注射用重组人干扰素α2b(酵母)(新增)

注射用重组人干扰素2b (酵母) Zhusheyong Chongzu Ren Ganraosu 2b (Jiaomu) Recombinant Human Interferon 2b for Injection （Yeast）     本品系由高效表达人干扰素2b基因的酿酒酵母菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1．基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合 “凡例”的有关要求。 2．制造 2.1  工程菌菌种 2.1.1  名称及来源 重组人干扰素2b工程菌株系由带有人干扰素2b基因的重组质粒转化的酿酒酵母菌菌株。 2.1.2  种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。 2.1.3 菌种检定 主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。 2.1.3.1  划种SD琼脂平板 应呈典型的酿酒酵母菌集落形态，无其他杂菌生长。 2.1.3.2 酵母菌形态 在光学显微镜下观察，应为典型的酵母菌形态。 2.1.3.3  干扰素表达量 在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。 2.1.3.4  表达的干扰素型别 应用抗2b型干扰素参考血清做中和试验，证明型别无误。 2.1.3.5  干扰素基因稳定性检查 涂SD琼脂平板，挑选至少50个克隆，用PCR检测干扰素基因，阳性率应不低于95%。 2.2  原液 2.2.1  种子液制备 将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜培养基中培养，供发酵罐接种用。 2.2.2  发酵用培养基 采用适宜的不含任何抗生素的培养基。 2.2.3  种子液接种及发酵培养 在灭菌培养基中接种适量种子液。在适宜的温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、罐压、通气量、发酵时间等。 2.2.4  发酵液处理 用适宜的方法收集处理菌体。 2.2.5  初步纯化 采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。 2.2.6  高度纯化 经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为干扰素原液。加入适宜稳定剂,除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其效期。 2.2.7  原液检定 按3.1项进行。 2.3  半成品 2.3.1  配制与除菌 2.3.1.1  稀释液配制 按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。 2.3.1.2  稀释与除菌 将检定合格的含稳定剂的干扰素原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成品，于2-8℃保存。 2.3.2  半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1  分批 应符合 “生物制品分批规程”规定。 2.4.2  分装及冻干 应符合 “生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3  规格 应为经批准的规格。 2.4.4  包装 应符合 “生物制品包装规程”规定。. 3  检定 3.1  原液检定 3.1.1  生物学活性测定 依法测定（附录X C）。 3.1.2  蛋白质含量 依法测定（附录VI B第二法）。 3.1.3  比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1 mg蛋白质应不低于1.0×108IU。 3.1.4  纯度 3.1.4.1  电泳法 依法测定（附录IV C）。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于10μg(考马斯亮蓝R250染色法)或 5g(银染法)。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。 3.1.4.2  高效液相色谱法 依法测定（附录III B）。色谱柱以适合分离分子量为5-60kD蛋白质的色谱用凝胶为填充剂；流动相为0.1mol/L磷酸盐—0.1mol/L氯化钠缓冲液，pH7.0；上样量应不低于20μg，于波长280nm处检测，以干扰素色谱峰计算理论塔板数，应不低于1000。按面积归一化法计算，干扰素主峰面积应不低于总面积的95.0%。 3.1.5  分子量 依法测定（附录IV C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺电泳法，分离胶胶浓度为15%，加样量应不低于1.0g，分子质量应为19.2kD±1.92kD。 3.1.6  外源性DNA残留量 每1支应不高于10ng（附录IX B）。 3.1.7  宿主菌蛋白残留量 应不高于总蛋白质的0.05%（附录IX E）。 3.1.8  细菌内毒素检查 每1支应小于10EU（附录XII E 凝胶限量试验）。 3.1.9  等电点 主区带应为5.7～6.7, 供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录IV D）。 3.1.10  紫外光谱扫描 用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描，最大吸收峰波长应为 278nm±3nm（附录II A）。 3.1.11  肽图（至少每半年测定一次） 依法测定（附录VIII E），应与对照品图形一致。 3.1.12  N-末端氨基酸序列(至少每年测定一次) 用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为： Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu。 3.2  半成品检定 3.2.1  细菌内毒素检查 每1次人用剂量应小于10EU每300万IU应小于10EU,300万IU/支以上规格的，每支应小于10EU。（附录XII E 凝胶限量试验）。 3.2.2  无菌检查 依法检查（附录XII A ），应符合规定。 3.3  成品检定 除水分、装量差异测定外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余项目的检定。 3.3.1  鉴别试验 按免疫印迹法（附录VIII A）或免疫斑点法（附录VIII B）测定，应为阳性。 3.3.2  物理检查 3.3.2.1外观 应为白色或微黄色疏松体，按标示量加入灭菌注射用水后应迅速复溶为澄明液体。 3.3.2.2可见异物 依法检查（Ⅴ B），应符合规定。 3.3.2.3 装量差异 按附录ⅠA中装量差异项进行，应符合规定。 3.3.3 化学检定 3.3.3.1 水分  应不高于3.0%（附录VII D）。 3.3.3.2  pH值 应为6.5～7.5（附录V A ）。 3.3.3.3渗透压摩尔浓度 依法测定（附录V H），应符合批准的要求。 3.3.4  生物学活性测定 应为标示量的80%～150%（附录X C）。 3.3.5 无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.3.6  细菌内毒素检查 每1支应小于10EU（附录XII E凝胶限量试验）。 3.3.7 异常毒性检查 依法检查（附录XII F 小鼠试验法），应符合规定。 4  保存、运输及有效期 于2～8℃避光保存和运输。自生产分装之日起，按批准的有效期执行。 5  使用说明 应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。