等副作用。1人诉有轻度瘙痒，未诉有疼痛等自觉症状。 3(2 TNF(Q单克隆抗体染色光镜观察 光镜观察看见增生性瘢痕真皮内含有大量胶原纤维，呈漩涡状或结节状分布， 排列致密且紊乱，血管较少。成纤维细胞和单核,巨噬细胞、淋巴细胞数量很少， 散在分布。 见图l 1 D射线敷贴照射治疗后，单核,巨噬细胞、淋巴细胞数量增 多，TNF―a阳性细胞胞浆抗TNF(a单克隆抗体染色呈棕黄色。 见图12 光镜下治疗组与对照组增生性瘢痕组织结构和细胞结构未见明显差别。 3(3 组织中TNF一0【表达水平的比较 表3组织中TNF(-a表达水平比较 硕士学位论文 第三章结果 图1增生性瘢痕治疗前后组织中TI吁F-G表达水平直方图 3(3(1对照组与正常组组织中TNF―Q表达水平的比较 B射线敷贴照射治疗前，增生性瘢痕组织中TNF吨表达水平很低，明显低 O(44 L-0(08 ,，正常 于正常皮肤组织，30Gy组对照组rn疆吨阳性百分比为: 组TNF-G阳性百分比为: 2(15:士-0(40 ,，两者差异具有统计学意义 t -35(79， 阳性百分比为: 2(1 2(50, 2(OO, 1(50, 1(00, O(50, O(OO, 30Gy 60Gy 图2增生性瘢痕治疗前与正常组织中(n师吨表达水平直方图 9 硕士学位论文 第 三章结果 3(3(2 30Gy组治疗组与对照组组织中TNF―a表达水平的比较 p射线敷贴照射治疗后，增生性瘢痕组织中n腰吨表达水平升高，30Gy组 对照组TNF-G阳性百分比为: O(44:L-0(08 ,，治疗组TNF-4Jt阳性百分比为: O(72-+0(07 ,。两者差异具有统计学意义 t 24(69，P 0(001 。 O(80, O(70, O(60, O(50, O(40, O(30, O(20, O(1O, O(OO, 30Gy 图3 30Gy组增生性瘢痕治疗前后组织中n师吨表达水平直方图 3(3(3 30Gy组治疗组与正常组组织中TNF―Q表达水平的比较 p射线敷贴照射治疗后，增生性瘢痕组织中n师吨表达水平升高，但仍然低 于正常皮肤组织。30 O(72--+0(07 ,，正常 Gy组治疗组n晒吨阳性百分比为: 组TNF-et阳性百分比为: 2(15:L-0(40 ,。两者差异具有统计学意义 t 30(51， P 0(001 。 10 硕士学位论文 第三章结果 2(50, 2(OO, 1(50, 1(OO, O(50, O(OO, 30Gy 图4 30Gy组增生性瘢痕治疗后与正常组织中n师吨表达水平直方图 3(3(4 60Gy组治疗组与对照组组织中n盯一a表达水平的比较 p射线敷贴照射治疗后，增生性瘢痕组织中n吓吨表达水平升高，60Gy 组 对照组TNF吨阳性百分比为: 0(43 e0(07 ,，治疗组TNF-G阳性百分比 为: O(914-0(08 ,。两者差异具有统计学意义 t -38(92，P 0(001 。 1(OO, O(80, O(60, O(40, O(20, O(OO, 60Gy 图5 60Gy组增生性瘢痕治疗前后组织中n旺吨表达水平直方图 硕士学位论文 第三章结果 3(3(5 60Gy组治疗组与正常组组织中TNF―Q表达水平的比较 p射线敷贴照射治疗后，增生性瘢痕组织中n师吨表达水平升高，但仍然低 于正常皮肤组织。60 0(91:,-0(08 ,，正常 Gy组治疗组耵师龟阳性百分比为: 组TNF吨阳性百分比为: P 0(001 。 2(50, 2(OO, 1(50, 1(OO, O(50, O(OO, 60Gy 图6 60Gy组增生性瘢痕治疗后与正常组织中n吓吨表达水平直方图 3(3(6 比较 随着照射剂量的增大，组织中TNF-4x表达水平有进一步增高的趋势。