磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价

磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 暨南大学硕士学位论文 摘 要 本研究从细胞膜仿生的角度出发,设计合成一种新的壳聚糖磷酰化衍生物,以磷酰胺 键的方式将细胞膜结构单元磷酸胆碱基团偶联到壳聚糖骨架上,研究其合成方法、生物学 性能及其纳米化方法。 为了合成磷酸胆碱化壳聚糖衍生物,我们研究比较了三种壳聚糖的均相磷酸胆碱化方 法:A采用新型高极性六氟异丙醇作反应介质,基于 Antherton-Todd 反应实现壳聚糖的 直接磷酰化;B利用 N-邻苯二甲酰化壳聚糖为中间体,以二氯磷酰胆碱为磷酰化试剂; C利用 6-O-三苯基甲醚化壳聚糖为中间体,基于 Antherton-Todd 反应实现磷酰化。研究 表明合成路线C适合用来均相合成磷酸胆碱化壳聚糖衍生物。 应用合成路线C,通过改变投料比,基于 Antherton-Todd 反应合成了三种不同取代 + 度的水溶性磷酸胆碱化壳聚糖衍生物。NMR和 FTIR谱图上对应-N CH 基团吸收峰的 3 3 1 出现表明磷酸胆碱基团成功偶联到壳聚糖骨架的氨基上,根据 H NMR 谱图的峰强度比 计算出三种壳聚糖衍生物的取代度分别为 16%、27%和 42%。GPC 数据显示,与壳聚糖 相比,磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的分子量有所降低,分子量分布有所拓宽;XRD、TGA、 DSC 和水溶性实验表明,磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的结晶性能和热稳定性均有不同程度 地下降,但是其在水中的溶解性能得到了很大地提升,三种取代度的衍生物均可溶于 pH1-12 的水溶液中。 细胞毒性实验表明,3T3 细胞与磷酸胆碱化壳聚糖衍生物共培养的相对增殖率在 80%-110%之间,细胞毒性为 0 级或 1 级,属于无细胞毒性范畴;血液相容性实验表明, 引入磷酸胆碱基团可以延缓衍生物的凝血时间,而且可以有效抑制血小板在其上的黏附与 激活;与牛血清白蛋白BSA的相互作用表明,磷酸胆碱基团的引入可以有效 抑制壳聚糖 衍生物与 BSA 之间的相互作用,减小蛋白质的构象改变,这对避免激活因蛋白质构象改 变而导致的不良生物反应具有重要意义。 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物可自组装形成纳米粒子。研究表明,磷酸胆碱化壳聚糖衍生 物仍可与三聚磷酸钠进行离子交联形成纳米粒子,这些纳米粒子呈现规则的球形结构,粒 径在 60-120 nm之间,Zeta 电位介于 18-28 mV;同时,磷酸胆碱化壳聚糖衍生物具有两 亲性,可在中性水溶液中自组装成具有疏水核亲水壳的纳米胶束,由低到高,三种取代度 衍生物的临界胶束浓度分别为 0.129 mg/mL,0.201 mg/mL,0.256 mg/mL。所形成的纳米 I 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 胶束粒径范围在 70-110 nm之间,Zeta电位接近于 0,介于 0-4 mV 之间。这两类纳米粒 子有望应用于药物/基因载体。 关键词:壳聚糖;磷酸胆碱;Antherton-Todd反应;纳米粒子II 暨南大学硕士学位论文 Abstract Through constructing a cell outer membrane mimetic structure, a novel phosphorylated chitosan derivatives were designed to couple phosphorylcholinePC with bioactivity onto chitosan with a phosphamide binding, which can be used in biomedical materialsThree phosphorylated methods of chitosan were investigated, including A 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol used as reaction medium to synthesize phosphorylated chitosan directly based on Antherton-Todd reaction, B using Cs-NPTh as the intermediate and phosphorylcholine dichloride as phosphorylated agent, C Cs-Tr as the intermediate to synthesize phosphorylated chitosan based on Antherton-Todd reaction. It was found that phosphorylated chitosan can be synthesized using method C Using Antherton-Todd reaction, phosphorylated chitosan derivatives with different DS were synthesized. The new peaks in NMR and FTIR spectra indicated that the PC moiety had been conjugated to the amino group of the chitosan. The DS of PC moiety was calculated by the + amount ratio of H of -N CH from PC to H1 from glucosamine units of GlcN and 3 3 1 GlcN-PC based on the H NMR spectra. The DS values ranged from 16 to 42 mol %. The GPC analysis found that PCCs appeared lower Mw values but higher Mw/Mn values compared with the starting chitosan. All these PCCs with decreased crystallization showed excellent solubility