桃核承气汤对庆大霉素肾毒性大鼠的治疗作用研究_135516

桃核承气汤对庆大霉素肾毒性大鼠的治疗作用研究_135516 桃核承气汤对庆大霉素肾毒性大鼠的治疗作用研究 [标签:来源] 作者:刘煜敏，张悦*，郝艳鹏，王飞，陆敏 【摘要】 目的观察桃核承气汤对庆大霉素所致大鼠肾毒性损伤模型的治疗作用及部分机制。 方法采用腹腔注射庆大霉素法制作大鼠肾毒性模型，通过生化、病理检测和蛋白免疫印迹方 法观察各组大鼠肾功能、肾组织病理形态、氧化产物及酶类的变化及信号通路分子p38、核 因子κB(NF-κB)蛋白表达的变化，明确桃核承气汤的疗效。结果桃核承气汤治疗一周后，可 改善肾功能，减轻肾组织病理改变，显著降低肾皮质MDA含量和NOS酶活性、提高SOD酶活 性，NF-κB蛋白表达明显减少。结论桃核承气汤可以通过改善肾脏氧化损伤对庆大霉素肾毒 性起到一定的治疗作用。 【关键词】 桃核承气汤;庆大霉素;核因子κB;肾毒性 Abstract:ObjectiveTo study the therapeutic effect of Taohe Chengqi Decoction (TCD) on gentamicin-induced kidney lesion in rats.MethodsThe renal injury model was established by Gentamicin i.p. The kidney index，pathomorphology，and level of oxidative production and expression of Nuclear Factor-κB (NF-κB) protein in kidney cortex were measured to observe the effect of TCD on kidney injury of rats.ResultsAfter one week therapy, parameters of kidney indexes, oxidative production MDA and enzyme activity of NOS in kidney cortex of Gentamicin group were significantly decreased (P<0.05), and enzyme activity of SOD was significantly increased( P<0.05). The protein expression of NF-κB was significantly down-regulated (P<0.05).ConclusionTaohe Chengqi Decoction has some therapeutic effect on Gentamicin-induced kidney lesion through alleviating renal oxidation. Key words:Taohe Chengqi Decoction; Gentamicin; Nuclear Factor-κB; Kidney injury 氨基糖苷类抗生素庆大霉素(Gentamicin， GEN) 临床应用于严重革兰氏阴性菌抗感染治 疗，但其肾毒性和耳毒性也是我们不可忽视的重要方面。调查显示，在庆大霉素治疗的病人 中有0.5%,30%可发生中毒性肾损害。虽然其确切机制尚不完全清楚，但研究表明庆大霉素 可增加反应性氧化产物的生成，通过脂质过氧化引起肾功能的改变是其肾毒性发生的重要原 因。本研究主要观察经典方桃核承气汤对大鼠庆大霉素肾毒性是否具有保护作用并初步探索 药物作用机制。 1材料与仪器 1.1 动物健康雄性Wistar大鼠(180?20)g共24只，由上海中医药大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(沪)2007-0005。 1.2 药物与试剂桃核承气汤组成:桃仁12 g，大黄12 g，桂枝6 g，甘草6 g，芒硝6 g，购自上海蔡同德堂药号，按比例称量，水煎，浓缩至生药浓度为0.438 g/ml，冰箱保存备用。硫酸庆大霉素注射液购自上海中西制药有限公司，批号080303。尿蛋白定量试剂盒，MDA、SOD、NOS检测试剂盒购自南京建成生物公司。兔抗鼠p38抗体、兔抗鼠NF-κB抗体购自Cell Signal公司，小鼠GAPDH- HRP抗体购自上海康成公司，山羊抗兔?抗购自明睿生物有限公司。BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Pierce公司，PVDF膜购自Millipore公司。其他试剂均为国产分析纯。 1.3主要仪器全自动生化分析仪(KONELAB公司)，752型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，酶标仪(BIOTEK公司)，电泳装置(美国Bio-Rad公司)。 2 方法 2.1 动物分组与造模实验动物随机分为正常对照组、模型组和桃核承气汤组各8只。各组动物均给予正常饮食，模型组和桃核承气汤组给予腹腔注射庆大霉素80 mg/kg体重造模，2次/d，连续9 d。第9日即断尾取血检测肾功能以确定模型制备是否成功。 2.2 给药方法及取材根据《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》换算动物用药量;桃核承气汤水煎剂生药浓度为0.438 g/ml。