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国标-》贝类中麻痹性贝类毒素的测定

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国标-》贝类中麻痹性贝类毒素的测定国标-》贝类中麻痹性贝类毒素的测定 ICS 67(040 C 53 囝园 中华人民共和国国家标准 5009(213—2008 GB,T 贝类中麻痹性贝类毒素的测定 shellfish Determination of in shellfish paralytic poison 2009-03-0 2008-11—21发布 1实施 中华人民共和国卫生部世士 中国国家标准化管理委员会及仲 GB,T 5009(2 13—2008 刖 本标准修改采用国际分析家协会(AOAC)罱 958 08<麻痹性贝类毒素7}物检测...
国标-》贝类中麻痹性贝类毒素的测定
国标-》贝类中麻痹性贝类毒素的测定 ICS 67(040 C 53 囝园 中华人民共和国国家 5009(213—2008 GB,T 贝类中麻痹性贝类毒素的测定 shellfish Determination of in shellfish paralytic poison 2009-03-0 2008-11—21发布 1实施 中华人民共和国卫生部世士 中国国家标准化管理委员会及仲 GB,T 5009(2 13—2008 刖 本标准修改采用国际家协会(AOAC)罱 958 08<麻痹性贝类毒素7}物检测法? shellfish 官方方法AOAC n】cthod)((Para]yfiC poison 1)】oJogical 本标准与AOAC方法相比主要差异为: ——增加了“规范性引用文件”、“术语干?定义”; ——增加r“仪器和设备”; ——对“斌样制备与保仔”、“试剂和”进行r修改: ——在“结果判断及表述”中增加了鼠单位毒力表示方法。 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由中华人 民共和围Ii生部提出并归口。 本标准由中华人民共和国lJ 生部负责解释。 本标准起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和闻i南?f入境检验检 疫局。 本标准主要起草人:曹际娟、王秋艳、麻丽丹、高世光、于兵、孙哲平、于杰、黄大亮、邛惠芳、李大顺、 赵昕、郑秋月。 5009(2 1 3— 2008 GB,,1 贝类中麻痹性贝类毒素的测定 1范围 本标准规定r贝类及其制品中麻痹陛贝类毒素的测定 方法本标准适』柯于ff』类及其制品中麻痹性?贝类毒素的测定。 2规范性引用文件 一F列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文 件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成的各方研究 是否可使用这螳文件的最新版本。凡足不注口期的引刚文件(其最新版奉适用于本标准。 (}B,T 6682分析实验室用水规格和试验方法 (jH 1 4925实验动物环境及设施 3术语和定义 下列术语和定义适用 于本标准。 3(1 shellfish 麻痹性贝类毒素paralytic poison;PSP 以石房蛤毒素(saxitoxin,STX)为代表,摄食后可产生麻痹作用的存在于贝类体内的海洋生物毒性 物质的总称。 3(2 鼠单位mouse unit;MU 5 对体重为20 g的ICR雄性小鼠腹腔注射1 mI,麻痹性贝类毒素提取液,使其在1 rnin内死亡所需 的最小毒素量。 4原理 本标准采用鼠单位法对PSP予以定量。以石房蛤毒素作为标准,将鼠单位换算成毒素的微克数。 illouse 根据小鼠注射蚍类提取液后的死亡时间,查出鼠单位,并按小鼠体重,校正鼠单位(corrected unit,CMU),计算确定每100 g贝肉内的PSP微克数。所测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的 PSP毒素总量。 5试剂和材料 6682规定的一级水。除非另有规定(本标准所jH试剂均为分析纯,水为符合(;B,T 5 5(1 盐酸溶液(0(18 mol,l。):将 ln1I。浓盐酸(HCI)用蒸馏水稀释至l I,。 tool,I,):将41(7 m1,。 5(2盐酸溶液(5 rnl。浓盐酸用蒸馏水稀释至100 0 mol,I,):将4 5(3氢氧化钠溶液“)(1 g氢氧化钠(Nat)H)溶于1 L蒸馏水中。 5(4石房蛤毒素(saxitoxin,C。H。,N。O,?2HCI)标准溶液(100 lzg,mI。):用蒸馏水配制20,(体积分 数)的乙醇溶液,用j mol,1。