与G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形态的影响（可编辑）

与G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形态的影响（可编辑） 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。本学 【 位论文研究所获的研究成果,其知识产权归河北医科大学所有。河北医科 大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内 容相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,实验材料、原始数据、申 报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则,承担相应的法律责任。 签章: 研究生签字:王五谇导师签章: 月日 ???河北医科大学 研究生学位论文独创声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了文中 特别加以标注等外,文中不包括其他人已经发表或撰写的研究成果, 指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 研究生签字乒五开导师签章: 似岬 。年月日 ???,?帆 目 录 中文摘要英文摘要研究论文 与蛋白偶联受体相关的内源性活性 物质对心肌细胞功能和 形态的影响 引言...? 第一部分与蛋白相关的乙酰胆碱和腺苷对心肌细胞功能的影响 前言刚吾材料与方法结果?。 附图讨论参考文献 ???,‘ 第二部分与蛋白相关的血管紧张素对心肌细胞形态和的影响 前言且舌材料与方法? 结果:二口: 『:.?.?.??....?.?................................?......... ......... 附图讨论参考文献 综述? 致射? 个人简历???????中文摘要 与蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形 态的影响 摘 要 正常的心脏功能有赖于体内环境的稳定,有赖于体内众多活性物质对 心脏功能的协调、精细调节。这些活性物质中许多都是通过其相应的与 蛋白偶联的受体,激活细胞内信号通路,最终通过不同途径调节心脏功能。 其中,分别与和蛋白偶联的受体,以及激活这些受体的内源性活 性物质在心脏功能调节中发挥重要作用,有重要的生理和病理学意义。 与蛋白偶联的受体中,乙酰胆碱和腺苷的受体颇为重要,而它们 对心脏功能的调节方式之一是通过调节心肌细胞的内向整流钾离子通道 功能。其中蛋白门控内向整流钾通道./.可被乙酰胆 碱、腺苷等内源性活性物质激活进而影响心肌细胞功能。 由.和飚.构成的通道在心房肌细胞的电活性中有重 要作用,由于可以被乙酰胆碱激活因此又被称为。乙酰胆碱和腺苷 等内源性活性物质通过激活与蛋白相偶联的各自受体,,等进 而激活,由此介导的负性频率和负性肌力作用和腺苷的抗心律 失常作用。主要存在于心房肌细胞并发挥作用,对于心室肌细胞上 是否存在以及仇对心室肌细胞兴奋性的作用存在争议。有研究表 明在一些动物心室肌细胞中有通道的表达,而对心室肌细胞中 通道的功能则所知很少。本实验室杨冀杰硕士在正常小鼠心室内膜 下、外膜下细胞和心衰小鼠外膜下细胞中记录到明显的、成分可能为 的内向整流钾电流,同时发现腺苷可激活一种内向整流钾电流,因此电流 可以被特异性阻断剂阻断,因此认为此电流可能为 电流。包括钾通道在内的离子通道是构成心肌动作电位的基础,而心肌动 作电位又可以通过兴奋.收缩偶联而影响心肌功能。因此,本研究将在上 述实验结果的基础上,进一步观察了通道是否参与了心室肌的功能 调节作用。 ,是 慢性心功能不全充血性心力衰竭,中文摘要 ~种严重的心脏疾病,它是指在有充分的静脉回流的前提下,心脏 排出血 量绝对或相对减少,不能满足全身组织器官代谢需要的一种病理状态。血 管紧张素、去甲肾上腺素、内皮素等内源性活性 物质都可能参与心肌肥厚的发生。 上述与心肌肥厚相关的内源性活性物质的明显共性是这些物质中的 许多能激活蛋白信号通路,这提示蛋白信号通路可能在心肌肥厚 的发生过程中发挥重要作用。事实上,由实验表明蛋白介导的信号能 促进乳鼠心肌细胞的肥大,在培养的心肌细胞中过表达野生型蛋白可 使心肌增生;而表达激活的突变体时,进一步增强了信号,引起 最初的心肌肥大,并最终发展为心肌坏死。