造模结束次日起，桃核承气汤组即按1 ml水煎剂/100 g体重灌胃，正常对照组和模型组予同体积生理盐水灌胃，直至取材。给药一周(7日)末腹主动脉取血处死动物，取双侧肾皮质分装后-80?冻存备用。 2.3肾皮质MDA、SOD、NOS测定制备组织匀浆，按试剂盒操作，采用比色法测定。 2.4蛋白免疫印迹法测定p38、NF-κB蛋白表达电动匀浆机匀浆，组织裂解液抽提肾皮质总蛋白后BCA蛋白定量试剂盒定量。取等量变性蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭1 h，后分别加入p38抗体、NF-κB抗体(1?500)、GAPDH抗体(1?5 000)，4?摇动过夜。洗膜后用对应二抗(1?5 000)杂交，室温孵育1 h。再次洗膜后用ECL试剂显色并曝光成像。复日图像分析系统扫描确定X光片上的杂交条带的光密度值。 2.5统计学方法计量资料用?s表示，采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析。 3 结果 3.1庆大霉素肾中毒大鼠模型制备结果由表1可见，与正常对照组相比，模型组和桃核承气汤组大鼠血清尿素氮、血肌酐明显增高，提示庆大霉素肾中毒模型制备成功。表1模型 制备第9 d各组大鼠肾功能比较 3.2桃核承气汤对庆大霉素肾中毒大鼠肾体比、肾功能的影响肾体比(%)=两侧肾重之和(g)/体质量(kg) ×100%。由表2可见，与正常对照组相比，模型组大鼠肾体比明显增大，血清尿素氮、血肌酐明显增高;与模型组相比，桃核承气汤组大鼠血清尿素氮含量明显降低。 3.3桃核承气汤对庆大霉素肾中毒大鼠肾组织病理形态的影响光镜观察可见对照组大鼠肾小管结构完整，小管排列紧密。模型组大鼠肾小管上皮细胞大部分变性，偶有坏死;肾小管萎缩和扩张明显，管腔内可见管型;间质炎细胞浸润。桃核承气汤组肾组织病变轻于模型组。结果见图1。表2各组大鼠肾体比、肾功能比较图1治疗第7天大鼠肾组织病理形态变化 3.4 桃核承气汤对庆大霉素肾中毒大鼠MDA含量，SOD、NOS活性的影响由表3可见，与正常对照组相比，模型组大鼠肾皮质MDA含量，TNOS、iNOS活性明显增高;SOD活性明显降低(P<0.05)。与模型组相比，桃核承气汤组MDA含量，TNOS活性明显降低;SOD活性明显增高(P<0.05)。表3各组大鼠肾皮质氧化产物MDA含量及SOD、NOS活性比较 3.5 桃核承气汤对庆大霉素肾中毒大鼠肾皮质信号分子p38、NF-κB蛋白表达的影响由图2、表4可见，与对照组相比，模型组大鼠肾皮质NF-κB蛋白表达明显增高(P<0.05);与模型组相比，桃核承气汤组NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05)。信号分子p38蛋白在各组大鼠肾皮质中表达无显著差异(P>0.05)。1泳道为对照组，2泳道为模型组，3泳道为桃核承气汤组图2各组肾皮质p38、NF-κB蛋白表达的免疫印迹结果表4各组大鼠肾皮质信号分子p38、NF比较 4讨论 庆大霉素广泛用于严重革兰氏阴性菌感染，然而由于它的肾毒性对其临床应用造成了很大的限制。因此，各国科学家越来越关注其肾毒性的发生机制并不断探索可能的防治方法。Koyner等[1]在各种原因引起的急性肾损害模型(包括庆大霉素肾毒性)中研究发现氧化应激诱导的反应性氧代谢物(ROM)产生增多是一个值得关注的共同因素。Yoshikawa 等[2]研究提示庆大霉素肾损害与信号分子磷酸化p38和NF-κB的表达增加有关。Stojiljkovic等[3]在研究庆大霉素肾毒性组织学改变时发现除了能够引起已知的近曲小管上皮细胞脱落坏死外还存在肾小球增大、小球基底膜广泛性弥漫性增厚及中性粒细胞浸润的肾小球病理改变。在防治庆大霉素肾毒性方面，许多研究者不约而同地对天然药物或其提取物产生了极大的兴趣。印度学者发现从蘑菇的菌丝体中提取的水溶性醇类能通过增强肾脏的抗氧化系统(SOD、GSH、CAT)对抗庆大霉素肾毒性[4]。波斯尼亚和土耳其学者都发现顿顶螺旋藻可改善注射庆大霉素的大鼠肾功能、增强肾SOD酶活性，减少MDA产生量和减轻肾脏病变[5，6]。Chiu等[7]研究表明F五味子乙素可通过增强肾脏细胞线粒体抗氧化剂稳态，改善线粒体功能和完整性从而对抗庆大霉素肾毒性。 桃核承气汤由桃仁、大黄、桂枝、甘草、芒硝5味中药组成。《伤寒论》记载:“太阳病不解，热结膀胱，其人如狂，血自下，下者愈。其外不解者尚未可攻，当先解其外。外解已，但少腹急结者，乃可攻之，宜桃核承气汤”。由此可知桃核承气汤能破血逐瘀，清热润燥，主治下焦蓄血证。方中桃核破血行瘀，驱除血中结秘，大黄下瘀泄热，二药合用，以逐下焦瘀热，是为君药;桂枝辛甘温，活血通络，既助桃仁活血祛瘀，又防硝、黄寒凉凝血之弊，芒硝咸苦寒，泻热软坚，助大黄下瘀泻热，共为臣药;炙甘草甘平和中，缓和硝、黄峻攻之性，为 佐使药。诸药相配，共奏破血逐瘀之效。桃核承气汤临床常用于附件炎、急性盆腔炎、肠梗 阻等疾病，也有临床工作者将其用于高胆红素血症、高脂血症、急性阑尾炎等取得满意疗效 [8]。 目前，桃核承气汤在治疗肾病方面的研究主要集中在糖尿病肾病和慢性肾功能衰竭。王 廷春等[9]在对加味桃核承气汤治疗糖尿病肾病138例的临床观察中发现桃核承气汤能改善 糖尿病肾病患者糖、脂代谢紊乱，逆转其肾小球滤过率逐步下降的趋势，减少尿蛋白排出量。 