幽门螺杆菌ureB基因转染胃上皮细胞及其对细胞的作用

幽门螺杆菌ureB基因转染胃上皮细胞及其对细胞的作用 幽门螺杆菌ureB基因转染胃上皮细胞及其 对细胞的作用 45卷1期 2005年2月 微生物 ActaMicrobioiogicaSinica Vo1.45No.1 February2005 幽门螺杆菌ureB基因转染胃上皮细胞及其对细胞的作用 张静余菲菲陈月秀陈豪 (福建医科大学病原生物学系福州350004) 摘要:研究幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,)ureB基因重组子转染胃上皮细胞后对胃上皮细胞的作用.用PCR 从标准株NCTC11637中获取ureB全长基因,将其开放读码框架定向克隆人真核表达载体pcDNA3.1;获得 筛选耐潮霉素的细胞克隆,用RT-PCR方法检测细胞的重组子转染SGC.7901细胞, 内ureB基因在转录水平的表达; 分别用荧光染色技术,MTI',流式细胞术检测UreB对细胞表型,增殖,凋亡及细胞周期的影响.UreB阳性表达的细 胞(SureB)胞膜出芽,细胞皱缩;用MTI"法检测细胞增殖,结果表明,SureB细胞与SpcDNA3.1细胞比较(pcDNA3.1转 染的细胞),生长增殖无显着性差异(P>0.05),流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,SureB的凋亡率显着高于 SpcDNA3.1(P值为0.007);细胞周期分析显示,SureB细胞有s期比率增高,G一M,Go—G.期比率下降的趋势.ureB 在培养细胞内的表达可促进细胞凋亡. 关键词:幽门螺杆菌,ureB,细胞增殖,细胞凋亡,基因转染 中图分类号:Q939.93文献标识码:A文章编号:00016209(2005)01.003l一03 尿素酶是肋的重要定居因子和毒力组分,尿 素酶分解尿素产生的氨有助于在胃内的定殖, 并对胃黏膜产生损伤作用.已知尿素酶是由UreA, UreB两个结构亚单位和UreI,E,F,G,H5个辅助 蛋白构成.其中UreB是尿素酶重要的功能亚单位, 研究表明,UreB作为疫苗具有良好的抗感染 的免疫保护作用,因而被认为是目前最有发展前景 的组分疫苗.然而尿素酶亚单位UreB对细胞是否 具有直接的作用呢?目前国内外极少见此方面的报 道.本实验拟通过培养细胞内稳定转染ureB重组 质粒的方法,研究HpUreB对胃上皮细胞增殖与凋 亡的影响,旨在为寻找的致癌组分奠定基础,同 时也为HpUreB疫苗的研制提供安全性指标. 1材料和方法 1.1材料 细胞株和质粒:国际标准株 1.1.1菌株, NCTC11637购于中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所;大肠杆菌(Escherichiacoli)Top10购于 Invitrogen公司;胃腺癌细胞系SGC.7901(中国科学 院上海细胞库);质粒载体peDNA3.1为Invitrogen公 司产品. 1.1.2主要试剂:XhoI,HindIII购于Biolab公司, 高保真Taq酶购于Roche公司,Lipofeetamine2000, Titan0BeTubeRT—PCRKit,DNA和RNATRIzol试剂 为Invitrogen公司产品. 1.2ureB基因扩增,重组质粒构建和鉴定 根据NCTC11637ureB全长基因序列,以 VectorNTI6.0软件在开放读码框架两端一对引 物,5端分别加上XhoI和HindIII限制性内切酶酶 切位点,ureBF:5.CCGCTCGAGATGAAAAAGA"IFA GCAGAAAA.3,ureBR:5.CCCAAGC【丫rCTAGAAA ATGCTAAAGAG不G.3,扩增片段为1700bp. 用DNATRIzol试剂提取HpNCTC11637DNA,以 此为模板,用高保真Taq酶进行PCR扩增,反应体 系:10Xbuffer5L,dNTP(各10mmol/L)1L,模板 1L,引物(4pmol/9.L)各3,酶1L(3.5u),加双蒸 水至50/~L.反应条件:94cc3rain;940C30s,55oC 30s,720C2min,共30个循环;720C7min.产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析并纯化,纯化的产物与载 体pcDNA3.1经XhoI,HindIII双酶切后连接,转化 Top10感受态细胞,在含氨苄青霉素(100t~g/mL)的 LB培养皿上培养,挑取单菌落,小量提取质粒,重组 质粒用XhoI和HindIII双酶切鉴定,将经初步鉴定 含阳性重组质粒的细菌克隆送上海博亚生物技术有 限公司进行序列测定.