这种现象在过表达 的转 基因动物中进一步得到证实。激活后可通过磷脂酶水解细 胞膜上的产生和,后者可激活细胞内钙库上的受体而 释放钙库中的钙。目前对于通路激活后诱发心肌肥厚的详细机制还不 很清楚,其中细胞内钙变化可能是主要的机制。有关通路和细胞内钙 变化的关系有很多争议之处,、等内源性活性物质能增加乳鼠心 肌细胞的钙震荡细胞内钙,但对成年鼠心肌细胞内钙的影响则不能肯定。 本研究的第二部分将使用成年大鼠,观察和对细胞形态学 及细胞钙离子的影响,还将通过转染腺病毒来过表达,并观察过表达 对心肌细胞形态的影响。 一、与蛋白相关的乙酰胆碱和腺苷对心肌细胞功能的影响 目的:在非洲爪蟾的卵母细胞中表达内向整流性钾离子通道,研究钡 离子对内向整流性钾离子通道的抑制性作用,以及乙酰胆碱和腺苷对小鼠 心室肌细胞功能的影响。 ./.通道的的体外转录:所 方法:硒.,飚.用的飚通道克隆到质粒载体中,用叔蹦 . 体外转录得来各种通道的。爪蟾 卵母细胞的分离:爪蟾卵母细胞在含/胶原酶的液中振荡消化 ., , .至小时,液的成分为 , .。当细胞消化为单细胞后用溶液反复进行清洗细胞,去 除胶原酶。在爪蟾卵母细胞上进行注射:将各种离子通道 中文摘要 根据其表达情况的不同,按每个卵母细胞 注射,注射后的细胞 / 在含. 丙酮酸钠的中?培养,小时换一次液,溶 , .。 液构成为: , , ., , 记录电流:用双电极电压钳. , 方法检测细胞电流,其中放大器为。研究对?.、?.和 ./.通道电流的抑制情况。分离小鼠心室肌细胞:用 . 灌流装置酶解的方法分离小鼠的心室肌,细胞消化液的组成: /, /, /, ./。 检测心肌细胞功能:采用单细胞动缘检测系统检测细胞收缩功 能,给予电压,频率,波宽的持续电刺激。 结果: 质粒的酶切线性化电泳:用合适的限制性核酸内切酶 将环状的质粒线性化,环状质粒电泳显示两条或两条以上的泳 带; 而线性化完全的质粒电泳显示一条泳带。 体外转录的电泳分析:转录出所有通道的,用常 规的琼脂糖凝胶电泳方法可得到一条清晰的条带。 用抑制表达的通道:向卵母细胞注射后的~天后, 即可用方法检测到瞄电流。电流呈现明显的内向整流特性,用钾通 道的阻断齐可以抑制这些电流,但是不同通道间无明显区别。 乙酰胆碱和腺苷对心室肌细胞舒缩功能的影响:观察给予乙酰 胆碱和不同浓度的腺苷后对心室肌细胞的收缩幅度、最大收缩和舒张速率 的影响,没有发现这两种药物对细胞功能的影响有区别。 结论:以爪蟾卵母细胞为表达系统,将体外转录得来的以微注 射方式注入卵母细胞可表达瞄通道,~天后用双电极电压钳方法可观 察卵母细胞内表达戤通道的电生理特性,可通过与通道的孔区 结合而阻断通道的钾电流,但是对不同的通道的作用没有明 显区别。乙酰胆碱和腺营不能显著影响心室肌细胞的收缩功能,因此,可 能是通道对心室肌细胞的功能不能发挥重要作用 二、与蛋白相关的血管紧张素?对成年大鼠心室肌细胞形态和细胞 内计的影响 中文摘要 目的:在实验室建立培养成年大鼠心室肌细胞的方法;研究血管 紧 张素对心肌肥厚和细胞内的影响;研究过表达蛋白对心肌肥 厚的影响。 方法:成年大鼠心室肌细胞的培养:在无菌的条件下分离成年大 鼠心室肌细胞,用无血清的培养基进行培养。过表达蛋 白:用装载有基因的腺病毒转染心室肌细胞,利用蛋白免疫印迹实 验 验证蛋白的过表达。观察细胞形态和细胞内钙离 子的变化:计算培养的正常大鼠心室肌细胞、用血管紧张素孵育的细胞 以及过表达的细胞的表面积。使用钙荧光探针.标 记细胞内钙,利用激光共聚焦显微镜观察培养的大鼠心室肌细 胞内钙的改变。 结果: 培养的成年心室肌细胞的形态:分离的大部分正常心室肌细胞是 长杆状的,有清晰的纹理,在培养的天内不会有明显改变,天后有些 细胞出现形态学的改变,而有些细胞在天内都能保持良好的状态。 给予血管紧张素后,在培养的内细胞大小无明显改变,但 是后细胞表面积明显增大。 过表达不会影响培养细胞的大小,但是过表达的同时 用血管紧张素孵育,其表面积在内就能明显增大。 急性给予血管紧张素不会影响细胞内浓度。 结论:培养的成年心室肌细胞至少在天内可以保持良好的形态学 特 征,大部分细胞在.天内可以保持相似的形状。使用血管紧张素孵 育 的成年心肌细胞,天后出现肥大现象;当同时过表达时,这种现象 更明显。血管紧张素对成年大鼠心室肌细胞内无急性影响。 总 结 可阻断爪蟾卵母细胞上表达的电流,但是对不同的通道作 用无明显差异。 