病理切片技术

病理切片技术 目录 一、取材 二、固定 三、脱水 四、透明 五、浸蜡 六、包埋 七、 切片 八、染色 一、取材 ? 取材是制作切片程序中的首要步骤，取材不当， 将直接影响病理 诊断和科研工作的效果。组织标 本的选用非常重要，不能随意的切取组织来制作 组织切片，否则病理检验的结果是不会令人满意 的。 ? 取材工具:取材刀具必须锋利。切取标本不应该 挤压和揉擦，以免损害组织造 成人为组织变化， 给诊断带来困难或导致错诊，漏诊。 ? 标本的选取:应选择病变或可疑病变的组织。必 要时选取病变与正常组织交界 处。组织宜小不宜 大，以不超过24x24mm2为佳，厚度以3—5mm 为度，过大过 厚会影响对标本的固定，另方面也 影响切片的制作。特殊目的者应属例外。 二、固定 ? 在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是 大体标本的保存， 都必须进行及时的适当的和有 效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的 一 系列的制作，直至切片的最后完成。 1.固定的作用 ? 固定的作用，从组织学的角度其简单的定义是: 保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保 持细胞、组织的固有形态和结构。 ? 从免疫组化技术的角度，使细胞内蛋白质凝固， 尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应;防 止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质;保 持组织的固有形态和结构;保持组织或细胞的抗 原性。 2.固定的目的 ? 能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。 ? 保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组 织液，糖原等，使细胞或组织基本上保持与生活 时的物质一样。 使组织硬化，便于切块。 对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。 保存好大体标本。 可增强染色的作用。 ? ? ? ? 3.固定的注意事项 ? ? ? ? ? 组织固定越新鲜越好 组织固定，组织块不宜过大 对不同类型的组织应适当合理地选择固定液 组织固定，时间不宜太短，也不宜太长 固定液的量要充分 ? ? 特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液 组织的第二次固定或后固定 4.固定液的使用 ? ? 根据Bencroft的分类法，可分为四种类型: 醛类:甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二 醛，丙二醛等。 氧化剂类:四氧化锇，高锰酸钾，重铬酸钾等。 蛋白变性类:甲醇，乙醇，醋酸等。 其他:氯化汞，苦味酸等。上述四种类型的固定 剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技 术方面中用到。 ? ? ? ? ? 冲洗 组织经过固定后，脱水之前应进行冲洗，将组织 内的固定液洗干净，否则残留组织内的固定液有 碍制片和染色，而有些固定液则可在组织中继续 起到脆化组织的作用，以至于损坏组织，给制片 工作带来不利。在冲洗时，冲洗剂的选择应依固 定液的种类和性质而有所不同。 ? ? ? ? 冲洗时应注意以下事项: 水溶性的固定剂:需用流水冲洗。 酒精溶剂的固定剂:应用同浓度的酒精浸洗。 含苦味酸的固定剂:(苦味酸与甲醛混合液除 外)，须用70,酒精浸洗。 ? 含有升汞固定剂:水或酒精中加碘以洗去组织内 汞的沉淀。 ? 含有铬酸的固定剂:冲洗时置于暗处，以免产生 沉淀或使组织硬化而影响制片。 三、脱水 ? 脱水就是用脱水剂完全除去组织内的水分，为下 一步透明及浸蜡创 造条件。此外，脱水还可以使 组织再次发生一定的硬化，脱水剂必须是与水在 任何比例下均能混合的液体。 1.常用的脱水剂 ? ? ? ? 酒精 (常用) 丙酮(Acetone) 正丁醇(γ-Buty alcohol) 二氧乙环(Dioxan) 2.组织的摇震 ? 为加快脱水进程可将标本放入各级酒精内借助机 器或手工震摇，还可以加温促进脱水。即将标本 装在塞紧的玻璃瓶置于包埋箱或温箱内，因液体 受热产生的正压可增加溶液的对流。但热酒精会 使组织过硬，并有爆裂危险，除急诊外，最好不 用此方法。 四、透明 ? 目的是使石蜡渗透到组织中去，达到包埋的支持 作用。 ? 将组织投入可以同酒精又能同石蜡相混合的媒剂 中，组织中的酒精就被该媒剂取代，待酒精完全 被该媒剂完全取代后，组织即成透明状态 ? 透明后就可以将组织浸入溶解的石蜡进行浸蜡 透明剂 对组织的收缩性强，作用迅速，组织在二 甲苯中时间不宜过长 。(常用) 氯 仿:作用缓和 ，不易呈现透明现象 香柏油:处理细柔组织的最佳透明剂 。 二 甲苯:能与酒精，丙酮相混合，又是石蜡的溶剂。 五、浸蜡 ? 组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内 浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这 一程序就叫浸蜡。 ? ? 石蜡的质量和熔度与切片质量密切相关 。 为了增加石蜡的韧性，可在石蜡中加入一些混合 剂，常用蜂蜡，硬脂酸，松香等。 六、包埋 ? 包埋，就是将已经经过固定，脱水，透明，浸蜡 的组织块从最后的蜡浴取出置入充满熔融石蜡的 包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体 并迅速冷却，这个程序称为包埋。包埋剂凝固后， 进一步加强了组织的硬度和韧度而便于进行切片。 1.石蜡包埋法 ? ? 包埋的方法有自动包埋机包埋和手工包埋两种。 手工包埋法: ? 1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石 蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃 酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。 2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加 温(防止镊子粘蜡)后，左手持蜡杯，右手把加 温的镊子放在蜡口(直立状)倒蜡时让石蜡沿镊 子注入包埋框内。 ? ? 3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下 放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。 ? 4.待石蜡面凝固前将标签贴于其上，需注意勿 使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明 蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常 形成结晶。 ? 5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固， 立即修切，准备制成切片或储藏备用。 2.石蜡包埋流程 ? 组织取材，固定于福尔马林数小时后再换以新鲜福尔马林固定数 小时。 ? ? ? ? 组织流水冲洗6,12小时。 70,酒精2,4小时。 85,酒精2,4小时。 95,酒精(?)2,4小时。(可过夜) ? 95,酒精(?)2,4小时。(可过夜) ? ? 100,酒精(?)2,4小时。 100,酒精(?)2小时。 ? ? ? ? 二甲苯 (?)0.5,1小时。 二甲苯(?)0.5小时。 浸蜡(?)2小时。 浸蜡(?)2小 时。 ? 组织包埋。(上述只供参考) 七、切片 ? 一般的切片厚度要求在4—6微米。石蜡切片不但 可以达到这个要求，甚至可以切得更薄到2微米 以至1微米。 ? ? 还便于制作大批的或是连续的切片。 以石蜡包埋的组织块便于长期保存。 ? 所以石蜡切片是目前各种切片制作方法中最普通 常用的一种方法。 1.切片前的准备 ? ? 恒温水浴锅首先预热至35?—40?。 蜡块整修，将蜡块组织面的石蜡用刀修去，使组 织全部暴露出切面并修平，以减少切片刀的磨损。 ? ? 载玻片应事先洗涤干净，无油腻和不透明现象。 将锋利的刀片装入切片刀夹钳内，调整角度和位 置后随即紧固。 ? 备用小型毛笔、小型无钩镊子、铅笔。 2.切片的步骤 ? 将蜡块固定于切片机头上的夹