甲酸对谷蠹乙酰胆碱酯酶及酯酶活性的影响

甲酸对谷蠹乙酰胆碱酯酶及酯酶活性的影响 甲酸对谷蠹乙酰胆碱酯酶及酯酶活性的影 响 第39卷甲酸对谷蠹乙酰胆碱酯酶及酯酶活性的影响?7? 业业坐业船 ;储粮有害生物及防治技术:}带带芥带带芥带芥带恭芥芥带蒂带 甲酸对谷蠹乙酰胆碱酯酶及酯酶活性的影响 徐丽贺艳萍陈思思何君谢令德 (武汉工业学院食品学院武汉430023) 摘要研究离体条件下甲酸对谷蠹酯酶和乙酰胆碱酯酶的抑制作用,结果明较高 浓度 的甲酸对谷蠹酯酶和乙酰胆碱酯酶有抑制作用,但其抑制中浓度远远高于甲酸乙 酯对谷蠹的致 死中浓度,这说明甲酸对害虫酯酶和乙酰胆碱酯酶的抑制作用不是甲酸乙酯杀虫 的主要机理. 关键词甲酸乙酯甲酸酯酶乙酰胆碱酯酶谷蠹 甲酸乙酯是一种很有潜力的熏蒸剂,具有很好 的速效性,在空仓中24h时就能达到较理想的熏 蒸效果;甲酸乙酯还是一种环境友好型熏蒸剂,许 多谷物,干果,蔬菜以及动物性产品牛奶,奶酪等 都能产生甲酸乙酯.一般情况,在水中甲酸乙酯的 水解反应较慢,但在粮食中,尤其是在温暖而潮湿 的粮食中反应较快],所以甲酸乙酯在粮食中的残 留期较短.甲酸乙酯进入昆虫体内水解为甲酸和乙 醇,乙醇为无毒物质,甲酸能够抑制昆虫的细胞色 素c氧化酶的活性,导致昆虫死亡l_2].为了研究甲 酸乙酯进入昆虫体内后,对昆虫的其他酶有无影 响,本文研究了甲酸对谷蠹酯酶和乙酰胆碱酯酶的 体外抑制作用. 1材料与方法 1.1供试昆虫 实验谷蠹为室内饲养种群,饲养条件为:温度 (27?1)?,相对湿度75?5,用半碎小麦饲 养.饲料所用小麦需80~C灭菌2h后调节含水量为 139/6?1,试虫为羽化7d,14d的成虫. 1.2主要试剂 a一萘酚(分析纯,湘中地质试验研究所);牛 血清白蛋白(Roche分装,武汉生产);考马斯亮 蓝G一250(进口分装,武汉生产);碘化硫代乙酰 胆碱(进口分装,国药集团生产);二硫双对硝基 苯甲酸(DTNB)(进口分装,国药集团生产);十 二烷基硫酸钠(电泳级,武汉生产);坚固兰B盐 (sigma进口,武汉生产);TEMED(N,N,N, N一四甲基乙二胺),AP(过硫酸胺),Tris(三 *通讯地址:武汉市汉口常青花园中环西路特l号 羟基氨基甲烷),溴酚蓝,甘油,甘氨酸,Act (丙烯酰胺),Bis(甲叉双丙烯酰胺);硼酸(分析 纯,上海生产);一NA(分析纯,国药集团生产); 甲酸(分析纯,天津生产). 1.3酯酶活性的测定及计算 酯酶活性测定参照VanAsperene[a]的方法, 以a—NA溶液为底物测定酯酶活性. 1.3.1a一萘酚曲线的制备以不同含量的 a一萘酚溶液,在600nm处测OD值,以a一萘酚 含量为纵坐标,以OD值为横坐标绘制标准曲线. 1.3.2酶源的制备试虫先用水漂洗2,3次, 再用0.1toolpH7.4磷酸缓冲液漂洗2,3次,将 虫体分成三个重复组,每个重复组的虫体加人1 mI0.1molpH7.4磷酸缓冲液溶液于冰水浴中充 分匀浆,4?,12000g离心15rain,取上清液作 为待试酶液. 1.3.3酯酶比活力测定将酶液用匀浆缓冲液 稀释25倍,使测得的数值在标准曲线范围内.在 225L酶液中加人2025L0.3mmola—NA溶液 (抑制剂体积占酶液的1/10,抑制5min后加底 物),放入37?电热恒温水浴锅内反应3Omin.取 出,再加入750固蓝B溶液,室温放置15rain 后在600nlTl处比色,以磷酸缓冲液为空白对照. 根据所测定OD值和a一萘酚标准曲线计算出每毫 升酶液生成的a一萘酚的量,计算出酯酶的比活 力. 酯酶比活力(nmol/min/mg):== a一萘酚产量(g) a一萘酚分子量×样品体积(I)X30minX样品蛋白浓度 ? 8?粮食储藏 1.4酶源蛋白含量测定 参照Bradford[4]记述的考马斯亮蓝G250染色 法测定. 1.4.1蛋白质标准曲线的制备取各浓度的牛 血清白蛋白溶液0.5mL于试管中,对照组取0.5 mL纯净水,再加入2.5mI考马斯亮蓝G250试 剂,25?水浴加热2min,595nm下测定OD值, 以牛血清白蛋白的含量为纵坐标,以OD值为横坐 min后,在其中加入60mg固蓝,室温放置4min 后可看见条带,用流水冲洗凝胶,条带将会加深, 拍照记录结果. 1.6.2酯酶抑制染色按上述步骤电泳结束, 染色时,0.25mol硼酸溶液浸泡后,凝胶先在抑 制剂中室温放置10min,然后再按上述步骤继续 用a—NA为底物进行染色,拍照记录结果. 2结果与分析 标绘制标准曲线. 