乙酰胆碱和腺苷不能明显影响心室肌细胞的收缩功能,通道对 中文摘要 心室肌细胞的功能不发挥重要作用。 无菌培养的大鼠心室肌细胞在.天内可以保持良好的形态学特 征。 血管紧张素可以引起成年心肌细胞的肥大,当同时过表达时, 这种现象更明显。 血管紧张素对成年大鼠心室肌细胞内无急性影响。 关键词:钾离子通道;蛋白偶联受体;蛋白;乙酰胆碱;腺苷; 血管紧张素;心室肌细胞;成年;细胞培养;肥厚 英文摘要 , . ? , ,, ., . , . .? 瞄./. . ./. .. ? ,, .伪 . 脚. . , ,? .; , 英文摘要 ., , ? , ., . . , . ,,. . , ; ; . . , . ?. .. 十,英文摘要 . . ? :;../..,飚. : :州 ? .至 : ., /. ., , , ..? :./. .。, .: ,,..? ., , , :? 飚./. .,. . . : . . : /, /, /,: ./.? ? . , . : 董 : 英文摘要 . , . :喜. 鼬 : ? ./. . ?.,飚.~ . . ., .:, , . . : . ? .. ,. . . ? . :;; . : :? . : 英文摘要 . .? : . .. : ? . ? , . ., , . . ? “ .? ; . ? .:,. ,. . 英文摘要’ . .乙,. . 王.,. 孓 . : ;; ; ;;; ;; : , ,? ? , 研究论文 与蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形 态的影响 引 言 正常的心脏功能有赖于体内环境的稳定,有赖于体内众多活性物 质对 心脏功能的协调、精细调节。这些活性物质中许多都是通过其相 应的与 蛋白偶联的受体,激活细胞内信号通路,最终通过不同途径调节 心脏功能。 其中,分别与和蛋白偶联的受体,以及激活这些受体的内源性活 性物质在心脏功能调节中发挥重要作用,有重要的生理和病理学 意义。 与蛋白偶联的受体中,乙酰胆碱和腺苷的受体颇为重要,而它们对心 脏功能的调节方式之一是通过调节心肌细胞的内向整流钾离子通道功能。 内向整流钾通道是钾通道家族的一种,它包括内向整流背景钾电流 ././.,蛋白门控内向整流钾通道./.以 及对敏感的.通道等。其中蛋白偶联的内向整流钾通 可被乙酰胆碱、腺苷等内源性活性物质激活进而影响 道 心肌细胞、神经细胞以及神经内分泌细胞的行为。 由.和.构成的通道在心房肌细胞的电活性中有重 要作用,由于可以被乙酰胆碱激活因此又被称为。乙酰胆碱和腺苷 等内源性活性物质通过激活与蛋白相偶联的各自受体,。等进 而激活,由此介导的负性频率和负性肌力作用和腺苷的抗心律 失常作用。主要存在于心房肌细胞并发挥作用,对于心室肌细胞上 是否存在以及对心室肌细胞兴奋性的作用存在争议。有研究指 出在一些动物心室肌细胞中有通道的表达,而对心室肌细胞中 通道的功能则所知很少。本实验室杨冀杰硕士在正常小鼠心室内 膜 下、外膜下细胞和心衰小鼠外膜下细胞中记录到明显的、成分可能为 的内向整流钾电流,同时发现腺苷可激活一种内向整流钾电流,因此电流 可以被特异性阻断剂阻断,因此认为此电流可能为 电流见杨冀杰硕士论文,。包括钾通道在内的离子通道是构成心 肌动作电位的基础,而心肌动作电位又可以通过兴奋.收缩偶联而影响心 肌功能。因此,本研究将在上述实验结果的基础上,进一步探讨通 研究论文 道是否参与了心室肌的功能调节作用。 ,是 慢性心功能不全充血性心力衰竭, 一种严重的心脏疾病,它是指在有充分的静脉回流的前提下,心脏排出血 量绝对或相对减少,不能满足全身组织器官代谢需要的一种病理状态。心 肌细胞外基质 ,是由胶原、纤维蛋白等组成的, 当时,堆积,胶原量增加,胶原网受到破坏,心肌组织纤维化, 导致心脏的收缩功能和舒张功能障碍。引起堆积的因素有许多,血 管紧张素、去甲肾上腺素、内皮素内等源性活性 物质都参与其中。此外,能促使心内膜下心肌以自分泌、旁分泌方 式产生,可通过蛋白激活使、增加,细胞内钙增 加,产生强烈收缩血管作用和正性肌力作用。 上述与心肌肥厚相关的内源性活性物质的明显共性是这些物质中的 许多能激活蛋白信号通路,这提示蛋白信号通路可能在心肌肥厚 的发生过程中发挥重要作用。事实上,由实验表明蛋白介导的信号能 促进乳鼠心肌细胞的肥大,在培养的心肌细胞中过表达野生型蛋白可 使心肌增生;而表达激活的突变体时,进一步增强了信号,引起 最初的心肌肥大,并最终发展为心肌坏死。这种现象在过表达 的转 基因动物中进一步得到证实。