测序结果与原始序列比较, 基金项目:福建省自然科学基金重大项目(2001F003) 通讯作者._rel:86.591—83569309:E.mail:Cylsif@163.net 作者简介:张静(1978一),女,湖北人,硕士研究生,主要从事病原生物学的研究.E-mail:zj一78@s0hu.com 收稿日期:2004.07.05,修回日期:2004—11-08 32微生物 将测序结果完全一致的重组子命名为pcureB. 1.3重组质粒pcureB转染SGC-7901细胞 用Qiagen—TIP100plasmidmidi(Qiagen公司)试剂 盒大量抽提重组质粒pcureB和pcDNA3.1(对照);转 染前1天,以1×10/孔密度接种细胞于6孔板中. 转染混合液的配制及转染:pcureB或pcDNA3.12ug +脂质体4L/200~L无血清的培养液,孔,混匀,室 温放置20min后,加入上述6孔板中,24h后更换含 有200t~g/mL潮霉素B的培养液,根据细胞生长的状 态,每2,3d换液,直至细胞克隆形成,挑取单克隆. 将质粒pcDNA3.1,pcureB转染SGC一7901细胞后形 成的克隆株分别命名为SpcDNA3.1,SureB. 1.4阳性克隆细胞株基因表达鉴定 用RNATRIzol试剂分别提取阳性克隆株的总 RNA,以此为模板,TitanOneTubeRT.PCRKit进行 RT-PCR.反应体系:2×buffermix12.5L,模板1L, 引物(4pmol/t~L)各2.5L,酶0.5L(2.0u),双蒸水 6UL.反应条件:50cI=30min,94cI=3min;94cI=30s, 55cI=30s,72cI=2min,共30个循环;72cI=7min. 1.5细胞形态学观察 SpcDNA3.1,SureB细胞经胰酶消化制成单细胞 悬液,接种于含有无菌盖玻片的12孔板内,培养24h 后,加5LAO/EB(100t~g/mLAO,100gg/mLEB)染色 液染色,封片后立即于荧光显微镜下观察并拍照. 1.6MTT法检测细胞增殖 SpcDNA3.1,SureB细胞分别用胰酶消化制成单 细胞悬液,按1×10/孔的密度接种于96孔板,复3 孔,每间隔24h取一块板,各孔中加MTI"(5mg/mL) 10t~L,孵育4h,加MT-F裂解液(10%SDS,5%异丙醇, 0.012mmo~LHCI)100L/孔,37cI=孵育过夜.测取 OD?的光密度值,连续检测7d,取平均值.根据 OD值绘制生长曲线.用重复测量方差分析比较 SureB与SpcDNA3.1细胞的生长情况. 1.7流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期 SpeDNA3.1,SureB细胞经过同步化后,用含 10%血清的1640培养3d,收集悬浮细胞及贴壁细 胞,PBS洗两遍,新鲜细胞经700r/min离心5min,沉 淀重悬于lmLPBS,400目筛网过滤,取500t~L细胞 悬液加500t~LDNA.PREPstain和lOOuLDNA—PREP LPR,避光染色20min.用BackmanCoultXL流式细 胞仪,488nm激发,605nm检测,每次检测104细胞. 用MultyCycle软件进行DNA含量和细胞凋亡率分 析.用DunettT3法比较SureB与SpcDNA3.1细胞凋 亡率.软件分析Go—G,期,s期,G:一M期细胞比率. 1.8统计学分析 实验结果均重复3次以上,用SPSS软件包进行 重复测量方差分析,DunettT3检验,P<0.05为有统 计学意义. 2结果 重组和鉴定 2.1目的基因的扩增, 以npNCTC11637DNA为模板,PCR扩增出片 段大小为1.7kb的ureB,PCR获取目的片段及重组 质粒双酶切结果经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定.将经 初步鉴定含阳性重组质粒的细菌克隆送上海博亚生 物技术有限公司进行序列测定,测序结果与原始序 列比较,完全一致. 2.2ureB基因在SGC.7901细胞内的表达 将RT.PCR产物各取5"L经1%的琼脂糖凝胶 电泳,结果表明ureB基因在SGC一7901细胞内获得 表达,而SpcDNA3.1细胞内没有扩增出ureB片段 (图略). 