测定细菌生长曲线

测定细菌生长曲线 微生物实验 实验七 测定细菌生长曲线 一、 实验目的 1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时; 2. 学习液体培养基的配制以及接种方法; 3. 反复练习无菌操作技术; 4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同; 5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法 二、 实验原理 将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线(如图一)。 图一 微生物生长曲线示意图 单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即?调整期(延滞期)、?对数期(生长旺盛期)、?平衡期(稳定期)、?死亡期(衰亡期)。 生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值(OD600)与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。 从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。其计算公式为: t,t21G, (lgW,lgW)/lg221 式中t1和t2为所取对数期两点的时间; W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量(g/L)或OD。 三、 实验仪器、材料和用具 1. 实验材料:大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板; 2. 培养基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基 微生物实验 3. 实验仪器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培养箱, 摇床，722s分光光度计; 4. 实验用具:无菌1000ul吸头80个;无菌5000ul吸头2个;比色皿9个+共用参比杯一个. 四、 实验步骤 1. 准备菌种:将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37?振荡培养18h，另 外准备单菌落平板各1块 2. 分为三个小组: 第(1)小组 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基, 37 ? 200rpm 取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 200rpm 取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 200rpm 第(2)小组 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基， 37 ? 200rpm 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 110rpm 取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基， 30 ? 200rpm 第(3)小组 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 37 ? 200rpm 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 30 ? 200rpm 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 37 ? 110rpm 每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次). 对照组测量起始pH,所有瓶子测量发酵9h结束测pH. 3. 测量:选用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开始培养前测定每组培养液的OD值 作为起始点。开始培养后，每小时吸取测定一次OD值。 五、 实验结果及分析 1. 实验数据: 表一 三个小组时间-OD数据 开始取样时间 10:55 12:01 12:39 13:17 13:53 结束取样时间 9:55 11:01 12:09 12:47 13:23 13:59 发酵时间 0 1 2 2.5 3 3.5 0.004 0.024 0.027 0.027 0.025 0.036 单菌落 -0.010 0.049 0.164 0.255 0.312 0.327 37?110rpm -0.010 0.043 0.088 0.158 0.242 0.361 30?200rpm 大肠 0.010 0.070 0.158 0.266 0.372 0.436 杆菌 1.0mL 0.039 0.096 0.257 0.373 0.420 0.451 ODt 3.0mL 0.067 0.134 0.302 0.361 0.334 0.456 5.0mL 0.008 0.023 0.076 0.132 0.184 0.254 37?200rpm 枯草0.013 0.032 0.052 0.088 0.091 0.125 30?200rpm 杆菌 0.007 0.017 0.098 0.130 0.230 0.253 37?110rpm 0.004 0.020 0.023 0.023 0.021 0.032 单菌落 -0.010 0.059 0.174 0.265 0.322 