短小芽孢杆菌E601传代和中子辐照后的菌落形态变化

短小芽孢杆菌E601传代和中子辐照后的菌落形态变化 短小芽孢杆菌E601传代和中子辐照后的菌 落形态变化 核农2008,22(3):291,295 JournalofNuclearAgriculturalSciences 文章编号:1000—8551(2008)03—291—05 291 短小芽孢杆菌E601传代和中子辐照后的菌落形态变化 陈晓明魏宝丽张建国 (1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳621010; 2.西南科技大学核废物与环境安全国防重点实验室,四川绵阳621010) 摘要:为研究短小芽孢杆菌E601不同形态茵落分布情况及中子辐照对其影响,对短小芽孢杆菌不同形 态茵落进行了反复传代,并采用CFBR一11快中子脉冲反应堆分别对不透明菌落进行了低,中,高剂量的 一 次中子辐照和二次中子辐照,发现:(1)在正常传代条件下,E601短小芽孢杆菌有半透明型和不透明 型菌落存在;(2)经反复传代,半透明茵落可产生各占一半的半透明型与不透明型两种菌落形态,而不透 明茵落基本不产生半透明菌落;(3)中子辐照对茵落分布影响较大,随着一次中子辐照剂量的升高,半透 明菌落所占的比例逐渐增加;当中子二次辐照剂量最高时,半透明茵落所占比例最大.因此认为E601 短小芽孢杆菌之所以能产生两种不同形态菌落,主要是由半透明菌落的不稳定性决定的.在中子辐照 中,半透明菌落型菌株耐辐照能力高于不透明型茵落菌株. 关键词:短小芽孢杆菌E601(Bacilluspumilus);辐照灭菌;菌落形态 CoLoNYFoI压VAIuATIoNoFBaciUusPumilusE6O1AFTERCULTURED ANDNEUTRoNIRRADIATIoN CHENXiao—ming一WEIBao—liZHANGJian—guo (1.LifeScienceandEngineeringCollege,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang,Sichuan621010; 2.,J咖 riseKeyLaboratoryofNuclearWastesandEnvironmentalSafety,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang,Sichuan621010) Abstract:ThedistributionoftwocolonyformsofBacilluspumilusE601andtheeffectofneutronirradiationonthecolonyfoITI1 werereported.Thetranslucentandopaquecolonieswereculturedseveralgenerationstoobservetheproportionoftwoform colonies.Thesporesofopaquecolonywereirradiatedat80,800and2000GyoffastneutronfromCFBR一11pulsepile,and thesurvivorsofopaquecolonywereirradiatedagainatthesamedoses.Theresultsshowedthat:(1)BacilluspumilusE601 observedtwotypesofcolonyform:translucentandopaquecolony;(2)thetranslucentcolonycouldproducebothtranslucent andopaquecoloniesinequal,whiletheopaquecolonycouldn'tproducetranslucentcolonygenerally;(3)neutronirradiation couldaffectthecolonyformdistribution.Theratioofsurvivaltranslucentcolonywasinereasedwiththeinereaseofthefirst neutronirradiationdoses,andthesecondneutronirradiationalsoinereasedtheratiooftranslucentcolony.Itwasconcluded thattheinstabilityoftranslucentcolonywasthemainreasontoproducetwocolonyformsofBacilluspumilusE601.Thestrain oftranslucentcolonyhadastrongerabilitytoresistneutronirradiationthantheopaquecolony. Keywords:BacilluspumilusE601;irradiationsterilization;eolony\'form 短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)为芽孢杆菌属,菌 体细杆状,一般为0.6,0.7ffmX2.0,3.0ffm,革兰氏 阳性.