30Gy 组治疗组与TNF吨阳性百分比为 0(72-1-0(07 ,，60 Cy组治疗组TNF吨阳性 12 硕士学位论文 第三章结果 1(OO, O(80, O(60, O(40, O(20, O(OO, 图7 30Gy组与60Gy组增生性瘢痕治疗后组织中TNF-(o(表达水平直方图 13 硕十学f节论文 第四章讨论 第四章讨论 在皮肤创伤的难常愈合过程中，胶原的合成与降解始终处于一种动态平衡状 态中。当某种外来因素干扰或打破这种平衡状态时，就会引起胶原的过量合成与 沉积，导致增生性瘢痕形成。增生性瘢痕常继发于外伤、烧伤、烫伤、感染、耳 环刺激、注射和手术后等。增生性瘢痕的发病机制涉及组织,器官、细胞、分子 的各个环节，是一个错综复杂的相互作用、相互调控的过程。目前其具体机制仍 不十分清楚，涉及的因素主要有:遗传因素、自身免疫因素、内分泌因素、癌基 因、细胞凋亡、细胞因子、组织缺氧、细胞间缝隙连接等【?61。 增生性瘢痕的治疗也十分棘手。增生性瘢痕常用的治疗方法有有外科手术、 激光疗法、冷冻治疗、放射疗法、加压疗法、硅凝胶治疗、药物治疗、中医治疗、 基因治疗等。但这些方法如采取单一的治疗措施不是治疗效果欠佳，就是副作用、 并发症多，导致治疗不能继续进行，或者容易复发。目前以放射疗法及手术后辅 之01。 助放射治疗取得较好的治疗效果f" 前常用的放射疗法是p射线敷贴照射治疗。p射线敷贴照射治疗采用了经过封装的 特殊的放射性核素，常用的放射性核素包括90sr与32p。这些放射性核素能发出D 射线，这些发出的13射线随着组织深度的增加，剂量迅速减小。如90Sr发出的p射 射治疗最大的优势就是照射集中，并且不会损伤到增生性瘢痕深层的正常组织和 器官。 p射线敷贴照射治疗对增生性瘢痕的治疗作用包括以下几个方面:1、p射线 对成纤维细胞的直接杀伤作用:2、诱导成纤维细胞凋亡;3、引起线粒体损伤; 4、引起增生性瘢痕内及底部剧围血管发生萎缩、闭塞的退行性改变，阻断瘢痕 5、引起细胞因子的改变。 血液供应; 目前普遍认为B射线低剂量可诱导成纤维细胞发生凋亡，而大剂量则直接引 起成纤维细胞死亡眩引。在电镜下成纤维细胞的凋亡和死亡有明显的区别。细胞 14 硕十学位论文 第四章讨论 凋亡的特征性形态学变化为:细胞核缩小，染色质凝集，细胞表面形成许多球形 突起，突起内见被包裹的胞质与细胞器、核的碎片或整个浓缩的细胞核，部分突 起与细胞脱离形成凋亡小体;凋亡小体自细胞一端r不始出现，小体内细胞器结构 仍完整;细胞崩解成多个有膜包绕的圆形凋亡小体，有的细胞凋亡小体被邻近细 细胞死亡的特征性形态学变化为:细胞出现水肿，体积变大，细胞胞吞噬。 质膜 破裂，核溶解，细胞内容物释出等。凋亡与坏死在治疗上的意义是完全不同的， 坏死是细胞水肿、破裂，溶酶体酶释放而引起邻近细胞受损，局部炎症反应出现， 而炎症反应是瘢痕过度增生的主要原因之一。凋亡是一种“干净”的细胞清除过 程，凋亡细胞通过形成凋亡小体而被邻近细胞吞噬、消化、溶解，不引起局部炎 症反应。 线粒体为成纤维细胞提供能量。13射线能损害线粒体，抑制能量的产生。粗 面内质网合成胶原蛋白需要能量，能量代谢的障碍使成纤维细胞合成胶原蛋白 粗面内质网数量的减少及其本身被射线损害使得胶原蛋白合的功能也减弱。 成减 少，从而抑制瘢痕的增生【251。 13射线能引起增生性瘢痕内及底部周围血管内皮细胞肿胀，血管逐渐闭塞导 致血液循环障碍。由于新生肉芽组织中毛细血管的生成受阻，创伤部位缺乏营养 供给，导致创伤修复过程受阻【261。 