激活后可通过磷脂酶水解细 胞膜上的产生和,后者可激活细胞内钙库上的受体而 释放钙库中的钙。目前对于通路激活后诱发心肌肥厚的详细机制还不 很清楚,其中细胞内钙变化可能是主要的机制。有关通路和细胞内钙 变化的关系有很多争议之处,、等内源性活性物质能增加乳鼠心 肌细胞的钙震荡细胞内钙,但对成年鼠心肌细胞内钙的影响则不能肯定。 本研究的第二部分将使用成年大鼠,观察和对细胞形态学 及细胞钙离子的影响,还将通过转染腺病毒来过表达,并观察过表达 对心肌细胞形态的影响。 研究论文 第一部分 与蛋白相关的乙酰胆碱和腺苷对心肌细胞功能的影响 ‰鱼 莉 曷 乙酰胆碱,、腺苷,等内源性活性物 质有重要的生理作用。这些活性物质通过其相应受体启动细胞信号通路, 通过多种途径影响细胞功能。其中受人关注的是二者对内向整流钾通道功 能的调节作用。内向整流钾通道是钾通道家族的一种,它包括内向整 流背景钾电流././.,蛋白门控内向整流钾通道 ./.以及对敏感的卿.通道等。其中蛋白 偶联的内向整流钾通道 可被乙酰胆碱、腺苷等内源性活 性物质激活进而影响心肌细胞、神经细胞以及神经内分泌细胞的 行为。由 .和瞄.构成的通道在心房肌细胞的电活性中有重要作用 【,,由于可以被乙酰胆碱激活因此又被称为.。乙酰胆碱和腺苷等内 源性活性物质通过激活与蛋白相偶联的各自受体,等进而激 活西,由此介导的负性频率和负性肌力作用和腺苷的抗心律失常 作用【,】。主要存在于心房肌细胞并发挥作用,对于心室肌细胞上是 否存在以及对心室肌细胞兴奋性的作用存在争议。有研究指出 在一些动物心室肌细胞中有通道的表达【】,而对心室肌细胞中 通道的功能则所知很少。本实验室杨冀杰硕士在正常小鼠心室内膜下、外 膜下细胞和心衰小鼠外膜下细胞中记录到明显的、成分可能为的内向 整流钾电流,同时发现腺苷可激活一种内向整流钾电流,因此电流可以被 特异性阻断剂阻断【’】,因此认为此电流可能为电流 见杨冀杰硕士论文,。 包括钾通道在内的离子通道是构成心肌动作电位的基础,而心肌动作 电位又可以通过兴奋.收缩偶联而影响心肌功能。因此,本部分实验的目 的是在上述实验结果的基础上,进一步探讨通道是否参与了心室肌 的功能调节作用。 前期工作中所记录到的心室肌细胞中电流较小,很容易被其它 研究论文 具有相类似特性的内向整流钾电流比如掩盖住【?,因此我们希望 能够有一种特异性的和药理调节剂,能够选择性地抑制 电流而保留电流,以利对的进一步研究。有工作表明, 和对的可能存在的不同敏感性【 ,因此我们首先在表达系统利 用作为选择性作用的工具,观察不同浓度是否可以和 电流分开,依此作为进一步工作的基础。 此后我们将在分离的成年小鼠心室肌细胞上观察啦道激活对心 肌功能的影响。利用可视化动缘探测系. . 可以在单细胞水平观察心肌细胞的检测其收缩/舒张功能。可视化 动缘探测系统由教授实验室建立以来,因其操作简便、直观,可 实时同步记录心肌细胞机械功能变化和细胞内钙瞬变等成为心肌细胞生 理学研究领域应用较广泛的技术之一。 本实验利用腺苷和乙酰胆碱两种 内源性活性物质激活心肌咖道,用通道特异性阻断. 验证此通道的存在。腺苷为内源性嘌呤核苷酸,作用于蛋白偶联的腺苷 受体,有重要的生理功能,也是目前最有效的抗心律失常药之一。腺苷通 过与其受体结合,激活相偶联蛋白进而激活嗍道,激活心房、 房室结、心室的,缩短,降低自律性。腺苷也抑带,此作 用可延长房室结,抑制交感神经兴奋所致的迟后除极。腺昔可被体内 大多数组织细胞所摄取,并被腺苷脱氨酶灭活。乙酰胆碱与心肌细胞膜上 的受体结合,激活相偶联的对敏感的蛋白,随后释放的直接 激活。.可以作为甄别电流的工具】,在许多研究中 表羽.是电流的特异性阻断剂【】。 本实验以嵇.飚.,和砌为代表在非洲爪蟾卵母细胞 中表达并观察了这些?通道的电生理学特性,观察了是否能作为区 别它们的工具药,同时通过观察腺苷和乙酰胆碱两种内源性活性物质对心 室肌细胞收缩功能的影响,来评价脚道在心室肌功能中的作用。为 叙述方便,以下均使用?.和飚.,来代替和砌“ 研究论文 材料与方法 材料 .试剂 各种的均克隆在质粒中,由美国纽约大学西奈山医学院 生理学 系 教授惠赠。 限制性核酸内切酶 日本公司 美国公司 ? 惦鼍 。。。 美国公司 ’ 美国公司 胰蛋白胨和酵母提取物 日本公司 西班牙琼脂糖 西班牙公司 氨苄青霉素 华北制药有限公司 美国公司 胶原酶 美国公司 菌种 上海华美生物公司 拜昂生物公司 ?饱和酚. 拜昂生物公司 水饱和酚. 鼎国生物公司日本公司 诩 日本公司 其他试剂均为国产分析纯 .