用于高效液相色谱测定乳制品中三聚氰胺的流动注射在线固相萃取富集系统

用于高效液相色谱测定乳制品中三聚氰胺的流动注射在线固相萃取富集系统 用于高效液相色谱测定乳制品中三聚氰胺的流动注射在线 固相萃取富集系统 摘 要 国标法测定乳制品中三聚氰胺含量时，其样品前处理为手工操作，每小时仅能处理1,2个样品。 因此，本研究基于流动注射分析技术，将国标法的手工操作变成自动过程，建立了一种可与国标法联用的奶样全自动固相萃取富集系统，每小时可处理至少10个样品，实现了奶样的自动快速处理，并已成功用于三聚氰胺标液及乳制品样的测定。本方法的特点是环境污染小、操作简便、自动化程度高，可作为国标法的补充方法。本方法的线性范围为0.2,50 mg/l (r,0.9993)，相对标准偏差小于3.9%，检出限为0.1 mg/l，回收率为95.4%,108.0% 关键词 三聚氰胺; 固相萃取; 流动注射; 高效液相色谱; 乳制品 1 引 言 三聚氰胺(melamine, ml)是一种白色的氮杂环有机化合物，常用于生产塑料、胶水和阻燃剂等\ml含氮量高(66.7%)，且目前检测乳制品中蛋白质方法的凯氏定氮法\ 白氮和非蛋白氮，因此ml被不法商人添进乳制品中， 以提高“表观蛋白质”含量。ml进入人体后可水解产生三聚氰酸，并与三聚氰酸结合成溶解度低的网状结构氰酸化物，引起泌尿系统结石，危害 健康\2007年发生在美国的“宠物食品事件”\2008年发生在中国的“三聚氰胺牛奶事件”\ 加了ml造成的。因此，食品中ml含量的检测具有重要意义。 目前，乳制品中ml的测定方法主要有高效液相色谱法\ \\ \\\ \2008年，我国颁布了原料乳、乳制品以及含乳制品中ml的测定方法\，包括了前3种方法。但是，限制这些方法分析速度的关键是样品的前处理过程。目前常用的前处理技术有阳离子交换固相萃取\ \\; 这些技术均由手工操作，其过程较复杂，无法适用于批量奶样的快速筛查和分析的要求。因此，开发一种简便、快速、准确的预处理乳制品中ml的自动化系统很有必要。 流动注射分析(flow injection analysis, fia)\析速度快，试剂耗量少，重现性好等优点。因此，本研究基于fia，建立了一种的自动固相萃取富集系统(automatic solid phase extraction enrichment system, aspees)，实现了乳制品中ml的富集、清洗、洗脱、测定过程的连续自动化。 2 实验过程 2.1 仪器与试剂 fia3110型流动注射仪(北京吉天公司);高效液相色谱仪，uvidec100vi型紫外分光光度计(日本分光公司);auw型电子天平(日本岛津公司)，800i型离心机(慧智仪城科技公司);固相萃取柱(40 mm×3 mm60 mg，自制);混合型磺酸阳离子交换树脂(pcx，40 ?symbolma@ m)、聚乙烯滤片(20 ?symbolma@ m， 北京艾杰尔公司)。 ml(c3h6n6)标准品(上海安谱科学仪器);庚烷磺酸钠、乙腈(色谱纯);柠檬酸、冰乙酸、甲醇、乙醇、氨水(分析纯，科龙化学公司);水为超纯水(0.65 ms/cm)。 2.2 固相萃取富集柱的制备 将60.0 mg pcx填料装入柱内(40 mm×3 mm)，柱两端装上聚乙烯滤片，采用氨化乙醇进行再生处理。 2.3 样品除蛋白 称取5.00 g牛奶样品，置于50 ml容量瓶中，加入1.0 ml冰乙酸(3%, v/v)，混匀后分别均匀移至4个15 ml离心管中，以 4000 r/min离心分离10 min，上清液经冰乙酸润湿的滤纸过滤，即得待净化液。 2.4 aspeeshplc系统及测定过程 aspeeshplc系统见图1a。它由蠕动泵a、蠕动泵b、切换阀、萃取柱、色谱柱、流通式紫外可见分光光度计和数据采集器组成。 其动作程序是:第1步,样品富集，泵b停止，泵a转动，切换阀处于位置?。乳样在泵a推动下进入萃取柱，乳样中的ml与萃取柱中的阳离子交换基团发生离子交换，未交换的物质流出萃取柱至排废w2;第2步，清洗萃取柱，泵b转动，泵a停止，切换阀仍处于位置?。清洗液在泵b的推动下进入萃取柱，将其中未交换的残留水溶性或脂溶性杂质洗出至w2;第3步，ml洗脱及萃取柱再生，泵b转动，泵a停止，切换阀切换至位置?。洗脱液在泵b的推动下进入萃取柱，洗脱液中的nh4与萃取柱内填料上的ml进行离子交换，使填料再生的同时将ml洗脱下来，并以“浓缩样品塞”的形式随洗脱液从萃取柱流出，直接进入采样阀的采样定量环(60 ?symbolma@ l)，对预处理后的样品进行体积定量，并排废至w 2;然后，系统再自动跳入第1步程序，开始下一个样品的前处理。 在此过程中，泵c连续转动，采样阀处于采样位置，流动相在泵c的推动下经采样阀依次进入色谱柱和流通式检测器(237 nm)，给出一个稳定的基线;当从萃取柱流出的“浓缩样品塞”正好处于定量环内时，采样阀切换至注入位置，流动相将注入的“样品塞”推进色谱柱和流通式检测器，实测信号由数据采集器记录和处理。乳制品的实测曲线见图1b。 