0.337 37?110rpm -0.010 0.053 0.098 0.168 0.252 0.371 30?200rpm 大肠OD=ODt-OD0 0.010 0.060 0.148 0.256 0.362 0.426 杆菌 1.0mL 0.039 0.057 0.218 0.334 0.381 0.412 3.0mL 0.067 0.067 0.235 0.294 0.267 0.389 5.0mL 微生物实验 0.008 0.015 0.068 0.124 0.176 0.246 37?200rpm 枯草0.013 0.019 0.039 0.075 0.078 0.112 30?200rpm 杆菌 0.007 0.010 0.091 0.123 0.223 0.246 37?110rpm 开始取样时间 14:29 15:35 16:43 17:50 18:57 19:07 20:12 结束取样时间 14:35 15:43 16:50 17:57 19:09 20:07 21:12 发酵时间 4 5 6 7 8 9 10 0.065 0.267 0.395 0.454 0.457 单菌落 0.333 0.340 0.342 0.360 0.362 37?110rpm 0.439 0.566 0.570 0.588 0.586 30?200rpm 大肠ODt 0.464 0.446 0.446 0.458 0.440 杆菌 1.0mL 0.487 0.470 0.457 0.483 0.458 3.0mL 0.469 0.457 0.464 0.482 0.478 5.0mL 0.061 0.263 0.391 0.450 0.453 单菌落 0.343 0.350 0.352 0.370 0.372 37?110rpm 0.449 0.576 0.580 0.598 0.596 30?200rpm 大肠OD=ODt-OD0 0.454 0.436 0.436 0.448 0.430 杆菌 1.0mL 0.448 0.431 0.418 0.444 0.419 3.0mL 0.402 0.390 0.397 0.415 0.411 5.0mL 2. 作图、简要分析及代时计算: 1) 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基， 37 ? 200rpm 图一 单菌落大肠杆菌生长曲线 这条曲线属于比较的“S”形曲线，很容易看出调整期和对数期，由于单菌落菌较少，而且从固体培养基转移至液体培养基环境变化较大，所以出现了长达4小时的调整期，但可以看出，调整期之后这瓶菌都生长良好。 计算代时:取培养4小时到5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。 由代时计算公式，t,t=1h W=0.061 W=0.263 2112 t,t1h21,,0.474hG,代时 (lgW,lgW)/lg2(lg0.263,lg0.061)/lg221 2) 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 110rpm 微生物实验 图二 大肠杆菌菌生长曲线(取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，37 ? 110rpm) 接种后几乎没有调整期出现，大肠杆菌很快适应了新的环境并开始呈指数增长，估计是新的培养环境和原有环境较一致，而且在培养最初的时候溶氧和酸碱度都较为适宜，但是这瓶菌是稳定期OD最小的，估计是培养基最初分装不均产生的。 计算代时:取培养2小时到2.5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。 由代时计算公式，t,t=0.5h W=0.174 W=0.265 2112 t,t0.5h21,,0.824hG,代时 (lgW,lgW)/lg2(lg0.265,lg0.174)/lg221 3) 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30 ? 200rpm 图三 大肠杆菌生长曲线(取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，30 ? 200rpm) 可以看出温度对大肠杆菌适应环境产生了一定的影响，使它在调整期滞留了较长的时间，且在对数期增长较慢，应该是酶活性对细胞复制的影响所致。 微生物实验 计算代时:取培养2.5小时到3.5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。 由代时计算公式，t,t=1h W=0.168 W=0.371 2112 t,t1h21,,0.875hG, 代时(lgW,lgW)/lg2(lg0.371,lg0.168)/lg221 4) 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基, 37 ? 200rpm 图四 大肠杆菌生长曲线(取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基, 37 ? 200rpm) 这是大肠杆菌培养的最适调节，可以看出其生长良好，调整期较短，对数期较长。 计算代时:取培养2小时到3小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。 由代时计算公式，t,t=1h W=0.148 W=0.362 2112 t,t1h21,,0.775hG,代时 (lgW,lgW)/lg2(lg0.362,lg0.148)/lg221 5) 取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 200rpm 微生物实验 图五 大肠杆菌生长曲线(取3.