在行p射线敷贴照射治疗过程中，低剂量的D射线照射可引起免疫功能的增 强，其中心环节是T淋巴细胞激活与增殖加快【271。肿瘤坏死因子 TNF(a 主要由 激活的单核,巨噬细胞细胞与T淋巴细胞产生，对成纤维细胞胶原合成与分解代 谢发挥着重要作用【4l。由于T淋巴细胞激活、增殖加快和功能增加，使其分泌的 (0【浓度增加。 TNF B射线敷贴照射治疗后局部反应是机体辐射损伤的一种表现，其表现有一过 性肿胀、红斑、色素沉着、水疱等。具体表现形式及程度可能与个体对射线敏感 程度、瘢痕局部照射时间 剂量 、两次治疗间隔时间、瘢痕形成时问、瘢痕厚度、 瘢痕硬度、瘢痕大小、患者年龄、患者性别及治疗后护理措施等因素有关系。出 现程度较轻可给予一般的处理，如保持皮肤的卫生，避免用热水烫洗、搔抓等， 一段时间后可自然消失。出现程度较重，则应立即停止治疗，并局部给予维生素 E滴丸或消炎软膏涂抹，如出现感染可予抗感染治疗。本实验的2组实验组均有患 硕十学位论文 第四章讨论 者出现局部反应，但具体影响因素及权重有待大的专门研究。 本实验的TNF―Q单克隆抗体染色情况如前所述，与周慧君等128】观察结果一 致。2组治疗组在治疗后一周取标本，在光镜下未见治疗前后增生性瘢痕组织结 构及细胞结构有明显差别。其可能原因一是时间因素，正常皮肤更新一个周期为 l周时间距治疗结束时问太短，在这么短的时问内，组织结构和细28天， 胞结 构还不至于发生明显的变化。二是受光镜条件限制，光镜下不可能观察到内质网、 线粒体等超微细胞结构。所以即使细胞器发生肿胀等早期变化，光镜下也观察不 到。这些治疗前后成纤维细胞超微结构的早期变化可留待进一步研究。 皮肤可视作免疫系统的一部份，即皮肤免疫系统。该系统由两部份组成:细 胞成份和分子成份。细胞成份中含有的细胞包括:角质形成细胞、淋巴细胞、朗 格罕细胞、内皮细胞、肥大细胞、巨噬细胞、真皮成纤维细胞等。分子成份包括: 细胞因子、免疫球蛋白、补体、神经肽等晒’。由于增生性瘢痕的形成与自身免疫 因素有很大的关系，所以这些部份很可能都参与构成复杂的增生性瘢痕形成与发 展的调节网络。TNF(a作为一种细胞因子参与增生性瘢痕的形成、发展，很可能 并不是起到一种孤立的作用，而是与其它细胞、其它分子成份相互作用、相 互影 响、相互制约。目前已知的刺激巨噬细胞分泌TNF(0【的因素有内毒素、细胞因子、 腺病毒TNF―Ct反义链【30】等。一些治疗手段也能引起组织中n师(a表达的变化，如 瘢痕组织的TNF(a阳性细胞百分比，促超短波和音频电治疗可以升高患者 进瘢痕 组织的成熟【3l】。 TNF(旺对增生性瘢痕形成、发展的影响错综复杂。主要体现在对成纤维细胞 增殖、细胞外基质的形成与降解等方面。TNF(a对成纤维细胞增殖的影响存在组 织特异性和浓度依赖性。种类不同、成纤维细胞的取材部位不同、培养条件 体 内或体外 不同、浓度不同，TNF―OL对成纤维细胞增殖的影响也会不同【30引】。目 前公认TNF(仅对成纤维细胞具有双向作用:低浓度时刺激成纤维细胞增殖，高 浓度时则抑制成纤维细胞的增殖。究其原因可能与不同浓度的TNF(Q作用于成 纤维细胞介导不同的信号传导途径有关。高浓度TNF(a通过TNARl相关死区蛋 白质 TRADD 介导信号传递，即死区蛋白质的活化传递程序性死亡信号，最终 导致成纤维细胞的程序性死亡，抑制成纤维细胞的增生。因为成纤维细胞数目减 16 硕 :学位论文 第四章讨论 少，分泌胶原等细胞外基质也就减少，细胞外基质沉积自然也就减‖强J。 本实验所研究的是B射线能否对增生性瘢痕组织中的TNF(Q表达水平产生 影响?产生的影响是刺激TNF(a分泌还是抑制n师(0【分泌?