盐酸调节pH到2(0,4(0之间,用_J一述溶液配制石房蛤毒素。 9 1得到小鼠体重校正系数。5(5小鼠:体重为1 g,21 g的健康1CR系雄性小鼠,可通过查表H 5(6蒸馏水(pH 3(0):用盐酸调pH至3(0。 5009 2 1 3— 2008 GB,'11 6仪器和设备 6(1均质器。 6(2电炉。 01 6(3天平:感量0(1 g,0(000 g。 6(4离心机。 6(5 r,Fl计或PH试纸( 6(6秒表。 6(7玻璃器』『『【:烧杯、量筒、容量瓶、移液管、搅拌棒等。 6(8一次性注射器:l mI。。 6(9冰箱。 7试样制备和保存 7(1试样制备 分析样品要有充分的代表性,应从足量(一般应2 kg以上二)的混合样品中挑选良好的贝类去壳,用 g以E。于分析的去壳肉量应达200 不能及时送检的新鲜贝类,按7(1(1或7(】(2方法将贝肉分离,将沥水后的200 g贝肉放人0(1 8 tool,I。、200 mI。的盐酸溶液中,置4?冷藏保存,备检。 7(1(1牡蛎、蛤及贻贝 j月清水将叭壳外表彻底洗净,切断闭壳肌(开壳,用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物。将闭壳 肌和连接在胶合部的组织分开,仔细取出贝肉,切勿剖破贝体。严禁加热或用麻醉剂开壳。收集约200 g肉分散置于筛子中沥水5 min(不要使肉堆积),检出碎壳等杂物,将贝肉粉碎备用。 7(1(2扇贝 取“r食部分用作榆测,过程同7(1(1。 7(1(3冷冻贝类 在室温下,使冷冻的样品(带壳或脱壳的)自然融化,按7(1(1方法开壳、淋洗、取肉、粉碎、备用。 7(1(4贝类罐头 将罐内所有内容物(肉及液体)倒人均质器中充分均质。如果是大罐,将贝肉沥水并 收集沥下的液 体分别称重并存放固形物和汤汁,将固形物和汤汁按原罐装比例混合,均质后备用。 7(1(5用酸保存的贝肉 沥去酸液,分别存 放贝肉及酸液,备用。 7(1(6贝肉干制品 h,48 m01(,I。盐酸溶液中浸泡24 干制品可于等体积0(18 h(4?冷藏),按7(1(4方法沥干,分别 存放城肉和酸液备用。 7(2试样保存 mI,送检样品应尽可能及时检验,如不能及时检测,可取200 g样品按7(1方法处理,加入200 0(18 tool,I。盐酸溶液,置4?冷藏保存。 8检验步骤 8(1 PSP标准品对照试验 8 1(1 PSP标准工作液的配制 用移液管取1 mI。浓度为1 00}增,mI,的石房蛤毒素标准液于100 mI(容量瓶中,加入蒸馏水(5(6) 并定容(pH在2(O,4(o之间。该溶液为l pg,mI,石房蛤毒索标准液,该标准液可在3|。C,4?下稳定 0 5009(2 1 3—2008 GB,T 数周。 mL、25 用10 mI。、15 ml。、20 mI。和30 mI(的蒸馏水(5(6)分别稀释1#g,mI。的石房蛤毒素标准液 10 mI,,配制成系列浓度的标准稀释液。 8(1(2 中位数死亡时间的标准液选择 取按8(1(1配制的系列浓度的标准稀释液各1 mL,腹腔注射小鼠数只,选择中位数死亡时间为 5 min,7 min的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求,还需以1 mI,蒸馏水(5(6)的增减量进行补充 rain,7 稀释试验。例如:用2j mI,蒸馏水(5(6)稀释的10 mI。标准液在5 min杀死小鼠,还需进行24 mL十10 mI。和26 mI,+1 Oral。稀释度的试验。 每只小鼠试验前称重,以10只小鼠为一组(用中位数 min,7 rain范围内的两个浓度 死亡时间在5 含量的标准稀释液注射小鼠,测定并每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间。 8(1(3毒素转换系数(conversion factor,CF)的计算 8(1(3(1 小鼠中位数死亡时间的选择 计算所选择浓度的标准稀释液受斌组中位数死亡时间。弃去 rain或大于 中位数死亡时间小于5 7 min,7 min的受试组;选择中位数死亡时间在5 min的受试组,该受试组中可有个别小鼠的死亡时间 小于5 rain或大于7 rain。 8(1(3(2校正鼠单位(CMU)的计算 min,7 对于所选定的中位数死亡时间为5 min的受试组(根据附录A查得组中每只小鼠死亡时间 所对应的鼠单位(Mu),再根据附录B查得组中每只小鼠质量所对应的质昔校正系数,同一只小鼠的质 量校正系数与鼠单位相乘得该只受试小鼠的校正鼠单位(CMU)。 8(1(3(3转换系数(CF)的计算 对于选定的受试组,用该受斌组所选稀释液每毫升实际毒素含量的微 克数(以石房蛤毒素为例计 算),除以受试组中每只小鼠的CMU值,得到单只小鼠的毒素转换系数(CF),计算见式(1),再计算每 组10只小鼠的平均CF值,即为组内毒素转换系数。 