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，37 ? 200rpm) 接种量的增加没有产生太大的影响，生长曲线没有太大变化。 计算代时:取培养2小时到2.5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。 由代时计算公式，t,t=0.5h W=0.218 W=0.334 2112 t,t0.5h21,,0.812hG,代时 (lgW,lgW)/lg2(lg0.334,lg0.218)/lg221 6) 取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 200rpm 图六 大肠杆菌生长曲线(取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 ? 200rpm) 3小时出现了一次明显的波动，应该是测量过程中没有摇匀的结果，忽略它之后，这条生长曲线属于正常形态，比较前两天生长曲线，发现5mL得到的最大OD反而减小了，说明在一定量的培养基下，初始接种量对最后结果影响不大。最大OD应该是受到了最初添加培养基的影响。 微生物实验 计算代时:取培养1小时到2小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。 由代时计算公式，t,t=1h W=0.067 W=0.235 2112 t,t1h21,,0.552hG, 代时(lgW,lgW)/lg2(lg0.235,lg0.067)/lg221 3. 发酵结束pH 对照组pH=7.5 实验结束后所有瓶pH均小于6.4 pH全部降低，说明大肠杆菌和枯草杆菌发酵均产生了酸。 4. 分析 表二 不同环境和菌种生长比较 生长曲线状态 培养摇床代时培养菌 接种量 温度转速调整对数/min 稳定期OD(取8小时OD) / ? /rpm 期/h 期/h 28.5 单菌落 37 200 4 3 0.453 49.4 1.0mL 37 110 1 3 0.372 52.5 1.0mL 大肠杆30 200 2 3 0.596 46.5 菌 1.0mL 37 200 1 3 0.430 48.7 3.0mL 37 200 1 2 0.419 33.1 5.0mL 37 200 1 2 0.411 1) 接种量对微生物的影响: 预期:接种量大，调整期缩短，对数期增长，稳定期OD增大，代时缩短。 原因:接种量大的细胞基数大，因而更快适应环境。 实际:调整期影响不大，对数期稍有缩短，稳定期OD减小，代时规律不明显。 分析:生长曲线受各种因素调节，这里实验结果不同于预期应该是受到培养基的限 制，接种量大对氧气和原料需求更多，而且产生酸的速度也快，也许对后来的细胞 生长造成了一定的影响。 2) 培养温度对微生物的影响 预期:最适温度下细胞生长应该最快，调整期最短，稳定期OD最大，代时最短 原因:温度影响细菌内酶活力和细胞膜的通透性，进而影响新陈代谢，从而影响细 菌的生长繁殖。最适温度下，细菌酶活性最强，因而能最快适应环境，并取得生长 增殖的最高效率。 实际:大肠杆菌37?稳定期OD最大，调整期更短，但代时更长。枯草杆菌37?调 整期更短，对数期更长，稳定期OD更大，代时更短。 分析:大肠杆菌代时的问题应该来自实验误差，如取样未摇匀、计算时取点不够准 确，或实验过程中某些操作导致生长和理论不一致。 3) 摇床转速对微生物的影响 预期:转速高，调整期短，对数期长，稳定期OD大，代时短 原因:转速影响溶氧，溶氧高，生长情况应该越好 实际:大肠杆菌与预期符合;枯草杆菌转速快的调整期长，代时长。 分析:原因可能有两点，一是枯草杆菌在溶氧高的环境下生长没有那么好，说明它 是微好氧生物，但这与实际不符;二是其他条件限制，虽然说两个培养瓶进行对照 要求其他条件一致，但是由于培养基分配及其其他各种原因，其他条件可能并不一 微生物实验 致而且还产生了比对照条件还要大的影响。 4) 生长曲线分析 两个菌的生长曲线都包括了调整期、对数期和稳定期，实验没有进行到衰亡期因为 而没有观察到后来的OD值下降。 这是一个大组合作、小组分工的实验，每一组的结果都影响了整个大组队结果的分析， 这就要求我们的合作。和暑期实验不同，这次实验在时间上缩短了，但是在内容上却增 多了，由于有很多组的平行比较，所以得到的信息量也相应加大，这些信息中又包含了 这种各样的误差，所以要求我们自己在处理别人的实验结果中也加入自己的分析。总的 来说，这是个很有意思也很有意义的实验。 六、 思考 1. 计算出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基中对数生长期中的代时 (min)(繁殖一代的时间)，为什么比理论时间长好多, 代时见表二。 经查资料得:大肠杆菌理论代时为37度时18分钟，而枯草杆菌一般是给30度下 的理论代时为31分钟，实验测得代时长于理论值的原因: 理论代时是在理想的培养条件下测得，糖分、氧气等营养物质供应充足，细菌生长 状况良好，之前的分裂次数较少。实际实验条件与理论值条件存在差距。如培养过程中 不补料，营养物质有限。单纯的振荡不能保证体系中有足够的溶氧。对培养液的pH值， 氧化还原电势也未加控制，测量过程中温度不能保持稳定等等。 2. 为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况, 培养液的浑浊度与细菌的浓度与成正比，可以利用分光光度计测定细菌浊液的光密度来 推知菌液的浓度。浊度的变化代表体系细菌数量的变化。 其原理是:一个细胞悬浮液用肉眼观察是呈现混浊的，这是因为光线通过悬浮液是，细 胞散射光线。存在的细胞数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。