3 结果与讨论 3.1 实验条件的优化 3.1.1 清洗液中甲醇和乙醇含量的影响 国标法\采用甲醇清洗萃取柱。本实验考察了甲醇和乙醇清洗液的影响。aspees系统设定的初始条件是:ml标液用量6 ml，流速1.2 ml/min;清洗液流速1.0 ml/min7.0% (v/v)氨化甲醇为洗脱液，其流速1.48 ml/min;清洗和洗脱时间见图1。实验结果见2a着清洗液中甲醇或乙醇含量增大，ml的响应信号均下降，当含量大于60%时，吸光度降至最低;甲醇清洗液下降趋势大于乙醇;对于5.0 mg/l ml，当清洗液中甲醇或乙醇含量达到60%时，吸光度趋于零。这是因为ml与萃取柱存在离子交换和溶解平衡，由于ml在甲醇或乙醇中的溶解度远大于水，所以导致被离子交换而富集在萃取柱上的ml又被溶解下来，导致吸光度降低。此外，由于ml在甲醇中的溶解度大于乙醇，因此甲醇清洗液的下降趋势大于乙醇。 在此基础上，在牛奶样品中添加不同浓度的ml标液，继续考察了清洗液中甲醇或乙醇含量对ml富集的影响，其结果见图2b。可以看出，牛奶样品中ml吸光度的变化趋势与其标液相同(图2a)。因此，最终选定清洗液为超纯水。由此也发现，国标方法\ 3.1.2 样品中甲醇和乙醇以及冰乙酸浓度的影响 上述实验表明，甲醇或乙醇的存在将影响ml富集和测定。在ml标样 (5和10 mg/l) 中添加了不同浓度的甲醇或乙醇，进一步 考察了其含量的影响。结果表明，ml标样中甲醇或乙醇含量增大，均导致ml吸光度减弱，变化趋势同图2a，其原因也与3.1.1节相同质，上清液作为aspees系统的样品，考察了冰乙酸浓度的影响。结果表明，用0,0.15%冰乙酸沉淀牛奶样品中的蛋白质，不影响ml测定。 3.1.3 上样流速及用量的影响 萃取柱填料的离子交换速度取决于离子扩散速度，而填料表面离子交换层的液膜扩散速度又与含ml样品流速相关。因此，固定上样体积(8.0 ml)，用5和20 mg/l的ml标样作为样品，考察了上样流速(f)的影响。图3a表明，上样流速为1.2 ml/min时，吸光度值最大。上样流速增大，萃取柱填料表面水膜变薄，离子表面扩散速率得以提高， 导致ml与交换基团上的nh4交换迅速，其富集量增大，吸光度增大;当上样流速太高时，可能由于ml来不及与填料表面的nh4交换就被排出，导致其富集量降低，响应信号降低。因此，本研究选定样品的流速为1.2 ml/min。 在此流速下，考察了样品用量对吸光度的影响。图3b表明，样品用量增加，响应信号逐渐增大。当样品用量达到12 ml时应信号不再变化。其原因是，上样流速一定时，样品用量增加，会 使更多的ml与填料表面的nh4发生接触和离子交换，导致其富集量增多，响应信号增大;当样品用量为12 ml时，填料离子交换容量达到饱和，ml富集量不再增多，响应信号不再变化。 3.1.4 清洗液用量及流速的影响 以5和20 mg/l的ml标液作为样品，在0.75,4.50 ml的范围内，考察了清洗液用量的影响。实验表明，清洗液用量增大，响应信号迅速下降，在2.5 ml时响应信号不再变化。这是因为，清洗液用量逐渐增大，柱中未交换的ml残液被逐渐洗出;清洗液用量达到 2.5 ml时，未交换的ml被全部洗出，柱中仅留下交换在填料表面上的ml，响应信号不再变化。最终清洗液用量选定为2.5 ml。 在此基础上考察了清洗液流速的影响。结果表明，在0.54,1.05 ml/min范围内，吸光度变化程度不大;当清洗液流速大于1.05 ml/min时 使部分吸附在柱上的ml受到液流的剪切作用也被洗脱下来，导致ml流失，响应信号降低。综合考虑分析速度及灵敏度，最终清洗液流速选定为1.0 ml/min 3.1.5 洗脱液流速及时间的影响 将柱内“浓缩样品塞”洗脱开始至流入采样环内所用的时间定义为洗脱时间，在连接管长度(50 cm)及内径不变的前提下，洗脱液流速变化，洗脱时间就会相应变化。因此，用20 mg/l的ml标液作为样品，在0.85,2.0 ml/min的范围内考察了洗脱时间对吸光度的影响。结果表明，洗脱时间随洗脱 液流速增大而减小;流速增大，响应信号先增大后减小;当洗脱液流速为1.5 ml/min时 会使萃取柱中填料表面水膜变薄，填料表面吸附的ml更容易被洗脱液中的nh4交换下来， 进入洗脱液，使洗脱液中ml量增大，响应信号随之增大;当洗脱液流速大于1.5 ml/min时，流量过快，导致洗脱液中的nh4来不及与更多的ml进行交换反应，使洗脱液中ml量减少，响应信号随之降低。因此，洗脱液流速选定为1.50 ml/min30 s。 3.1.6 洗脱液溶剂及nh4浓度的考察 用nh4可将柱内填料上吸附的ml置换下来，同时使填料交换基团得到再生\5和20 mg/l的ml标准溶液作为测试样品，洗脱液中nh4浓度固定在7.0% (v/v)，分别考察了不同溶剂中nh4对ml的洗脱效果。结果表明，氨化甲醇洗脱的ml最多，氨化乙醇洗脱的ml量略低于甲醇，单纯氨水作为洗脱液洗脱的ml最少。其原因是，甲醇和乙醇对ml的溶解度大，被nh4交换下来的ml很快溶解在洗脱液中，使离子交换反应利于ml洗脱。此外，由于ml在甲醇中的溶解度略大于乙醇，因此甲醇洗脱液洗脱的ml较多。