在辐照灭菌研究中短小芽孢杆菌被广泛应 用,是抗电离辐照较强的细菌.许多国家都把短小芽 收稿日期:2007—08—15接受日期:2007—10—10 基金项目:西南科技大学核废物与环境安全国防重点学科实验室基金项目(07JGZB07);中物院预研基金项目(052056);西南科技大学博士基金 作者简介:陈晓明(1970一),女,四川遂宁人,博士,副教授,主要从事辐射微生物效应及机理研究.Tel:0816—6089530,Fax:0816—6089521:E-mail: cxmhyx99@163.corn 核农22卷 孢杆菌作为电离辐照灭菌的指示菌.我国1991年初 步确定将短小芽孢杆菌E601(ATCC27142)作为检测 电离辐照灭菌效果的指示菌. 中子辐照穿透力很强又携带高能量,很容易造 成生物体细胞内的DNA断裂而引起细胞以及菌体的 死亡].我们采用短小芽孢杆菌E601作为中子辐照 灭菌效果指示菌的研究中发现,短小芽孢杆菌E601有 两种不同的菌落形态,经中子辐照后菌落形态有不同 的变化.采用不同菌落形态的E601进行研究可能对 评估中子辐照灭菌的影响有差异,本文研究短小芽孢 杆菌的菌落传代变化及中子辐照对短小芽孢杆菌的菌 落形态的影响,旨在为进一步研究中子辐照灭菌机理 提供依据. l材料与方法 1.1材料 菌株为短小芽孢杆菌E601(Bacilluspumilus)ATCC 27142,购于美国ATCC菌种库.基本培养基(营养肉 汁琼脂)组成:蛋白胨5g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂 25g,蒸馏水1000ml,pH7.2. 1.2方法 1.2.1原始菌落形态变化研究从原始斜面菌种中 挑取少许菌体进行稀释涂平板,记为1代,将平板放入 37?恒温培养箱培养48h,记录两种菌落形态的分布 情况.再从1代平板中分别挑取半透明与不透明菌落 进行稀释涂平板,记为2代半透明与不透明.分别用 前1代的半透明菌落与不透明菌落进行传代,每2d传 代1次,共传至4代. 1.2.2中子一次辐照随机挑取3个不透明菌落,记 菌落1,菌落2和菌落3,分别进行平皿扩大,于37c【=恒 温培养箱中培养7—8d左右,进行芽孢染色,检测芽孢 率.待芽孢率达到95%以上时,刮下菌苔,于装有PBS 缓冲液的三角瓶中充分打散,混匀于45?水浴断链24h, 每隔4h摇晃1次,使芽孢分散成为单个个体.将芽孢 悬液充分混匀,每个样品分装于2ml冻存管中,存放于 4?冰箱备用.每个样品3个重复. 备用样品在中国工程物理研究院核物理与化学研 究所的CFBR一?快中子脉冲反应堆上,按辐照剂量低, 中,高原则分别采用80,800和2000Gy进行快中子辐 照,辐照剂量率为7.4Gy/min,照射时间分别为11,108 和270min. 1.2.3中子二次辐照从一次中子辐照后存活平板 中随机挑取3个不透明菌落,记为菌落1,菌落2和菌 落3,分别进行平皿扩大,放在37c【=恒温培养箱中培 养.待培养7—8d左右进行芽孢染色检测芽孢率.以 后的操作同一次辐照.并同样按辐照剂量低,中,高原 则分别采用80,800和2000Gy剂量对样品进行二次中 子辐照. I.2.4辐照后样品处理将辐照后的样品取100gl倍 比稀释到适当浓度(通常做2个稀释度),取100gl涂 平板(每个稀释度涂3个平板),然后将平板放入37? 恒温培养箱培养48h后记数,以菌落数在30—300之 间为有效数据,统计两种形态菌落分布情况. 2结果 2.1原始菌落传代过程中的形态变化 2.11原始菌落的形态由图1可看出,原始菌株中 存在两种菌落形态,不透明菌落呈乳白色,光滑,菌落 较小,占大部分.半透明菌落只约占16%,菌落呈米 黄色,光滑,湿润.随着时间的增加,不透明菌落边缘 开始皱缩,呈锯齿状.这种情况与美国ATCC库指明 的菌落形态一致. 图1原始菌株菌落形态 Fig.1Thecolonyf0rmsofofiginMBaciEuspumilus 2.1.2半透明菌落传代情况用半透明菌落进行传 代分离,得到的两种菌落形态基本各占一半(见图2). 从图2可看出,半透明菌落传代后,所产生的半透明菌 落米黄色,湿润,边缘不规则,呈锯齿状;不透明菌落比 半透明菌落小,光滑,颜色比原始不透明菌落的颜色偏 黄,随着时间的增加,菌落中间略皱缩突起. 2.1.3不透明茵落传代情况由不透明菌落进行传 代分离得到的半透明菌落非常少,而且随着传代次数 的增加而减少,到了第4代就基本没有半透明菌落产 ,不透明菌落传代后,传代 生(见图3).从图3可看出 分离的前2代只产生1%左右的半透明菌落,且菌落 没有由半透明菌落传代得出的半透明菌落大,边缘呈 锯齿状,呈米黄色,湿润.不透明菌落小,呈乳白色,但 3期短小芽孢杆菌E601传代和中子辐照后的菌落形态变化293 (a)(b) 图2半透明菌落传1代(a)和2代(b)的菌落观察 Fig.2Thefirst(a)andsecond(b)generationculturedfromtranslucentcolony 图3不透明菌落传1代(a)和2代(b)的菌落观察 Fig.3Thefirst(a)andsecond(b)generationculturedfromopaquecolony 比原始不透明菌落偏黄,光滑,突起. 