如果D射线能够刺 激TNF―a分泌，那么根据现有的研究结果，无疑对增生性瘢痕的治疗是有利的。 除了目前已知的p射线敷贴照射治疗增生性瘢痕的机理，我们对p射线敷贴照射 治疗增生性瘢痕的认识又将前进一步。本实验还对13射线对增生性瘢痕组织中的 TNF(a表达水平产生什么样的影响做了初步研究。随着13射线照射剂量的增大， TNF(仅表达水平是否也会随之升高?如果答案是肯定的，那么今后可开展进一步 的研究，分析具体的剂量效应关系，那么就可能以TNF(0【作为判断B射线敷贴 照射治疗疗效的指标之一。目前在p射线敷贴照射治疗过程中，对于患者应给予 的p射线的敷贴照射剂量、起始及持续时间等尚无一致结论，很大程度上依 靠医 生临床经验的积累和肉眼观察，而缺乏一个客观的监测指标。这在很大程度上限 制了p射线敷贴照射治疗的发展和推广。如果TNF(0t能作为这样一个指标，无 可以使我们的整个治疗疑对p射线敷贴照射治疗的发展和推广也是有利的。 过程 更加客观、科学。 本实验观察到增生性瘢痕组织中TNF(a表达水平明显低于正常皮肤组织， 建林等【33】均发现在增生性瘢痕组织中，TNF(a阳性浸润细胞比例明显降低。这说 明TNF(a在增生性瘢痕的发生、发展中起了一定的作用。但究竟是TNF(a表达 a表达水水平降低导致增生性瘢痕的形成还是增生性瘢痕的形成引起TNF(平的 降ig?目前我们只观察到这样一个现象，对于这两者之间的因果关系没有见到相 应的报道。 但增生性瘢痕组织中TNF一仅表达水平的变化可以影响增生性瘢痕的发展， 这是被很多实验证实了的。TNF(a可以通过影响胶原基因转录降如前述， 低其 mRNA水平，从而减少胶原等细胞外基质的合成和在组织中的沉积。TNF―a还 具有阻断其他细胞因子及促进成纤维细胞胶原合成的作用，从而降低了胶原基因 mRNA表达【341。因此通过某种手段提高增生性瘢痕组织中TNF―Q的表达水平， 将是一条有希望的治疗增生性瘢痕的途径。本实验观察到，在p射线敷贴照射治 疗后，增生性瘢痕组织中n师(c【表达水平升高。虽然B射线敷贴照射治疗的目 17 硕十学位论文 第四章讨论 的还是以直接杀伤成纤维细胞和诱导成纤维细胞凋亡为主，而不是以提高TNF―q 在组织中的表达为主。但这两者都是抑制增生性瘢痕发展的冈素，这两个因素相 结合我们推测应该比单一因素能起到更大的效果。那么这两者是否能起到协同作 用?可不展进一步的研究。 在整个13射线敷贴照射治疗过程中，不论是30Gy组还是60Gy组，我们观 察到虽然在13射线敷贴照射治疗后增生性瘢痕组织中TNF(Q表达水平有所升高， 但仍然低于J下常皮肤的TNF(0【表达水平。因此我们考虑在增生性瘢痕组织中是 否还存在着一些未知的，抑制单核,巨噬细胞细胞与T淋巴细胞分泌TNF―a活性 的因素。由于这些因素的存在，导致增生性瘢痕组织中单核,巨噬细胞与T淋巴 细胞分泌n吓一a活性始终无法恢复的正常水平。找出这些影响因素也将对我们 加深对增生性瘢痕的认识起到重要作用。 本实验还观察到，在13射线敷贴照射治疗过程中随着照射剂量的增大，组织 中TNF(0【表达水平有进一步增高的趋势。30Gy组和60Gy组，增生性瘢痕组织 中TNF一0【表达水平的差异有统计学意义。刘树铮【5垮旨出，低剂量的13射线照射可 引起免疫功能的增强。这个低剂量具体到D射线敷贴照射治疗中是一个什么范 围?我们推测13射线照射达到一定剂量后，13射线对单核、巨噬细胞细胞 与T淋 巴细胞也将是直接杀伤作用和诱导凋亡作用，那么增生性瘢痕组织中TNF(a表 达水平将会出现降低。但在此剂量之前，根据我们现有的实验结果，p射线照射 剂量与TNF(Q表达水平应该存在剂量效应关系。