2.3细胞形态学特征 荧光显微镜下可见SpcDNA3.1细胞呈多边形 铺展状态,细胞膜完整,核膜界限清楚,核呈黄绿色 近圆形,内有3,5个圆形的黄色核仁.SureB细胞 部分胞膜突起,出芽,细胞皱缩,坏死细胞较多(图版 ?一A). 2.4MTT法检测细胞增殖 MT-F法检测SpcDNA3.1,SureB细胞的增殖,以 均值描绘细胞生长曲线(图版?一B).细胞培养的头 两天内,由于开始接种的细胞数量较少,细胞增殖较 为缓慢,但当培养进入第3天时,细胞进入对数生长 期,细胞增殖加快.按重复测量试验的统计学方法 进行分析:两株细胞随着培养时间的延长其OD均 增加,SureB与SpcDNA3.1细胞比较,生长增殖无显 着性差异(P>0.05). 2.5细胞凋亡检测 流式细胞仪分析细胞DNA的含量,发现 SpeDNA3.1未出现明显的亚二倍体峰;而SureB细 胞出现明显的亚二倍体峰,并且较SpcDNA3.1细胞 有更高的4倍体峰. MultyCycle软件分析细胞凋亡率,凋亡率以?S 表示(n=3),SpcDNA3.1,SureB细胞的凋亡率分别 为1.44?0.08,3.78?0.23,用DunettT3法比较 SpeDNA3.1,SureB细胞的凋亡率,SureB的凋亡率明 显较SpcDNA3.1高(P=0.007). 1期张静等:幽门螺杆菌reB基因转染胃上皮细胞及其对细胞的作用33 2.6细胞周期分析 用MultyrCycle软件对SpcDNA3.1,SureB进行细 胞周期分析,Go—G.,S,G一M期平均值(图版?一C), 细胞周期分布趋势:SureBS期比例较SpcDNA3.1 高,但G一M,Go—G.期比例又较SpcDNA3.1低,SureB 细胞DNA复制旺盛,但分裂受阻. 3讨论 尿素酶分解尿素产生的氨有助于Hp在胃内的 定殖.Fan等研究发现Hp尿素酶还可以和胃上皮 细胞表面MHC一11分子结合并诱导胃上皮细胞凋 亡,Kitada曾用重组的UreB亚单位作用于MKN45 细胞,发现UreB诱导了较低水平的细胞凋亡,提出 UreB可能是尿素酶诱导凋亡的调节点之一.有研 究表明Hp进入机体后除主要定植于胃黏膜上皮细 胞之外,少数可侵入细胞而致病,那么UreB在细 胞内是否具有影响细胞增殖与凋亡的作用呢?弄清 这一点,对于了解UreB在细胞内的致病作用,以及 评价ureBDNA疫苗的安全性十分重要. 本研究首次将ureB基因稳定转染SGC.7901细 通过MTr法检测,显示UreB 胞并在胞内持续表达, 对细胞的生长增殖无影响;用流式细胞技术检测,显 示UreB具有促进细胞凋亡的作用;细胞同步化后周 期分析显示,UreB也具有使细胞s期比率增高,G一 M期比率下降的趋势,即细胞的分裂受阻.该研究 证实UreB在细胞内的表达以及作为尿素酶的亚单 位之一有单独诱导细胞凋亡的作用.但完整的 uB基因可能不宜用于DNA疫苗的制备. 参考文献 胡伏莲,周殿元.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京:中国 科学技术出版社,2002,56. LeeMH.RousselY.WilksM,eta1.ExpressionofHelicobacter pyloriureasesubunitBgeneinLactacaccuslactisMG1363andits useasavaccinedeliverysystemagainstHpyloriinfectioninmice. Vaccine,2001,16(19):3927—3935. FanX,GunasenaH,ChengZ,eta1.Helicobacterpyloriureasebinds toclassIIMHCongastricepithelialcellsandinducestheir apoptosis.JImmuno1.2000.165:1919—1924. IgarashiM,KitadaY,YoshiyamaH,eta1.Ammoniaanaccelatator oftumornecrosisfactoralpha—inducedapoptosisofgastricepithelial cellsinheplicobacterpyloriinfection.Infectionandlmmunit), 2001.69(2):816—821. SjorkholmB,ZhukhovitskyV,LofmanC,eta1.Helicobacterpylori entryintohumangastricepithelialcells:Apotentialdeterminantof