1.4.2酶源的制备与所测的酶活酶源制备方2.1蛋白质标准曲线和~l--萘酚标准曲 线 法相同. 1.4.3测定方法吸取酶液0.5mL于试管中, 对照管中则加入0.5mI纯净水,加入2.5mL考 马斯亮蓝G250试剂,混匀25?恒温水浴下放置2 min,595nm下比色测定OD值,重复3次,取平 均值,根据标准曲线计算出蛋白质含量. 1.5乙酰胆碱酯酶(Ache)的测定 1.5.1酶源的制备同酯酶酶源的制备,所不 同的是以0.50Ttitonx--100的磷酸缓冲溶液作为 均浆缓冲液. 1.5.2乙酰胆碱酯酶比活力测定参照Ell— man[5]的方法测定乙酰胆碱酯酶活性.取待测酶液 0.15mL与0.15mLATCh混匀(gO制剂体积占 酶液的1/10,抑制5min后加底物),30.C水浴反 应15min后加入2.7mI显色剂(DTNB)中止反 应,在412nm下测定OD值.AChE催化ATCh 水解产生硫代胆碱和乙酸.硫代胆碱与DTNB结 合生成黄色的5一硫一2一硝基苯甲酸盐离子,此 物质在412nm处有最大吸收峰. AChE比活力(ffmol?min?mg) .—— AOD/mgXV— s×L 其中:?0D=0D/反应时间(单位为min); 为反应总体积(单位为mI);e为产物与DTNB 络合物的摩尔消光系数一13600L/mol/cm;L为 比色杯的光程=1cm. 1.6酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳[8? 1.6.1酯酶活性染色制备非变性聚丙烯酰胺 凝胶:1O的分离胶和4浓缩胶;根据蛋白浓度 计算上样量,保证每孔80g蛋白;200V电压 4~C电泳1h;用a—NA为底物进行活性染色:凝 胶在0.25tool的硼酸溶液中浸泡15min后,把凝 胶转移至50mL0.1molpH7.4磷酸缓冲液溶液 中,加入0.5mL15mg/mIa,NA,室温放置2 由牛血清白蛋白浓度与吸光度的相关关系,得 回归直线方程为:Y=159.94x一2.5358(R一 0.997);由a一萘酚与吸光度相关关系,得回归直 线方程为:y一12.356x一0.1183(R2一O.9988). 2.2甲酸对谷蠹酯酶及AChE酶活性影响 表1甲酸对谷蠹酯酶和AChE的影响 (单位:nmol/min/mg) 注:结果表示为平均值?标准差(n=3);平均值后的相同字母表示同一 列的校正比活力没有显着差异(IFishe1's多重比较p>0.05) 1H? 图1谷蠹酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 从表1可看出,较高浓度的甲酸对谷蠹酯酶有 渐 抑制作用,随着甲酸浓度的增大,酯酶比活力逐减少,0.4mol/L甲酸对酯酶抑制率达到88.92, 酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也显示出,在0.4 mol/I甲酸抑制后谷蠹酯酶条带减少(图1).甲 酸对谷蠹AChE有同样的抑制规律,随着甲酸浓 第39卷甲酸对谷蠹乙酰胆碱酯酶及酯酶活性的影响?9? 度的增加,AChE比活力逐渐减少,但是其抑制中 浓度都较高,由表1可得甲酸对谷蠹酯酶和AChE 的抑制中浓度(J5.)分别为0.21mol/L,0.41 mol/I,远远高于甲酸乙酯对谷蠹的致死中浓度 (LC5o)2.01×10一mol/I. 图1中:I表示谷蠹酯酶非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳结果,?表示谷蠹酶液在电泳上样前用0.4 mol/I甲酸抑制5rain后的电泳结果,?表示谷蠹 酶液电泳后染色前用0.4mol/L甲酸抑制10min 后的电泳结果. 3讨论 AChE是生物神经传导中一个关键性的酶,它 通过迅速水解神经递质乙酰胆碱(ACh)而终止突 触传递.在昆虫中,AChE是有机磷和氨基甲酸酯 类杀虫剂的靶标.实验表明较高浓度的甲酸对谷蠹 AChE有一定的抑制作用,但是其抑制中浓度远远 高于甲酸乙酯对谷蠹的致死中浓度,这说明甲酸对 谷蠹AChE的抑制作用并不是甲酸乙酯杀虫的主 要机理,AChE不是甲酸乙酯的杀虫靶标酶. 酯酶是一类可以水解酯键的酶,通过破坏药剂 的酯键而使药剂失去杀虫活性,所以它在昆虫的体 内主要起解毒的作用,并在昆虫毒理学中将其作为 判断害虫抗药性上升的主要指标_8].但是,甲酸乙 酯不同,因为甲酸乙酯酯键断裂后,水解为有毒物 甲酸,而甲酸对害虫具有明显的杀伤作用,酯酶活 性越高,越有利于甲酸乙酯杀虫,而高浓度的甲酸 对酯酶有一定的抑制作用,三者之间的关系还有待 更进一步的研究. 