微管在小鼠孤雌激活、体外受精和核移植早期胚胎发育过程中的动态

微管在小鼠孤雌激活、体外受精和核移植早期胚胎发育过程中的动态 徽管在小鼠孤雌澈活、体外受精和核移檀早期胚胎发育过程中的动态变化 中文摘要目的研究小鼠孤雌活化、体外受精(，,,)与核移植早期胚胎发育过程中，微管蛋白,—,,,,,,,在减数分裂期间的动态变化。方法本实验首先研究老化对卵母细胞孤雌激活发育率以及老化对减数分裂期间微管动态变化的影响;并比较，,,胚胎、氯化锯激活的孤雌胚胎和体内受精的原核期胚胎体外发育率的差异;采用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术检测卵母细胞在孤雌激活、，,,、核移植过程中微管及核的动态变化，以微管在减数分裂过程中的作用及其对早期胚胎发育的影响。结果注射,;,后,,,到,,,，卵母细胞在体外老化过程中激活率和发育率呈上升趋势，但是差异不显著;短时间的体外老化可以使卵母细胞更容易被激活，且微管发育更完善。体内受精各阶段的发育率显著高于，,,和孤雌激活，而，,,与孤雌激活各阶段发育率差别不显著。孤雌活化过程中，。卵母细胞恢复减数分裂，姐妹染色单体分离，被拉向两极，经,,处理后，活化,,, ,，卵周隙中未见,,。，而在胞质中出现两个混合的单倍体原核，之间由微管相连接。在，忭中，精子进入，激活卵母细胞，减数分裂恢复，纺锤丝牵拉赤道上的母源染色体向纺锤体两侧迁移:末期时，卵母细胞排出,,，，解聚的雌性染色体形成雌原核，微管分布于,,。和雌原核之间。同时，精子染色质发生去浓缩与再浓缩，形成雄原核。在原核形成的同时，胞质星体在雌雄原核的周围重组形成长的微管，负责雌、雄原核的迁移靠近。在核移植后的孤雌激活过程中，活化,,，纺锤体组装完成，,,时，移入的成纤维细胞核的同源染色体出现混乱，聚集的染色单体不对称分离，被纺锤体拉向多极，,—,,时，卵周隙中未见,,,，而在胞质中出现多个类原核，含有清晰的多核仁结构，类原核之间由微管相连。结论短时间的体外老化可以使卵母细胞容易被激活，且微管发育更完善。化学活化比，,,容易激活卵母细胞，减数分裂期间微管的发育早且完善。与，,,、孤雌活化的卵相比较，核移植后卵更容易被激活，同源染色体随机分离，但易出现异常，形成多个类原核。 关键词:孤雌活化，体外受精，核移植，微管，激光共聚焦 , 堕玺堡匡墼盔兰堡主兰垡丝塞 (——— ,)，,,,,; ;,,?,鹤,, ,,;,,,，,,,,, ,, ,,,,,,肿,,,,,,;，,,,柚, ,,;,,,, ,,,,,,,, ;，,,,, ,,,,, ,,,，了,, ,,,,,,;, ,,,盹,,,, ,, ,;,,, ,)啪血; 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,,,,,,,,,(,,,,)蛋白是位于未受精的卵母细胞的减数分裂纺锤体两极，在未受精的减数分裂和受精的有丝分裂中，,,舭对于纺锤体极的装配、在中心体的聚集起着重要的作用啪,。核移植时，它在引入供体细胞之前被移除，因此。减数分裂纺锤体的移除减少了,,,,的卵质，其对有丝分裂纺锤体极的生成是极其重要的。减数分裂纺锤体移除可能是核移植异常的原因之一,,。在四倍体中，同源染色体沿着,,,,，也就是带有中心小体的两极纺锤体排列。核移植的有丝分裂纺锤体能够通过精子尾区别受精的纺锤体。重建的卵母细胞受精后引起正常的分裂…,。所以，如果减数分裂纺锤体未受 , 徽管在小鼠孤雌擞活、体外受精和核移植早期胚胎发育过程中的动态变化损，其本身的有丝分裂纺锤体就会聚集在常染色体周围。相对于其他的哺乳动物，灵长类核移植更困难，可能是由于它对有丝分裂纺锤体有更严格的分子组成要求嘲。