仪器 型低温高速离心机 德国公司 .电泳仪 美国公司 .型紫外可见光分光北京普析通用仪器有限责任公司 研究论文 光度计 .?超低温冰箱 美国 公司 恒温摇床 德国 公司 恒温水浴箱 德国 公司 摇床 德国 公司 上海福玛公司 生化培养箱 美国公司 纯水机 法国公司 美国公司 放大器 美国公司 信号收集器 .型电极拉制器 美国公司 、.实验动物 公司,选 实验选用非洲爪蟾 购自美国 用的昆明雄性小鼠,购自河北医科大学动物实验中心。 方法 .分子生物学实验】 ..感受态细胞的制备 用接种环挑取冻结的 菌种在平板培养基上轻轻划线,?倒 置恒温培养.。挑取单个茵落到 培养基’,振荡. 小时,待值为...,取出后立即置于冰中,无菌条件下将细 菌分装转移到灭菌的冰预冷的.离心管中,离心后弃去上清,加冰 预 冷的. 重悬菌体,冰浴,离心后弃上清,加冰预冷 的. 轻轻重悬,加%灭菌甘油,.?保存。 液体培养基: 胰蛋白胨 酵母提取物定容至,磅.高压灭菌。 普通固体培养基含.%琼脂: 胰蛋白胨 酵母提取物琼脂粉定容至,磅.高压灭菌,在或 研究论文 无菌培养皿中铺板,培养基层一,室温放至固体化。 ..质粒的转化 感受态加质粒.山,轻轻旋转以混合内容物,冰上放置, ?热休克,不要摇动试管,置于冰上,加入无抗生素 培养基,。摇床转/振摇,取菌液铺于含 / 的琼脂平板,?倒置培养.。 ..质粒的提取 使用小提中量试剂盒离心柱型提取质粒,天根生物公司出 品, 所得的质粒可进行酶切或.?保存。 .. 的体外转录 质粒的线性化 在所插入目的基因的下游用限制性核酸内切酶将环状的质粒线 性化,本部分实验中瞄.通道的线性化所用的限制性核酸内切酶 为 。 ,瞄.通道用 ,和用 ,用限制性核酸内切酶 ? 质粒 .~ 灭菌去离子水补体积至 ? . 琼脂糖凝胶电泳和定量 取山酶切后的反应液用.%的琼脂糖凝胶电泳观察质粒的线 性化是否完全。用紫外分光光度计检测在波长的吸光度 ,时相当于/双链,这样可计算出线性化后 的的量。 线性化的酶切后提纯 进行纯化, 线性化后使用日本 以去除核酸内切酶及其他盐份,纯化步骤按照试剂盒的说明进 行操作。 转录 一 线性化 ..约 研究论文 印置于冰上 . 置于冰上 山 ? 共 去掉模板 在上述反应液中加入无的嵋的模板加 ?,消化模板。 纯化 使用纯化试剂盒离心柱型 .天根生物工程 公司出品,戴帽子和手套,严防酶污染。 .. 的电泳鉴定和定量 由于自然界酶无处不在,电泳要严防酶污染,所用 器具均要用水浸泡,电泳液与琼脂糖凝胶均要用处理的去 离子水配制,电压为,时间为。 的定量:用紫外分光光度计测量样品在波长下的 吸光度值,相当于浓度为/。 .卵母细胞的准备伽 ..卵母细胞的分离 在爪蟾冰冻麻醉状态下,腹部向上放平当爪蟾不能翻身时即可手 术, 于下腹部正中偏外.左右纵向切开一约.的小口,取出足量的卵 母细胞。用.丝线缝合皮肤。 ..卵母细胞的消化 将含卵母细胞的包囊剪成.的小块,在含 /的胶原酶的 &液中室温下在旋转器振荡消化..小时,液的成分为蝴: ., , , ,用调至.。待大多数 细胞呈单个细胞时终止消化。用液反复清洗,并及时挑选出健康 细 ., 胞,保存于液中,液的成分为: , , , ,用调至.。.小时后,经再次筛 选后进行注射。 ..卵母细胞的注射 以爪蟾卵母细胞为表达系统研究通道的功能调节,所需注射 通道剂量在~/卵细胞左右,每个卵细胞注射体积为,由 研究论文 此可算出注射时所需的浓度。我们实验室所用的注射设备是 的微注射枪 。 将滴在干净的上,在显微镜下将吸入注 射枪上的毛细管中。要注意严防酶的污染,将选好的卵母细胞及 液一起放入培养皿的网膜上,仔细调节三维操纵器,以针尖刚刚穿 过细胞膜为宜。注射部位最好选择在卵母细胞的动物极着色深的半球, 根据通道表达情况按每个卵母细胞/注射。注射后的卵母 细胞置于含有/青霉素、,/链霉素、.丙酮酸钠的 液中培养,最适宜的培养温度为.?。 .电生理学实验 ..实验准备 双电极电压钳实验需两只玻璃电极,向电极内灌注含%琼脂糖的 ,加琼脂糖是为了使电极内液呈固态,防止高浓度的进入细胞内。 将灌好的电极装在两个与放大器相连的上,这两个电极分别用 于钳制电压和记录电流,’另一个控制灌流槽内液体的电位。在 灌流槽的前端有灌流液的入口,槽的后端有连接负压真空泵的细管,调节 灌流与负压抽吸的速率使槽内液体呈匀速灌流。在灌流槽的中央有一直径 约为的圆形凹槽,卵母细胞固定其中。灌流液有 ., , , , ,用调至.。? , ., ,用 , 州: , 调至.。?