但考虑到甲醇毒性大，最终选择氨化乙醇作为洗脱液。 实验表明，增大氨化乙醇中nh4浓度，被洗脱下来的ml量增多，方法的灵敏度增大;当nh4达到12%时，响应信号 不再增加。考虑灵敏度和环保，最终选定乙醇洗脱液中nh4浓度为12.0% (v/v)。 3.1.7 色谱柱相关条件的选择 c18c8两种填料色谱柱都可用于ml的测定\c 18c8柱(150 cm × 4.6 mm, 5 ?symbolma@ m)的分离效果进行了考察。流动相的组成为10 mmol/l庚烷磺酸钠，15% (v/v)乙腈(ph 2.5)，其流量为0.8 ml/min;进样体积为20 ?symbolma@ l\ml标准溶液(cml 结果表明，由c8柱(,c80.0032cml0.001, r,0.9998)和c18c18 0.0028cml 0.001, r,0.9991c 8柱的保留时间短(5.53 min)、灵敏度高，因此选用了c8柱。考察了c8柱长对tr 由150 cm (,1500.0032cml0.001, r,0.9999)和250 cm (,2500.0019cml0.001, r,0.9999)色谱柱得到的ml线性响应都很好，但150 cm色谱柱的灵敏度高，且保留时间tr1505.53 min) ,tr250 9.05 min)。因此，本系统选用了150 cm的c8柱。 3.2 标准曲线及重现性测定 在上述选定的条件下，采用1.0和10 mg/l的ml标准溶液对aspeeshplc系统进行了的重现性(n,11) 和线性实验。结果表明:aspeeshplc系统精密度很好(a: 0.00463?0.00018, rsd ?3.9%, 1.0 mg/l; a: 0.046?0.0012, rsd ?2.7%, 10 mg/l)，而且在0.2,50 mg/l范围内有很好的线性相关(δa,0.0052cml ,0.0031，r,0.9993)。经计算，本方法的检出限为0.1 mg/l。 3.3 样品分析 3.3.1 牛奶样品分析及回收率 为了考察本系统的可靠性，在最佳测定条件下，在4种乳制品(纯牛奶、乳饮料、酸奶、奶粉)中添加2.0 mg/l ml作为样品，进行了回收率实验。结果表明，回收率在95.4%,108%之间 3.3.2 对比实验 为进一步考察本方法的可靠性，采用国标方法\1。可以看出，3种方法的测定结果一致，表明本方法可用于乳制品中ml含量的测定。 references 1 erick j a, sergio o g, eric e s. j. polym. sci. part a: polym. chem., 2005, 43(1): 168,177 2 lin r h, randolph h e. j. dairy sci., 1978, 61(7): 870,873 3 baynes, r e, smith g, mason s e, barrett e, barlow b m, riviere j e. food chem. toxicol., 2008, 46(3): 1196, 1200 4 hsieh d p h, chiang c f, chiang p h, wen c p. regul. toxicol. pharm., 2009, 55(1): 13,16 5 lam c w, lan l, che x, tam s, wong s s, chen y, jin j, tao s h, tang x m, yuen k y, tam p k. clin. chim. acta, 2009, 402(12): 150,155 6 background paper on occurrence of melamine in foods and 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hour. the method has the advantages of rapid, small pollution and high automation. linear range of the method was in the range of 0.2,50 mg/l (r ,0.9993), relative standard deviation was less than 3.9%, detection limit was 0.1 mg/l, recovery was 95.4%,108.1%. it can be used as a new complement for the gb method. keywords melamine; automatic solidphase extraction; flow injection; highperformance liquid chromatography; milk products (received 29 june 2011; accepted 21 september 2011)