在牛，体细胞的中心体是在核移植时转移进去的汹,，然而，小鼠是依赖卵母细胞的母源性中心体渊。在核移植时，因为减数分裂的纺锤体移除对核移植的失败起着重要作用，,,,和微管的成像出现有丝分裂纺锤体的混乱和同源染色体的失调。卵裂可继续，但是不对称的染色体分离产生了异倍体胚胎嘲,。 (二);,处理 孤雌激活和核移植用;,处理时，姐妹染色单体正常分离，但纺锤体始终与质膜平行，表明纺锤体旋转受抑制，但核分裂不受影响，纺锤体的旋转是极体捧放的前提。纺锤体旋转的抑制，卵周隙中未见,,,，而是在胞质中出现两原核，之间由中心体相连阚。微丝并非控制染色体本身的运动，而是控制染色体附着的纺锤体的运动。因为,,处理解聚微丝不影响染色体分离，但随后的纺锤体旋转和胞质的分裂被抑制，表明微丝是参与纺锤体旋转和胞质分裂的关键因素九。微丝控制了纺锤体的旋转，一旦旋转结束，微丝可能就开始解聚，因为,,:排出时卵皮质已基本没有微丝聚集，说明极体的最终排出过程不需微丝参与，小鼠卵原核向中央的迁移受微丝控制，因此，原核形成后，去组装的微丝还要重新组装啪,。;,处理,,时，,,:排放被不可逆地抑制，可能是因为在纺锤体旋转和极体排放的关键时期受到,,解聚微丝的作用，即使洗去;,，但纺锤体旋转的时空条件已不再具备，因此旋转不能恢复，,,。不能延迟排放,, (三)重构胚的发育 重构胚的发育，主要的影响因素有如下几点: ,、核的有丝分裂装置 核的有丝分裂装置 在未受精的减数分裂和受精的有丝分裂中，对于纺锤体极的装配、在中心体聚集起着重要的作用。在核移植后，核的有丝分裂装置在异常的有丝分裂纺锤体或在摘出的卵母细胞中未检测出“”。 ,、极体形成 , 哈尔演医科大学硕士学位论文 用,?期卵母细胞为受体进行的胚胎重建中还有一个极体形成的问题。在受精卵中，极体形成移出了一半的雌性遗传物质，所以雌核是单倍体“,,。在重构卵中，移入核的极体形成会产生什么效应, ,、成熟促进因子(,,,)的作用 肝,的活性在卵母细胞成熟的第一次和第二次减数分裂中期达到最高，帅,水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制“”。肝,与有丝分裂原激活蛋白激酶(姒,,)共同参与卵子的成熟过程。姒,,通过增加,,,的活性促进,,,,;而;,肝则能抑制,,,活性，使奸,处于非活性状态，从而阻止卵子完成减数分裂,,。 细胞骨架在核移植重构胚的激活中究竟起怎样的作用,核移植胚胎发育过程中细胞骨架的空间状态如何,这些问题的研究将为解决核移植胚胎发育缓慢，核移植效率低等问题带来新的思路，使核移植技术更好的造福于人类。 四、细胞骨架存在的问题与展望 近年来，借助于对细胞周期调控研究所取得的成果，以及生化分析与胚胎学的结合，使人们得以在分子水平上描述参与调节卵母细胞成熟和受精中细胞骨架系统的信号途径。但在哺乳动物卵母细胞成熟受精和核移植过程中，细胞骨架及其信号转导调控机制仍有许多尚未阐明的问题“”，与体细胞中细胞骨架系统的研究而言，对卵母细胞和早期胚胎中细胞骨架组装和功能的研究缺乏系统性，这些都有待于更深入的研究，这将仍是当前细胞生物学和发育生物学研究的热点。 锻管在小鼠孤雌激活、体外受精和核移植早期胚胎毖育过程中的动态变化 前 言 细胞骨架对哺乳动物卵母细胞发育进程十分重要，其组织和结构发生了一系列明显的变化，在遗传物质的迁移、极体的排放、原核迁移及早期卵裂等事件中发挥重要的作用。但目前对细胞骨架重组与卵母细胞减数分裂成熟、受精、孤雌激活和核移植之间的关系这些闯题仍缺乏系统的研究。本实验通过核移植、，,,和对小鼠卵母细胞的活化处理诱导减数分裂的恢复，以体外培养的方法来观察受精胚胎的发育情况:采用免疫荧光化学与激光共.