用配制.,.,.,., 。 :。?用配制 ..记录电流 将放大器的置于状态,用三维操纵器将电极尖端移入 和 槽内液体中。按下按钮 使两电极电位显示为零,用 和测量电极电阻,理想的电极电阻应。把两个电极轻轻抵住 卵母细胞的表面一般将卵母细胞深色的动物极朝上,小心刺入细 胞, 注意观察放大器上的电位变化,一旦进入细胞膜电位立即变为负 值如灌 流液为低浓度钾的。将放大器的调制 状态, 调节电容补偿,调节增益,大于和稳定性旋扭, 使电压能够准确而稳定地钳制在所需状态,就可以记录通道电 流。信号的 研究论文 采集和分析软件为.,.。 .采用单细胞动缘检测系统检测细胞功能 ..昆明小鼠心室肌细胞的分离 取.左右的雄性昆明小鼠,腹腔注射%肝素./, 分钟后腹腔注射/戊巴比妥钠.鲫毽,待其麻醉后迅速开胸,在距 离主动脉根部剪断,并保留足够长的主动脉,以便插入和固定灌流系统的 心脏套管。迅速取下心脏,在常温无钙台式液中挤出血液,置于预冷的无 钙台式液预先置于?冰箱中,将心脏上部多余组织修饰去除后将 灌流套管套入主动脉结扎固定,置于中并尽快开 始心脏逆行灌流从开胸到开始灌流时间不超过。操作过程中避免 套管穿过主动脉瓣插入左心室而损伤心脏。.用无钙台式液灌流至心脏血 液完全排出并停止跳动后,再灌流酶液,待酶液充满管后循环灌流 至。当心脏变软后,剪下心室,放到液中,剪碎,室温静置 ,使存活细胞沉淀,滤除大块未消化完全的组织,保留心室肌细胞悬 液,沉降后,更换新鲜液。 、 .、 溶液组成:无钙台式液/: .、 、 . . ; ; ;? 液/: ;. ; ; .; ; 。 . /、 /、 酶液: /、 型胶原酶./ ..检测细胞功能 在倒置显微镜载物台上的细胞灌流槽小室中滴入滴吹散均匀的 钙耐受细胞悬液,给予含./钙离子的氧饱和台式液灌流分钟后, 通过浴槽两侧铂丝电极给予电压,频率,脉宽的持续电场刺激, 在物镜下寻找边缘清晰,膜上无空泡,收缩稳定且无自发性收缩 的细 胞,切换至.物镜,成像于监视器上并实时跟踪细胞边缘,测定细 胞收 缩舒张功能。给以持续刺激,同时灌流 乙酰胆碱及不同浓度的腺 苷, 然后同步检测细胞收缩和舒张功能的变化,以% 收缩幅度, 最大收缩速率和 最大舒张速率的相对变化来评 % % 价细胞舒缩功能的改变,从而推测蝴道在此过程中发挥的作用。 研究论文 .数据处理 电生理实验数据的分析采用.完成;实验数据以硅表示, 各组数据间进行方差分析,以.为显著性差异。 翻七 田 当日 术 疑表达在卵母细胞中通道电流的影响 .鼬 转录结果 .. 质粒线性化的电泳结果 质粒在未线性化之前呈环状,由于环状的质粒会形成不同的二 级结构,故所提取的质粒电泳时出现两条或两条以上的电泳条 带。 在质粒被线性化之后二级结构被打开,此时电泳显示与质粒分子 量相对应 的一条电泳条带。.显示含?.、.和.通道的 经线性化前后的电泳结果。 .. 转录结果 用普通的琼脂糖凝胶电泳方法得到的条带比较弥散,且电泳位 置与其正确分子量不甚符合。因此没有使用。我们用电泳图 来观察是否有转录出目的。.显示飚.、飚.和瞄.通 道转录出的条带。 . 通道在卵母细胞中的表达及的作用 用双电极电压钳方法检测?.,瞄.,.和瞄.通道的电流, 灌流液为高钾的,以得到更大的电流;所设定的钳制 电压为由. 渐变为 ,根据电流随电压的变化可得到通道 的电压电流关系曲线,当给予不同浓度的,通道电流受到不同程 度 的抑锘.。图中横坐标代表电压,纵坐标代表电流,位于横坐标 电流位置上方的电流为外向电流,位于横坐标下方的电流为内向 电流。 已知是通道电流的阻断剂,为的激动剂。我们观察了 . 对瞄.、飚.通道 、 、 、 、 电流的影响,同时观察了上述浓度的对由激活的通 对三种通道电流.电压关系的影响, 道电流的影响。.为 可见对电流的明显抑制。.为不同浓度对通道电流 研究论文 作用的时程图,我们选取了一 和 电压下的硒电流作为观 的外向电 察指标,图.中第二条线代表零电流,此线以上为 流,此线以下为一 时的内向电流,结果显示能够浓度依赖性地 抑制的电流,但对三种通道电流的作用无明显差别,其中给予 后飚./.的电流幅度减少了.%,.电流幅度减少了 %, .电流幅度减少了.%.. 乙酰胆碱及腺苷对心室肌细胞功能的影响 在单细胞动缘检测系统上直接记录了小鼠心室肌细胞的收 缩过程见。给予不同浓度的腺苷,可以发现小鼠心室肌细胞的最 大收缩速率没有明显差异见.;在最大舒张速率上,低浓度腺苷似 乎有抑制作用但无统计学意义见.。