通过分 光光度计可以检出没有被细胞散射的光线。对于大肠杆菌和枯草杆菌，从理论上OD值 与细胞总量成正比。可以制备将细胞数目与浊度联系起来的标准曲线。 3. 生长曲线中为什么会有稳定期和衰退期, 当细胞的繁殖速度达到高峰时，其细胞总数就不会再增加，这是由于调整期、对数 生长期两阶段糖类营养物质的消耗，代谢产物乙醇的积累及培养基的pH值、氧化还原 电势的改变，对细胞产生了较大的抑制性。当死亡细胞数和繁殖细胞数接近稳定时，就 出现稳定期，细胞总数处于稳定状态。 进入稳定期后，如果继续培养，由于营养物质(如糖类和氧气)的进一步消耗，代 谢物的进一步积累，溶液进一步酸化，导致细胞死亡的速率提高。当细胞死亡数超过繁 殖数时，活细胞总数不再稳定，生长曲线进入衰退期。 4. 什么条件下接种为宜,液体种子比固体种子有什么优越性, 接种时以分裂次数少、生长状况良好的种子为宜。 液体种子较之固体种子，迟滞期略短，对数生长期较长，代时略短，较晚进入死亡期。 因为从固体中接种到培养液后，细菌需要合成新的RNA、核糖体、酶等才能适应新的生 长条件，需要更长的时间适应。 5. 根据实验结果，谈谈在工业上如何缩短发酵时间, (1)保证充分的营养供应，根据细菌的特性如果是需氧的要保证充足的氧气供应，维持最适宜的温度和pH值，尽快排出代谢废物，随时观察随时监控，这样可以保证细菌的高速生长。 (2)在保证营养的前提下，可以扩大接种量，这样可以缩短调整期。 微生物实验 (3)选取合适的培养基、尽量是与种子生长性质相同或者相近的培养基，选取合适菌龄的种子。 七、 参考文献 陈金春、陈国强编著，微生物学实验，北京，2005。 鸡卵清蛋白基因启动子调控GFP基因在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞的表达 逄越 李庆伟 【摘要】:特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列 1340bp, +16 5 5bp片段和第一内含子 +49bp, +16 5 5bp片段 ,去除pG FP N2载体自身的CMV启动子 ,分别构建了P2 9koval GFP和P1 5koval GFP两种表达载体 ,经测序和酶切鉴定表达载体构建正确。采用脂质体转染法分别将这两种载体、pGFP N2 (阳性对照 )质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞。用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明 :两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达荧光蛋白。结果既显示卵清蛋白第一内含子对基因的表达起到一定的调控。 , 慢病毒载体介导不同内部启动子驱动绿色荧光蛋白表达效率 目的在人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)慢病毒载体中引入三种不同的内部启动子来驱动绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达，初步比较内部启动子的效率。方法慢病毒载体三质粒系统中，转移质粒的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接方法和内切酶酶切鉴定。磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T包装细胞。病毒滴度的测定采用6孔板培养感染细胞，荧光显微镜计数GFP阳性细胞。通过荧光显微镜观察绿色荧光的表达情况判断启动子的效率。结果构建了含PPT元件和含不同内部启动子和GFP的质粒。转染293T细胞后均观察到较强的绿色荧光。表达荧光的293T细胞数以巨细胞病毒(CMV)启动子最多，肝细胞特异性启动子(LSP)较少，泛醌启动子(PUB)介于两者之间。CMV为内部启动子的慢病毒载体滴度5×10^6IU,ml，其他二种启动子的滴度(1,2)×10^5IU,ml。结论在所选择的三种内部启动子中，CMV启动子的效率最高，LSP较强，PUB介于两者之间。 CMV:CMV基因组有229kb，属疱疹病毒亚β科。CMV DNA只有一个单向性的IE启动子复合体，可 指导多个基因的表达[1]。在IE94基因上游存在一个强启动子，IE94的上游区比SV40病毒的72bp重 复序列具有更高的增强子功能。IE94基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间 着保守的序列。在这一区段的-50,-580bp之间至少有4套13,18bp的重复序列。IE1和IE2蛋白的表 达受增强子的调控，此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2增强子或CMV增 强子，是上游调节区复合体的一部分。因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在 多种类型的细胞的影响条件下均有活性。根据对基因表达的影响可将此增强子分为3个区。在CMV 感染中，增强子调控的表达先激活后抑制。在CMV复制早期可诱导NF-κB、AP-1和CREB/ATF等细胞 转录因子与增强子中多位点结合。感染后可诱导产生NF-kB和 aP-1。在感染晚期，ATF的结合受影响， 其活性受病毒基因产物的调节。 CMV启动子/增强子被广泛应用于构建高效真核表达载体，用于基因、基因治疗和DNA免疫 [9]。用基因小鼠分析CMV增强子活性，其主要立即早期启动子(MIEP)的转录活性可能部分决定病 毒在子宫内特异性感染胎儿组织的能力[10]。MIEP不是广泛特异性的启动子，因在转基因小鼠中，表 微生物实验 达由MIEP调控的基因的组织和CMV自然感染的组织一致的