综上所述,可将原始菌株传代过程中菌落形态变 化情况归纳为图4.由图4可大致推出,短小芽孢杆 菌之所以能产生两种不同形态菌落,主要是由于半透 明菌落的不稳定性决定的,而不透明菌落基本保持稳 定. 2.2中子辐照对菌落形态的影响 2.2.1中子一次辐照对菌落形态的影响经过中子 一 次辐照后的不透明菌落初始光滑,湿润,随着时间的 增加,有些菌落变得亮白,呈不透明状,菌落中间开始 皱缩,边缘出现褶皱;有些则呈半透明状,颜色比不透 明菌落黄,光滑.随着时间的增加,菌落边缘呈锯齿 状.中子一次辐照对菌落的影响见表1,以半透明菌落 为统计指标. 由表1可以看出,随着一次中子辐照剂量的升高, 半透明菌落所占比例也逐渐增加,远远超过原始菌株 传代时的1.54%(见图4). 表1中子一次辐照不透明菌落后对两种菌落比例的影响 TablelTheeffectoffirstneutronirradiation oncolonyproportionfromtreatedopaquecolony 中子剂量半透明菌落比例 O 80 800 2(x)0 1.54 1.51 9.37 14.O8 2.2.2中子二次辐照对菌落形态的影响经过中子 二次辐照后不透明菌落容易皱缩,变得干燥;半透明菌 落光滑,随着时间的增加,边缘也开始皱缩,呈锯齿状. 中子二次辐照对菌落的影响见表2,以半透明菌落为 统计指标. 由表2看出,当中子一次和二次辐照剂量均为最 大值2000Gy时,半透明菌落所占比例最大,且随中子 一 次辐照剂量的增加,二次中子辐照的各剂量中,半透 明菌落所占比例也逐渐增加,且都远远高于原始菌株 核农22卷 斜面slant J酩吨 半透明菌落不透明菌落 translucentcolonyopaquecolony /(47.5%\/\/(I.54%) 半透明菌落不透明菌落半透明茵落 translucentcolonyopaquecolonytranslucentcolony ?瑚 半透明茵落translucentcolony(50.25%) \ 不透明茵落 opaquecolony (0.73%) 不透明.d.....% 图4原始菌株传代4过程中的菌落变化 Fig.4'ThecolonyvariationculturedfromtheoriginalityBacilluspumilusfor4generations 图中半透明菌落表示用半透明菌落进行传代分离,不透明菌落则表示用不透明菌落进行传代分离. 图中括号中的数值均以传代后半透明菌落占总菌落比例来表示. Theword"translucentcolony"meanspassageisprocessedwiththiscolony,andSOdoesopaq uecolony. Inthisfigure,thevalueintheparenthesesisrepresentedbytranslucentcolonyproportion. 传代时的1.54%. 表2经二次中子辐照的不透明菌落的菌落形态分布 Table2Thecolonyformdistributionofopaquecolony aftertWOtimesneutronirradiation(%) 一 次中子辐照剂量 firstneutronirradiation dose(Gy) 二次中子辐照剂量 secondneutronirradiationdose(Gv) 808002000 注:表中数据皆以半透明菌落所占比例计. Note:Thedatainthetablemeantheproportionoftranslucentcolony. 从表1,表2的数据可看出,中子辐照对短小芽孢 杆菌两种菌落的损伤程度不同.不透明菌落的耐辐照 能力逊于半透明菌落,且这种差异在中子二次辐照时 表现更明显. 本试验结果表明,在未辐照情况下,短小芽孢杆菌 的半透明菌落能产生半透明的光滑型菌落和不透明的 光滑型菌落,且所占比例基本相近(图2).而不透明 菌落在前3次传代过程中只产生少许的半透明菌落, 第2代中半透明菌落比例只有1.54%,第3代中却只 产生了0.73%的半透明菌落,到了第4代不产生半透 明型菌落.在培养过程中发现,两种菌落初始的颜色 形态相同,都表现为光滑,湿润,呈米黄色,随着时间的 增加,菌落逐渐变大,不透明菌落从米黄色变为乳白 色,而半透明菌落颜色不变,菌落边缘开始皱缩,随着 时问的再增加,菌落中央也开始皱缩.在伴放线放线 杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,Aa)和 EscherichiocoliK一12的固体培养中也存在类似的报 道'.但关于辐照对不同菌落分布的影响至今还未 见报道.从本研究中得知,辐照对短小芽孢杆菌两种 菌落形态的菌株损伤程度不同,半透明菌落菌株耐辐 照能力稍强,因此,在讨论电离辐照灭菌的可行性时, 有必要注明采用的短小芽孢杆菌的不同菌落菌株的分 布情况,以便更可靠,准确地进行灭菌效果的评估. Haase等最近描述了Aa液体培养的形态学变 化.本研究主要考察了固体培养条件下菌落形态的变 化,有关液体培养条件下的情况还有待考察.由于中 子辐照的样品来源均为不透明菌落,研究中子辐照对 半透明菌落的影响可能将对研究辐照损伤机理提供更 大依据.