在收缩幅度上,.腺苷 对细胞的抑制作用稍强于其它浓度见.;但是经统计处理,各浓度 间的作用没有显著性差异。酰胆碱使最大舒张速率有稍微的增 加, 但与对照相比没有显著性。在.腺苷基础上给予 . 特异阻断剂,也没有发现对心肌功能有明显作用。见.。 研究论文 附 图 ?. ?. 婚. 岣. 阁. 闷. 冲 . 瞄. 飚 .,硒. 八., . .矾. . 研究论文 ‘ ? ’ ,巴二 一?’ ’ ’ 。 ,?? 鬟 【 . &:二/产 ? 三 么 .. ..?‖ .?, ’ ’ 。 ’? 伽岣 ?’ ’ 。 ’ ?? ? 《’ 四: 耋 三 么 .飚.,飚.,./... . 研究论文 . 曲 .. . . .. .飚.】陋.? .?. . 研究论文 ????????????????????????????????????????????????一 ?‘ 州 ?.‘ ??? . ./.,. . .们州由删 . 、 一’一 翰臻 \ ,’ \ /、研究论文 ? ? ? 旺 ? . . . 州.州.州 . . 佗 仙 ? ? ? 旺 ? . . . ..‘‘.州. . 研究论文 . ? ? ? 二墨罂一暑五需 窨 曼 ? 圳州. . . . . .. 涵 . . 至 ;. .乏 暑. 叱 . . 忝秽‘‘蚕. ? . 研究论文 讨 论 在这部分工作中,我们首先在爪蟾卵母细胞中表达了通道并对其 对抑制的敏感性进行了比较研究,结果表明抑制础.、.、 瞄./.的敏感性没有明显差别。我们又观察了乙酰胆碱和腺苷对 小 鼠心室肌细胞功能的影响,结果表明细胞的收缩和舒张功能没有明显改 变。 在卵母细胞能有效地表达外源性编码的相关蛋白,进一步将 蛋白前体分子加工为成熟蛋白,并最终以正确的方向组装在卵母细胞表 面,形成有功能的受体蛋白质,与源组织的天然蛋白具有相同的生化生理 特性【】。利用这种方式,可以成功的将心室肌细胞中难以用普通电生理方 法区别研究的受体和离子通道分子分别移植到体积较大、情况较为简单、 易培养的卵母细胞中。本实验首先将体外转录得来的 飚.,瞄.,./.和胆碱受体注射入爪蟾卵母细胞中, 使其表达通道蛋白,并记录了通道电流。爪蟾卵母细胞是研究离 子通道的功能和调节的良好的表达系统,在离子通道的研究领域应用非常 多,可以作为内向整流钾通道的一个非常合适的表达系统。 有报道指出在心室肌细胞上不同浓度的对和九有不同 敏感性【】。本实验室杨冀杰硕士用全细胞膜片钳技术分别记录正常小鼠 心室内膜下、外膜下细胞和心衰小鼠外膜下细胞中的内向整流钾 电流,并 用 全部阻断该内向电流,但不能完全确定是否能够区分 和.等内向电流,而较小的电流如淹没在大的电流中则很难 对电流在心室肌中的作用进行系统研究。而在心肌细胞中除通 道外还有其它很多离子通道,进一步干扰了对作用的判断。因此本实 验在爪蟾卵母细胞上分别表达通道蛋白,对抑制作用的选择 性进行了系统比较,结果抑制通道电流的敏感性没有不同,因 此无法实现在心室肌细胞上用分开抑制不同电流的目的。 我们在单细胞动缘检测系统上观察了乙酰胆碱和腺苷对心室肌细胞 功能的影响,主要想了解由这些内源性活性物质调节的通道在心室 肌细胞收缩功能的作用。蛋白门控内向整流钾离子通道能通过介导神经 递质的蛋白偶联受体,调节细胞的活动以及功能。飚.和?.主 研究论文 要分布在心房和窦房结细胞中,在调节心脏兴奋性中起重要作用【们,由迷 走神经释放的神经递质乙酰胆碱,通过兴奋型毒 蕈碱样受体以及下游的敏感的蛋白激活?通道,引 起膜动作电位超极化,减少动作电位的频率,减慢心率。通道功能 下调会引起心肌兴奋性增加,心脏迷走神经对心脏的负性调节作用减弱, 这可能是诱导心衰心脏心室肌细胞的动作电位时程延长,兴奋性增加的机 制之一【】。腺苷与细胞膜上的受体结合后,通过激活蛋白逐步引起 的开放,以此发挥调节心血管功能的作用。受体对调节心脏耗氧 以及冠状动脉血液循环有重要作用。激活受体可以抑制心肌细胞, 降低窦房结细胞的频率,使心率减慢。所以腺苷常用于诊断和治疗心动过 速,但也可以引起心脏顿抑【引。在心肌缺血、缺氧时。受体会表达增加, 抑制腺苷酸环化酶使降低,同时在这些病生理情况下也会增 多,起到保护心肌的功能。 除了对心肌电生理特性有影响外,离子通道功能改变也会影响心肌收 缩功能。包括钾通道在内的离子通道是构成心肌动作电位的基础,而心肌 动作电位又可以通过兴奋.收缩偶联而影响心肌功能。有实验在雪貂心室 肌细胞上给予和腺苷,发现细胞在电流钳制的情况下, 收缩减少的幅度可以达到%左右【】。