CF一西南 式中: CF一 转换系数; c——每毫升STX实际毒素含量,单位为微克每毫升(pg,mI。); CMU——校正鼠单位。 8(1(3(4组间毒素转换系数(CF)的计算 取不同受试组组内毒素转换系数的平均值,即为组间毒素 转换系数。以组问毒素转换系数进行9(2中检测样品的毒力计算。 8(1(3(5 如PSP检测间隔时间较长,每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小CF值定期检查 鼠,重新测定CF值。如 7 mint 果一周有几次检测,则用中位数死亡时间5 min的标准稀释液每周检查一次,测得的CF值应在 原测定CF值的?20,范围内。若结果不符,用同样的标准稀释液另外注射5只小鼠,综合先前注射的5只小鼠结果,算出CF值。并用同样的标准稀释液注射第二组lo只小鼠,将第二组求出的CF值和第 一组的CF值进行平均,即为一个新的CF值。 重复检查的CF值通常在原结果的?20,之内,若经常发现有较大偏差,在进行常规检测前应调查 该方法中是否存在未控制或未意识到的可变因素。 8(2试样提取 8(2(1取100 g按7(1(1、7(1(2、7(1(3或7(1(4处理的样品于800mI。烧杯中,加0(18mol,I,盐酸溶 液100 ml。充分搅拌,均质,凋整pH在2 0,4(0范围内;按7(1(5或7(1(6及7(2处理的样品,取 3 GB,T 5009(213—2008 0,4(0后均质。必要时,可逐滴加入5 100 mol,L盐酸溶 g贝肉,加入相应的酸液100 mI(,调pH为2 液或0(1 mol,I。氢氧化钠溶液调整pH,加碱时速度要慢,同时需不断搅拌,防止局部碱化破坏毒素。 m1(,调节8(2(2将混合物加热,并文火煮沸5 rain,冷却至室温,将混合物移至量筒中并稀释至200 pH至2(0,4(0(pH值切勿>4(5)。 8(2(3将混合物倒回烧杯,搅拌均匀,自然沉降至上清液呈半透明状,不堵塞注射针头即可,必要时将 000 混合物或上清液以3 r,rain离心5 rain,或用滤纸过滤。收集上清液备用。 8(3小鼠试验 8(3(1取19(0 g,21(0 g健康ICR雄性小鼠6只,称重并记录质量。随机分为实验组和空白对照组 (O(18 mol,I。盐酸)两组,每组三只。 8(3(2对每只试验小鼠腹腔注射1 mL提取液或空白对照液。注射过程中若有一滴以上提取液溢出, 须将该只小鼠丢弃,并重新注射一只小鼠。 8(3(3记录注射完毕时间,仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一1:1气止)。8(3(4若注射样品原液后,一只或两只小鼠的死亡时间大于7 min,则需再注射至少三只小鼠以确定 样品的毒力。 8(3(5若小鼠的死亡时间小于5 rain,则要稀释样品提取液后,再注射另一组小鼠(三只),直至得到5 min,7 min的死亡时间;稀释提取液时,要逐滴加入0(18 moI,L盐酸溶液,调节pH至2(0,4(0。 8(3(6注意事项: 为避免毒素的危害,应戴手套进行检验操作。移液管等用过的器材应在5,的次氯 酸钠溶液中浸 泡1 h以上,以使毒素分解。同样,废弃的提取液等也应以5,次氯酸溶液处理。小鼠尸体应按GB 14925要求焚烧处理,其排放物应达到污物焚烧排放规定的要求。 9结果的计算与判断 9(1 待测样品校正鼠单位(CMU)的确定 根据待测样品的小鼠死亡时间,在附录A中查出相应的鼠单 位数MU;根据小鼠的质量,在附录B 中查出其对应的质量校正系数。同一只小鼠的鼠单位与质量校正系数相乘,即得该只小鼠的CMU。选取检测样品受试组中三只小鼠CMU的中位数,即为该样品受试组的中位数CMU,以此值进行9(2 的计算。 9(2毒素毒力的计算与结果表述 9(2(1 PSP毒力的计算与结果表述 9(2(1(1 PSP毒力的计算 每100 g样品巾PSP的含量按式(2)计算。 (2) X=CMU,×CF×DF×200 式中: x每100 g样品中PSP的含量,单位为微克每百克(1lg,100 g); CMU。——检测样品受试组小鼠的中位数校正鼠单位; cF——毒素转换系数; DF一稀释倍数; 200 mI。)。rtu表示样品提取液定容的体积,单位为毫升(mI。)(提示:8(2(2操作中该定容体积为200 9(2(1(2 PSP毒力的结果表述 若空白对照组小鼠正常,则报告待测样品中PSP毒素 g。 含量为:×××tLg,100 9(2(2 MU毒力的计算与结果判断 9(2(2(1 MU毒力的计算 对于取得麻痹性贝类毒素标准品有困难的实验室,可按式(3),使用鼠 单位MU对检验结果进行计算。 4 5009(2 1 3—2008 GB,T (3) y—CMU,×DF×200 式中: y——每100 g); g样品的MU值,单位为鼠单位每百克(MU,100 CMU。