同时电离辐射也是引起微生物变异的重要因 素,考察中子辐照对菌落形态的变化有利于进一步 阐述电离辐射对微生物的影响. 短小芽孢杆菌是抗电离辐射较强的细菌,常作为 检测电离辐射灭菌效果的指示菌.已有显示多种 因素可影响电离辐射灭菌效果,如初始菌含量,剂量 率,温度,介质等.从本研究可看出,短小芽孢杆菌 的不同菌落形式的菌株数量也可能会对灭菌效果造成 影响.为了使辐照灭菌指示菌在灭菌过程中的应用标 准化,规范化,保证灭菌质量,在确定辐照灭菌剂量时 应考虑到这一点'J. JournalofNuclearAgriculturalSciences 2008,22(3):291,295 由于短小芽孢杆菌存在半透明型和不透明型两种 不同的菌落形态,对两种菌落分别进行传代,半透明菌 落能产生半透明和不透明型菌落,且基本各占一半. 而不透明菌落在传代过程中只产生少许的半透明菌 落,且传至第4代时半透明型菌落消失.因此认为短 小芽孢杆菌之所以能产生两种不同形态菌落,主要是 由于半透明菌落的不稳定性决定的,而不透明菌落基 本保持稳定.中子辐照对短小芽孢杆菌的菌落形态分 布有较大的影响,半透明菌落型菌株耐辐照能力高于 不透明菌落型菌株. 参考文献: [1] [2] [3] [4] [5] 王勇,李成林,等.电子束对短小杆菌E601和炭痘杆菌芽孢 杀灭性能研究.辐射防护通讯,2003,23(4):32,34 耿彦生,袁洽勖,等.短小芽孢杆菌E一(601)抗电离辐射性的研 究.中华流行病学杂志,1999,20(6):334—337 张文福.医学消毒学.北京:军事医学出版社,2002:114—122 谢崇华,王丹,郑春,陈永军,王英,罗洁,廖伟.中子 辐照及其与赤霉素复合处理水稻种子对其苗期生长的影响.核 农,2007,21(3):212—216 LowyRJ,VavrinaGA,Laba/TeDD.Comparisonof7andneutron radiationinactivationofInfluenzaAvirus.AntiviralResearch,2001,52 295 (3):261—273 [6]InouyeT,OhtaH,KokeguchiS,eta1.Colonialvariationand fimbrlationofActinobacillusactinomycetemcomhans.FEMSMicrobiol Lett.1990.69:13一l8 [7]王者玲,NobukoM,等.伴放线放线杆菌菌落生长形态变化的观 察.中华口腔医学杂志,2003,38(1):52,55 [8]HasmanH,SchembriMA,KlemmP.Antigen43andtype1fimbriae determinecolonymorphologyofEscherichiacoliK一12.JBacterial, 2000,182(…4):1089,1095 [9]HaaseEM,ZmudaJL,ScannapiecoFA.Identificationandmolecular analysisofrough--colony--specificoutermembraneproteinsof Actinobacillusactinomycetemcomitans.InfectImmun,1999,67:2901, 2908 [10]沈娟,陆兆新.N注入诱变芽孢杆菌选育高产抗菌物质菌株. 核农,2006,20(4,11.296,298 [11]陈晓明,谭碧生,张建国,郑春,罗娟,孙颖,楚士晋,任正 隆.快中子辐照对枯草芽孢杆菌的灭菌效果研究.辐射研究与辐 射工艺,2007,25(3):f,5 I12]FurutaM,SuwaT,KuwabaraY,eta1.Electron—beamsterilizationof laboratoryanimaldiets——sterilizi"geffectofl0一MeVelectronsfroma linearaccelerator.Exp-Anim,2002,51(4)::327,334 [13]SetlowP.SporesofBacillussubtilis:their:resistancetoandkillingby radiation,heatandchemicals.JApplMicmbiol,2006,101(3):514— 525 (上接第323页) [7]FuhrmannM,LasatMM,EbbsSD,KoehianLV,ComishJ.Uptake ofCesium-137andStrontium-90fromContaminatedSoilbyThreePlant Species;ApplicationtoPhytoremediation.PlantandEnvironment Interactions,2002,31:904—909 [8]MalekMA,HintonTG,WebbSB.Ac0mparison0fSrandCs uptakeinplantsviathreepathwaysattwoChernobylcontaminatedsites. 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