参考文献 1DamcevskiKA,AnnisPC,Twootdfumigantsforthe newmillennium.In:Zalucki,MP.,Drew,R八 L,White,G.G.(EdS.),Pestmanagement--future challenges.ProceedingsoftheSixthAustralasianAp— pliedEntomologicalResearchConference,Brisbane, Australia,vo1.2.UniversityofQueensland,1998 p307 2.HaritosVS,DojchinovG,CytochromeCoxidasein- hibitioninthericeweevilSitophilusoryzae(L)byfor— mate,thetoxicmetaboliteofvolatilealkylformats. ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartC2003 136:135,143 3VanAsperenKAstudyofhouseflyesterasesby meansofasensitivecolorimetricmethod.J.Insect Physio1.,1962,8:401,416 4BradfordMMArapidandsensitivemethodforthe quantificationofmicrogramquantitiesofproteinutili— zingtheprincipleofproteindyebinding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248,254 5EllmanGL,CourtneyKD,AndresVJ.Anewand rapidcolorimetricdeterminationofanacetylcholinester- aseactivity[J].BiochemicalPharmacology,1961,7: 88,94 6ManclhenkoGP.Handbookofdetectionofenzymeson electrophoreticgels.CRCPress,BocaRaton,FL, 1994,P.341 7ZhuKY,HeFQ.Elevatedesterasesexhibitingaryles- terase--likecharacteristicsinanorganophate--resistant cloneofthegreenbug,Schiaphisgraminum(Ho— moptera:Aphididae).Pestic.Biochem.Physiol, 2000,67:155167 8李士根,刘永春.蚊类抗药性机制研究进展.中国媒 介生物学及控制杂志,2001,12:7678 (收稿日期:2010O122) EICrSOF删ICACIDONAChE ANDESrERASE0lFRHlYZ0lPERTTHAD()!MfNICAJNvITR0 XuLiHeYanpingChenSisiHeJunXieLingde (InstituteofFoodScienceandEngineeringofWuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023) Theinhibitioneffectsofformicacidonacetylcholinesterase(ACHE)andesteraseofRhyzopertha dominicainvitrowerestudiedinthispaper,theresultsshowedthatahigherconcenerationofformicacid hadinhibitioneffectsonesteraseandAChEinRhyzoperthadominica,butitsLC5owasmuchhigherthan theLqooftheethylformatetoRhyzoperthadominica,SOitwasnotthemajormechanismthatethylfor— matekillinsectsbytheinhibitionofformicacidtoesteraseandAChEofRhyzoperthadominica. Keywords:ethylformate,formicacid,esterase,acetylcholinesterase,Rhyzoperthadominica