——检测样品受试组小鼠的中位数校正鼠单位; DF——稀释倍数; ml。)。200——表示样品提取液定容的体积,单位为毫升(mI。)(提示:8(2(2操作中该定容体积为200 注:检验结果的仲裁以9(2 1为准。 9(2(2(2 MU毒力的判断与结果表述 在空白对照组小鼠正常的情况下进行如下判断 rain,则待测样品的鼠单位即相当小于和表述: 若小鼠的死亡时间大于60 MU,g。 0(875 rnin,则应对样品提取液进行稀释,再选取三只小鼠进行试验,直 若实验组中位数死亡时间小于5 min,7 至得到中位数死亡时间为5 nlin为止,根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力,报 g。告该样品的鼠单位为:×××MU,100 若实验组中位数死亡时间大于7 rain,则直接计算确定样品鼠单位毒力,报告该样品的鼠单位为: ×××MU,100 g。 5 MU,100 rain内均不死亡,则也可报告该样品的鼠单位小于400 g。 若实验组中所有小鼠在观察1 5009(2 1 3— 2008 GB,T 附录A (规范性附录) 麻痹性贝类毒素死亡时间一鼠单位的关系 麻痹性贝类毒素死亡时间鼠单位的关系见表A(1。 1 表A 麻痹性贝类毒素死亡时间鼠单位的关系 时间 时间 鼠单位MU鼠单位MU l+00” 1004’20” 2 261’1 0” 66 2 4’25” 2 2l 1’1 5” 38 3 4’30” 2 1 6 d 1’20” 26 4’3矿 2 1 2 1 725” 20 7 4‘40” 2 08 1+30” l 6 5 04 2 4+4r 1+35‘‘ 1 3 9 4 750” 2 001’40” 1I 9 4 55” 1 96 1 1’15” 1 5 700’’ 0 】921 50’’ g(33 5‘05” 1(89 I 8 42 75r 5’IO” 1 86 2‘00” 7 67 5+1 5” l 83 2+05” 7 04 5’20” l 80 2’10” 6 5’30” 1 52742’1 5” 6 06 5 740” 1 60 720” 2;(66 5’45” 1 67 7’2725 j 32 5 750” 1 64 2 730” 5 6+00” l 00602‘35” 4 73 6+15” l 54 2+40” 4 48 6’30” 1 48 2’45” 4 6’4 5? 4 26 1 32’50” 4 06 7’0。” 1 39 7 2’55’’ 3(88 715” 1 35 3’00” 3(70 7‘30” 1(3l 3’05” 57 7‘4 5” 1 3 28 3 43 8+00” 3‘10” l 25 8+15” 3 31 3‘l 5” 1 22 3 19 3’20” 8’30” 1 20 3‘25” 3 08 8’45” 1 18 3’30” 2 98 9’00” 1 16 7’9 730 2 3’35’’ 88 1 132 7‘ j10’OO“ 3’40” l 11 3’45” 2 71 10’30” l 09 3 750” 2 63 】l’00” 1 075 11’30+7 3 755” 2 56 l 06 2 12 4?” 504‘?” l 0j4‘05” 2 4 4 13+00” 1 03 4‘1旷 2 1 4+00” 385 1(01 4‘1 322 5” 15’00” 1(000 5009(2 1 3— 2008 GB,T 表A(1(续) 时间 时间 鼠单位,MU 鼠单位,Mu l6‘oo” 23’00” 0 99 0 942 l 7‘0旷 24’oo” 0(98 0 93718‘00” o 972 25+oo” o 934 l 9’00” o 30‘00” 91 7 9650 20’。o” 96 40‘00” o 0 89821’oo” 0 95 4 60’00” o 875 22 700” 0 948 CB,T 5009(213—2008 附录B (规范性附录) 小鼠体重校正表 小鼠体重校IF系数『见表}{1。 表B(1小鼠体重校正表 小鼠体重g 校正系数 10 o 50 1 o 5 o 5311 o(56 0 59 ?5 2 o 62 1 2 5 o(6513 o 675 1 3 5 o 70 1l o 7311 5 o 76 1 5 0(785 lj 5 o 8l 16 o 84 16 5 o 86 l 7 o 881 7 5 o(905 18 o(93 l 8 5 o 959 o(97 I”5o 985 2n1 ooo20 5 l 01 5 21 1(03 21 5 1 04 22 l_05 5 1 22 0623 1(07
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