果蝇唾腺染色体的几种染色方法比较

果蝇唾腺染色体的几种染色比较 双翅类昆虫如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的唾腺染色体(Salivary chromosome)比普通染色体大的多，处于体细胞同源染色体的配对状态，是由于唾腺染色体经过多次复制而并不分开形成的，大约有1000,4000根染色体丝的拷贝，故又称为多线染色体(Poly, tene chromosome)。它是观察染色体形态、研究染色体结构变异等的好材料。制作果蝇唾腺染色体标本的染色方法一般有3种:醋酸洋红法、苯酚品红法和孚尔根(Feuglen)染色法(除此之外还有其他方法)、各种方法都有其自身的特点及适用的条件，因此没有1种染色方法是普遍适用完美无缺的。现将3种常用方法的优缺点分述如下，并提出1个实用的永久封片制作方法。 一、醋酸洋红法 洋红的常用浓度为0.5%,1.0%，醋酸常用浓度为45%,50%，一般现配挪用较好。洋红是从胭脂虫(Coccrs cacti)的雌虫中提取的作为染料的提取物,提取物的品质因胭脂虫的种类而异，是一种混合物，其中具有染色活性的是洋红酸。洋红酸是一种二元弱酸，如果 溶于碱性溶液中，则具有酸性染料的性质，可使细胞质着色;如果溶于酸性溶液中，则具有磁性染料的性质，可使染色质(体)着色。此法多用满架法，快速简便，为改进其染色效果，也可采用浸染法，并辅以火焰微热(即滴加醋酸洋红盖片后在酒精灯火焰上微热)，增加本底清晰度，加大反差。 醋酸洋红的配制和染色都比较简中，对细胞穿透力较强，这是其主要优点，此外它对染色体和核仁均对染色，故也适用于减数分裂的细胞染色。但其染色强度和分色效果不及其他染色剂，通常只作临时染色观察，不用于制作永久性装片。 也可以用醋酸地衣红替代洋红，这样细胞质着色较少，效果较好。 二、孚尔根染色法 孚尔根染色法是常用于鉴别细胞中DNA的一种组织化学方法，细胞核经过温和的盐酸的水解作用(I mol HCI，60?而破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键，这样嘌呤碱脱掉而使脱氧核糖的第1个碳原子上潜在的醛基获得自由状态。自由醛基能够与脱色的碱性品红即Schiff试剂反应生成紫红色复合物。 孚尔根染色法的优点是通常只对细胞核和染色体着色，染色均匀一致，背景清晰，组织软化较好，易于压片。缺点是染色体经过染色后，由于染色时间较长(一般在1,2h，动物细胞略短一些)，Schiff试剂中所含的盐酸往往使其过度软化。因此在压片时染色体不易分 散而易于重叠或粘连，这是它不如苯酚品红染色的主要缺点。另外一个主要缺点是水解条件必须严格控制，l mol HCI水解温度应在 60士1?(某些情况下需要控制在60士0.5?)，因为温度过高或时间过长会造成水解过度，糖与醛基之间的键破坏过大，醛基流失到水解 液中，则染色体不均匀着色或染色稍深但细胞质着色，或者出现大小不等的红色小粒;反之，染色体着色浅淡、细胞质中可能有其他醛基存在而呈现扩散的红色。可见，只有水解合适才能使染色体着色较深而细胞质不显示任何颜色。 染色反应须在低温(10?左右)、黑暗、尽可能减少氧化的条件下进行，否则氧化生成的也会影响反应的颜色表现，因此孚尔根染色法宜用浸染法，而不宜用液染。此外染SO2 色后一般还需用漂洗液和蒸馏水漂洗，这些操作对于较小的果蝇唾腺来说不太适宜，因为材 料容易在染色、漂洗等操作过程中丢失。 三、苯酚品红染色法 现常用改良的苯酚品红染色法，它是卡宝品红(Carbol fuchsin)经过山梨醇改良的，也是目前应用最为广泛的一种优良的核和染色体的染色剂。它既具有醋酸洋红的染色简便、快 速的特点，又同时具有孚尔根反应的分色清晰的优点，采用滴染和浸染均可。用此法制得的染色体具有耐保存、高稳定、持久不褪色的优点，这是前两种染色方法所不及的。虽然其缺点仍然是杂色效果与盐酸的解离条件密切相关，但与孚尔根染色法相比，它对温度条件不是很苛刻，只是当解离时间太短时，细胞质会不同程度的着色，当解离过度时染色体不易着色，当然背景也不会有色。只有在合适的解离条件下染色体着色紫红，细胞质无色或有极淡的红色。另外染液的配制和保存也比Schiff试剂简单，而且其杂色能力随着放置的时间越久染色效果越好，通常可在常温下存放两年而保持稳定不变质，低温保存时间更长。 四、一种实用的果蝇唾腺染色体永久封片制作方法 根据各种染色方法的优缺点可以针对传统常规方法的“弊病”进行有益的改进。几个主要改进点列举如下: 1)果蝇三龄幼虫的专门培养(另文介绍):可以培养出形体比通常大出约l,3的硕大三龄幼虫，便于唾腺的拉取。 2)唾腺的各项操作均在载片上进行，有利于防止材料的丢失。 3)染色前唾腺适度低渗:往唾液腺上滴一滴质量浓度为0.4,的NaCI溶液，低渗处理2min，使唾液腺充分膨胀。 4)适度水解:用小片吸水纸吸除水分及组织(当心切勿将唾液腺吸走);在唾液腺上满1滴lmol的HCI，根据唾腺的大小室温下水解l,2min。然后用蒸馏水反复滴几次，洗去盐酸(一边滴清水，一边用吸水纸从材料旁边吸水)，再用吸水纸吸干周围的水分。 5)火焰微热压片:满染法染色至唾腺通体紫红后，换成45,乙酸，并在酒精灯火焰上过火，使载片稳热(用手背对准材料接触载片下面，以不烫手为合适)，增加本底清晰度。 6)国产光学树脂胶快速封片:用适当温度的水浴将光学树脂胶融化，粘度以挑起时不拉长丝为佳。用探针挑取光学树脂胶均匀涂抹于盖片四周封住盖片，注意勿搓动盖片。烘干或晾干即成为一张永久封片，可以永久保存。