杨冀杰硕士在实验中发现州腺 苷引起内向整流钾电流的增加,而此增加的内向电流可被特异性阻 断剂 .阻断。在本实验中,我们发现不同浓度的腺苷虽对 心室肌细胞的功能有一定影响,但这种影响没有统计学显著性,因而可能 没有实际意义。结合本实验结果以及本实验室前期在心肌电生理方面的实 验结果,我们认为在心房肌细胞中发挥重要作用的通道在心室肌细 胞中的作用甚微,这可能与心房和心室中鼬./.蛋白的表达量有较 大差别有关。虽然如此,在某些疾病状态下心房及心室肌细胞中 ./瞄.蛋白的表达有否会有改变,以及是否由此会有相应的病理学 意义仍值得关注。 研究论文 参考文献, 十.. .: , , .? 十.:, ,, , ..,,: ? . 十, ?: . 八 ,: .. . ,,: . . .. 。 , :: ?.,, . , , 或, :. .,, ., , . . . .,,: , , . 十. . :. , , .,,,: . 研究论文. , , ,:? . ,,. . , , ,十:? , , 温进坤,韩梅。医学分子生物学原理与实验技术。上海科学普及 出版 社。年。 姜泊,张亚历,周殿元。分子生物学常用实验方法。人民军医出版 社。 年。 。离子通道在卵母细胞中的表达和电生理 蒋学俊,李晓艳, 实验方法。中国心脏起博和心电生理杂志,,: ., , ,.,: , ,, . .. , . : ,,:?., . . ,,:. 研究论文 第二部分 与蛋白相关的内源性活性物质对心肌细胞 形态和的影响 ?屿?量 翮 舌 心脏是人和动物体内的重要器官,是人和动物的生命根本,它支 持机 体的生理活动,来实现机体的体液调节,维持机体内环境的相对 恒定。慢 ,是一种严 性心功能不全充血性心力衰竭, 重的心脏疾病,它是指在有充分的静脉回流的前提下,心脏排出 血量绝对 或相对减少,不能满足全身组织器官代谢需要的一种病理状态【】。心肌细 胞外基质 ,是由胶原、纤维蛋白等组成的,当 时,堆积,胶原量增加,胶原网受到破坏,心肌组织纤维化, 导致心脏的收缩功能和舒张功能障碍。引起堆积的因素有许多,血 管紧张素、去甲肾上腺素、内皮素等都参与其中。 此外,能促使心内膜下心肌以自分泌、旁分泌方式产生,可 通过蛋白激活使、增加,细胞内钙增加,产生强烈收缩 血管作用和正性肌力作用】。心肌肥大除了与由机械牵张刺激促进心肌蛋 白的合成有关以外,一些神经体液因素如、、、生长激素、 醛固酮、肾上腺素等也可引起心肌肥大,这些神经体液因素在引起心肌肥 大反应中可能存在协同作用【,】。 上述与心肌肥厚相关的内源性活性物质的明显共性是这些物质中的 许多能激活蛋白信号通路,这提示蛋白信号通路可能在心肌肥厚 的发生过程中发挥重要作用。事实上,由实验表明蛋白介导的信号能 促进乳鼠心肌细胞的肥大,在培养的心肌细胞中过表达野生型蛋白可 使心肌增生【而表达激活的突变体时,进一步增强了信号, 引起最初的心肌肥大,并最终发展为心肌坏死。这种现象在过表达 的转基因动物中进一步得到证实。激活后可通过磷脂酶 水解细胞膜上的产生和,后者可激活细胞内钙库上的 研究论文 受体而释放钙库中的钙。目前对于通路激活后诱发心肌肥厚的详细机 制还不很清楚,其中细胞内钙变化可能是主要的机制。有关通路和细 胞内钙变化的关系有很多争议之处,、等内源性活性物质能增加 乳鼠心肌细胞的钙震荡细胞内钙【,但对成年鼠心肌细胞内钙的影响则不 能肯定。 离体心肌细胞培养方法是常用的研究心肌肥厚发生机制的方法,由于 其有单一性、易进行处理、易对其表型特征进行直接观察,易对其进行成 像、分子生物学、电生理学研究等诸多优点。以往多数有关针对心肌肥厚 的研究多使用未成年动物的心肌细胞,因为分离和培养胚胎期或新生期动 物心肌细胞的实验方法较为成熟,而成年动物的心肌细胞是处于分化终末 期,给分离和培养带来困难【。。此外,离体培养的乳鼠或胎鼠的心肌细 胞容易造成心肌肥厚模型,而来源于成年动物的心肌细胞则较难,提示心 肌细胞的发育程度会影响其对生理病理性刺激的反应,由此并考虑到心肌 肥厚研究的临床意义,建立并利用成年动物心肌细胞培养方法就有了重要 意义。 本部分实验使用成年大鼠,利用生物酶灌流法分离其心室肌细 胞,建立了这种细胞的无菌培养方法,在此基础上,我们观察了 细胞形态学及细胞钙离子的影响,我们又通过转染腺病毒来过表达, 并观察了过表达对心肌细胞形态和细胞内的影响。这些结果为 将来的进一步研究奠定了基础。 材料与方法 材料 .试剂 牛磺酸 日本公司 美国公司 型胶原酶 公司 乙酰胆碱 日本公司 腺苷 美国公司