根据本实验推测，我们现在常 用的D射线敷贴照射治疗剂量应该在这个低剂量范围之内。所以常规剂量的13 射线敷贴照射治疗完全可以将TNF(a作为判断13射线敷贴照射治疗疗效的指标。 只是这两者的具体对应关系有待进一步研究。 之前周俐等【351报道，增生性瘢痕患者血清n盯(a的含量显著高于正常人，B (a的含量下降，且与疗效呈负相关。射线敷贴照射治疗后患者血清中TNF McCauly 等f36】实验表明，黑人瘢痕疙瘩患者血清中TNF(c【水平升高，认为是全身综合因素 影响的结果。根据现有实验结果，我们认为黄色人种患者血清中TNF(a的含量也 发生同样的变化。我们的机体以某种未明的机制，在增生性瘢痕的形成、发展过 程中，在全身综合因素的影响下，使得组织中和血清中的TNF(仅表达出现了相反 的变化。这个机制非常值得我们探讨和研究。同时从另外一个侧面说明，在探讨 硕十学位论文 第四章讨论 TNF(c【对增生性瘢痕的治疗作用问题上，我们不能通过提高患者血清中TNF―a水 平来达到治疗目的，并且很可能是相反。如果能更进一步明确组织中TNF(Q表达 水平和血清中的TNF(a水平的对应关系，那么我们今后就可以通过静脉采 血的方 式获取我们所需要的TNF一0【值，而不需通过组织活检这一有创的方式。这无疑大 大提高了观察的便捷程度和患者的可接受程度。 目Ij 『13射线敷贴照射治疗既可作为增生性瘢痕的首选治疗模式，也可以作为 单纯敷贴照射治疗适合新发的、范围较小、厚度外科手术的辅助治疗方法。 较薄、 质地较软的增生性瘢痕。而陈旧的、范围较大、厚度较厚、质地较硬的瘢痕应在 手术切除或激光切除后再行敷贴照射治疗。申超等【371采用单纯敷贴照射治疗， 有效率仅为26,，治愈率O,。13射线敷贴照射治疗根据治疗疗程来区分，可分 剂量照射法和少次大剂量照射法【38】。分次小剂量照射法的优点为多次小 是患处 吸收剂量较小，在治疗中便于观察患者的敏感程度和病情变化，并根据治疗情况 而随时延长或终止治疗，可减少局部不良反应的发生。根据13射线敷贴照射治疗 增生性瘢痕机理，小剂量D射线主要是诱导成纤维细胞凋亡，理论上来说凋亡是 一种“干净”的清理过程，但这一过程十分缓慢，临床上需很长时间才能观察到 明显的效果，因此治疗效果差强人意。如果患者在外地，往往很难降持多次往返 到医院来治疗。少次大剂量照射法的优点是减少病人往返的麻烦和费用，适合远 距离就医的患者;缺点是不易随时观察治疗效果，因一次性使用剂量较大，易造 成局部灼伤或感染。因此现在临床上多采用经过改良的分次大剂量照射法，收到 了明显的效果【39l。 13射线敷贴照射治疗对增生性瘢痕有独特的效果，具有方便、经济、可携带 的优点，射线损伤小，安全可靠。如能解决疗程制定、疗效观察问题，并加大科 普力度，解除患者对放射性的惧怕心理，13射线敷贴照射治疗还将取得更广阔的 前景。 19 硕十学位论文 第五章结论 第五章结论 5(1TNF一0【参与了增生性瘢痕的形成和发展; 5(2TNF―Q表达水平在D射线敷贴照射治疗前后出现了动态变化，提示 TNF(a对增生性瘢痕的恢复具有一定的作用，为以后的临床治疗提供了方 向; 5(3B射线敷贴照射治疗可引起组织中TNF??a表达水平的变化，可将 TNF―q作为评价13射线敷贴照射治疗疗效的客观指标。 20 硕士学位论文 附图 附 图 矿 ‖Y一一一?――一 k一( ?? , ,-,， 。( ，‘,。一 嘲鼍j霜谨;馏?