virulence,persistence,andtreatmentfailures.Helicobacter,2000, 5(3):148—154. PetersenAM,BlomJ,AndersenLP,eta1.Roleofstraintype, AGScellsandfetalcalfseruminHelicobacterPYlor/adhesionand invasionassays.FEMSImmunolMedMicrobiol,2000,29(1):59 — 67. EffectofrecombinantplasmidofHelicobacterpyloriureBgene ongastricepithelialcell ZHANGJingSHEFei—feiCHENYue—xiuCHENHao (FuJianMedwalUniversity,DepartmentofEtiologicalBiology,Fuzhou350004,China) Abstract:ToinvestigatetheeffectofrecombinantplasmidofHelicobacterpyloriureBgeneongastricepithelialcel1.The fulllengthsequenceofureBgenefromNCTC11637wasamplifiedbyPCR.Therecombinantplasmidwasconstructedby cloningtheopenreadingframe(ORF)ofureBintotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1,andwastransfected SGC一 7901cells,thentheclonesresistingHygromacinewerescreened.mRNAexpressionofureBoftransfectedcellswas detectedbyRT— PCR.TheeffectofrecombinantplasmidofnpureBgeneoncellphenotypewasobservedbyfluorescence strain,onproliferationbyMTY,onapoptosisandcellcyclesbyflowcytometry,respectively.ThepositiveclonesofureB (SureB)appearedcellmembranebuddingandcellshrinkage.MTrassayshowedtherewasnostatisticsignificance betweentheSureBandSpcDNA3.1whichweretransfectedonlybypcDNA3.1(P>0.05),suggestingthatthegrowthof SureBwerenotinhibited.TheapoptosisrateofSureBwashigherthanthatofSpcDNA3.1(P=0.007).Analysisforcell cycleshowedthatinSureBcellstheproportionofSphaseincreased,theproportionofbothG2/MandGo/Glphase decreased.PositivetransfectionofureBgeneintoSGC一 7901canchangecellphenotypeandinducecellapoptosis. Keywords:Helicobacterpylori,ureB,Proliferation,Apoptosis,Genetransfection Foundationitem:ProvinceNaturalScienceFoundationofFujian(2001F003) Correspondingauthor.Tel:86—591—83569309:E—mail:Cylsff@163.net Receiveddate:07—05—2004 ]]]]]] 23456 [[[[[[ }静等.幽门蝉杆菌u基转染胃 ZAHNGJlng,FH)fm【~nlbil1aJ【Ilflasmi epilheli~dItll L皮细弛理其对细胞的作用 l,Jf如urel~geJlPtg~Lrb 1BsljLI^3I]sllTI_{|_En01} H""?wI?…n-I^3 N,3I;=?l;r』J荆 目m ll口I? , 岫萤_ N ^