熊曼琪等[10]观察桃核承气汤对糖尿病肾病大鼠肾脏超微结构的影响时发现其能减轻或延缓 模型大鼠肾小球毛细血管基底膜的增厚。赵雪莹等[11，12]采用单侧输尿管梗阻制作肾间质 纤维化模型来观察桃核承气汤及其拆方的影响。结果发现桃核承气汤全方抗肾间质纤维化作 用最强，机制可能与抗炎、抑制促纤维化因子的分泌增加及减少细胞外基质等因素有关。赵 艳明等[13]的研究发现桃核承气汤可明显改善5/6 肾切除所致慢性肾功能衰竭大鼠肾功能 和脂质代谢紊乱。而有关桃核承气汤对庆大霉素肾中毒的防治作用未见报道。本研究从以上 实验结果中得到启示，观察了桃核承气汤对大鼠庆大霉素肾毒性的治疗作用并初步探讨机制。 结果提示桃核承气汤能显著改善庆大霉素肾毒性大鼠肾功能，减轻肾组织病理改变，降低肾 皮质MDA含量和NOS活性、提高SOD活性，并显著降低信号分子NF-κB蛋白表达。由此认为 桃核承气汤对庆大霉素肾毒性的治疗作用可能与其抗肾脏脂质过氧化因素有关。同时，中药 复方发挥作用往往是多途径、多环节、多靶点的，其具体发挥疗效的细胞生物学机制尚待进 一步相关研究。 【参考文献】 [1]Koyner JL, Sher Ali R, Murray PT. Antioxidants. Do they have a place in the prevention or therapy of acute kidney injury[J]. Nephron Exp Nephrol, 2008, 109(4):109. [2]Yoshikawa M, Hishikawa K, Marumo T, et al. Inhibition of Histone Deacetylase Activity Suppresses Epithelial-to-Mesenchymal Transition Induced by TGF-beta1 in human renal epithelial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2007,18(1):58. [3]Stojiljkovic N, Mihailovic D, Veljkovic S, et al. Glomerular basement membrane alterations induced by gentamicin administration in rats[J]. Exp Toxicol Pathol, 2008, 60(1):69. [4]Nitha B, Janardhanan KK. Aqueous-ethanolic extract of morel mushroom mycelium Morchella esculenta, protects cisplatin and gentamicin induced nephrotoxicity in mice[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(9):3193. [5]Avdagic N, Cosovic E, Nakas-Icindic E, et al. Spirulina platensis protects against renal injury in rats with gentamicin-induced acute tubular necrosis[J]. Bosn J Basic Med Sci, 2008, 8(4):331. [6]Karadeniz A, Yildirim A, Simsek N, et al. Spirulina platensis protects against gentamicin-induced nephrotoxicity in rats[J]. Phytother Res, 2008, 22(11):1506. [7]Chiu PY, Leung HY, Ko KM. Schisandrin B Enhances Renal Mitochondrial Antioxidant Status, Functional and Structural Integrity, and Protects against Gentamicin-Induced Nephrotoxicity in Rats[J]. Biol Pharm Bull, 2008, 31(4):602. [8]王莉祥，胡海萍，李承功. 桃核承气汤应用举隅[J]. 时珍国医国药，2000，11(5): 541. [9]王廷春，范冠杰，欧翠柳. 加味桃核承气汤治疗糖尿病肾病138例临床观察[J]. 国 医论坛，2003，15(2):10. [10]熊曼琪，苗理平. 加味桃核承气汤对糖尿病鼠肾超微结构的影响[J]. 中国医药学报， 1990，5(5):25. [11]赵雪莹，李冀. 桃核承气汤及其拆方对单侧输尿管梗阻大鼠TNF IL-6影响的实验研 究[J]. 辽宁中医杂志，2007，34(5):678. [12]赵雪莹，李冀. 桃核承气汤及其拆方对单侧输尿管梗阻大鼠LN、Col IV影响的实验 研究[J]. 中医药信息，2007，24(4):33. [13]赵艳明，李冀. 经方桃核承气汤对5/6肾切除大鼠肾功能和脂质代谢紊乱的影响[J]. 中医药学报，2008，36(1):46.