暑硼 -、弋:,‘1、( „„„四四l 28 2b-29‘3|o30f一 P掣H哑”《雹眇j|崆”II“翼“I 一_少F 图8增生性瘢痕组织D射线敷贴照射治疗前外观 图9增生性瘢痕组织D射线敷贴照射治疗后外观 2l 硕士学位论文 附图 图1O正常皮肤免疫组化1"J,1-F-0(单克隆抗体染色 图11增生性瘢痕组织D射线敷贴照射治疗前免疫组化，n师吨单克隆 抗体染色 硕士学位论文 附图 ’ 、 ’t 参 (， o妒 桫+。j 孓一V了”??„?_y飞一胃11 黥(夕专‘(，认r0一盏一哆 焉 ?5，(一。皇帝一? k’』气。?“"曩，、一。薯 K?。t??*，’?-j带0 萋， ‘‘ ‖7 ((_ 一 蠢 静 I ? 爹 《二 ‖( - 二 ，。 。i 莨。; 蔓籀。。二。。。二。。 I。机姚。( j’ 一 图12增生性瘢痕组织D射线敷贴照射治疗后免疫组化n婚吨单克隆抗 体染色 图13取标本操作示意图 硕十学位论文 参考文献 参考文献 O，Schmid―OttG，MalewskiP，et oflife withkeloid 【l】Bock a1(Quality ofpatients and Dermatol hypertrophicscarring(ArchRes，2006，297 10 :433―438( 【2】罗定泰，罗定安，陈学主等(瘢痕疙瘩术后放射治疗的疗效探讨(临 床外 科杂志，1999，7 5 :293(294( C，StellaM，BerthodC，etal。TNF and 【3】Castagnoli productionhypertrophic scarring(CellImmunnol，1993，147 1 :51-63( C，StellaM，etal。Altered oftumor 【4】PeruccioD，Castagnolic biosynthesis necrosis isinvolvedin scars(Bum， factor TNF alphapostburn hy-pertrophic l8-121( 1994，20 2 :1 【5】刘树铮(低水平辐射对健康的影响(核技术，1994，17 6 :381―384( [6】张奇亮，主编。敷贴治疗核医学(济南:济南出版社，2004，49( 【7】陈盛祖，主编。临床技术操作规范核医学分册(第1版，北京:人民 军医出 版社，2004，194( A，McGrouther MW(Skin 【8】Bayat DA，Fergusonscarfing(BMJ，2003， 326 1380 :88―92( Kelo AG，NorrisJEC，OlsenBR，eta1(ClinicalGeneticsofFamilial 【9】Marneros ids(Arch Dermatol，2001，137 11 :1429―1434( 【lO】王珍祥，吴军，李世荣(增生性瘢痕相关基因的筛选(实用美容整形外科 杂志，2002，13 2 :74(76( XB，SunX，et of in W，Fu 【l1】Chen a1(Analysis differentiallyexpressedgenes keloidsandnormalskinwithcDNA Res，2003，11 microarray(JSurg 3 2 : 208(216( MW，et or 【12]HartyM，NeffAW，Kinga1(Regenerationscarfing:animmunologic perspective(DevDyn，2003，226 2 :268( [13】 黄勇，陈静，林立新，等(瘢痕成纤维细胞凋亡及P53基因的表达(中 华 医学美学美容杂志，2003，9 1 :33( itaK，IshikawaY，eta1(Detectionof inkeloidsand 【14】AkasakaY，Fuj apoptosis a on between scars，normal comparativestudy apoptosiskeloids，hypertrophic 24 硕十学位论文 参考文献 healedflat scars，anddermatofibroma。Wound 1( RepairRegen，2001，9 6 :50 15】GoodenoughJA，Paul 【 DA，Goliger intercellular communication(AnnuRevBiochem，1996，65:475(502( 【16】鲁峰，马建华，黎小问(病理性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞缝隙连接介导 的细胞I'日J通讯(中华整形外科杂志，2001，17 2 :96(98( TS，Tanzi scarsand and 【17】Alster EL(Hypertrophickeloids:etiology JClin management(AmDermatol，2003，4 4 :235―243( ofkeloid R，ComesPG，MossAL，eta1(Treatment 【18】Ragoowansi bysurgical excision andimmediate postoperativesingle―freation l1 6 :1853―1859( radiotherapy(PlastReconsterSurg，2003，1 R，Mitsuhashi H，et electron-beam [19】Ogava K，Hyakusokua1(Postoperative irradiationforkeloidsand of147 therapy SCarS:retrospective hypertrophic study casesfollowedformorethan18months(PlastReconstr Surg，2003，lll 2 : 547―553( V，AlfrinkM，MickeO，eta1(Resultsof irradiationin 【20】Wagner prophylactic with a resectedkeloids Oncol，2000，39 2 : patients retrospectiveanalysis(Acta ?? 217(220( 【21】李凯，岑瑛(手术结合早期放疗治疗瘢痕疙瘩(华西医学，2002， 17 1 : 136-137( SS，ArndtKA，DoverJS(Keloidsand scars: reviewand 【22】Urioste hypertrophic treatment CutanMed 999，1 59―171( strategies(SeminSurg，1 8 2 :1 FA(Keloidscars 89 N GD，Salzman of ClinAm， [23】King analysispatients(Surg 1970，50 3 :595-598( [24】王雪红，罗锦辉(B射线诱导成纤维细胞凋亡与防治瘢痕增生的关系(中 华整形外科杂志，2000，16 2 :69(72( [25】王志刚，徐少骏，鲍卫汉(X射线对大鼠皮肤伤1:3愈合过程中成纤维细胞、 胶原纤维影响的电镜超微结构研究(中华放射医学与防护杂志，2001， 21 5 : 349―350( 【26】 李虎，李小静，高JxL山，等(瘢痕微血管的研究治疗进展(整形再造外科 25 硕十学何论文