in the aqueous solutions within a wide pH range 1-12. TGA and DSC results revealed that the thermal stability of PCCs decresed with the increase of DS valueThe in vitro cycotoxicity of PCCs copolymers was evaluated using a MTT assay performed with NIH/3T3 cells. The cells showed almost 100% viability in the presence of PCCs with different DS value, which suggests that all the PCCs with low toxicity are safety for biomedical application. The blood compatibility were evaluated by means of blood-clotting and platelet adhesion assay. The blood-clotting assay indicated that PCCs could prolong the blood-clotting process. Platelet adhesion assay showed that PCCs could effectively inhibit the platelet adhesion and activation. Using bovine serum albumin BSA as a model protein, UV adsorption spectra and fluorescence spectra revealed that the non-specific interactions between PCCs and BSA were effectively suppressed and the conformation of BSA was almost unchanged with the addition of PCCsIII 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合 成、表征及生物学评价 Further, PCCs nanoparticles could be still formed in a spherical shape similar to chitosan nanoparticles with zeta potential between 18-28 mV by ionically crosslinking with tripolyphosphate TPP, the sizes were in the ranges of 60-120 nm. In addition, the amphiphilic PCCs copolymers could self-assemble to form spherical nano-aggregates. The CMC values of PCCs were in the range of 0.129-0.256 mg/mL. The sizes of PCCs self-aggregates with zeta potential between 0-4 mV were in the ranges of 30-60 nm. These PCCs nanoparticles could be used as promising delivery systems for drug or gene delivery applications Keywords: chitosan; phosphorylcholine; Antherton-Todd reaction; nanoparticles IV 暨南大学硕士学位论文 摘 要. I Abstract III 目 录V 第一章 前言1 1.1 壳聚糖简介. 1 1.2 壳聚糖的应用 1 1.2.1 在医药中的应用 1 1.2.2 在农业中的应用 2 1.2.3 在纺织印染工业中的应用 3 1.2.4 在废水处理中的应用3 1.2.5 在造纸工业中的应用3 1.2.6 在食品工业中的应用4 1.3 壳聚糖的化学改性. 4 1.3.1 酰化改性 4 1.3.2 烷基化改性..5 1.3.3 酯化改性 5 1.3.4 醚化改性 6 1.3.5 季铵化改性..6 1.3.6 接枝改性 7 1.3.7 交联改性 8 1.4 磷酸胆碱8 1.5 磷酸胆碱仿生改性高分子研究进展. 9 1.6 课题的提出10 1.6.1 目的及意义 10 1.6.2 本课题的研究内容..11 1.6.3 本课题的创新之处 12 第二章 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成方法研究 13 2.1 引言13 2.2 合成路线设计. 13 2.3 合成路线可行性研究. 15 2.4 小结17 第三章 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及理化性能18 3.1 引言18 3.2 实验试剂与仪器 18 3.2.1 主要试剂与药品. 18 3.2.2 主要仪器. 19 3.3 Cs 衍生化改性及 PCCs的合成. 19 3.3.1 Cs 的纯化. 19 3.3.2 Cs 的预处理与选择性保护 20 3.3.3 PCCs 的合成21 3.4 测试与表征22 3.4.1 核磁共振波谱22 V 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 3.4.2 红外光谱. 22 3.4.3 凝胶渗透色谱22 3.4.4 X射线衍射. 22 3.4.5 热重分析. 22 3.4.6 差示扫描量热分析 22 3.4.7 水溶性分析 23 3.5 结果与讨论23 3.5.1 核磁共振分析 23 3.5.2 红外光谱分析26 3.5.3 凝胶渗透色谱 27 3.5.4 X射线衍射分析 28 3.5.5 热重分析. 29 3.5.6 差示扫描量热分析. 30 3.5.7 水溶性分析. 31 3.6 小结32 第四章 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的生物学评价. 33 4.1 引言33 4.2 实验试剂与仪器 33 4.2.1 主要试剂与药品. 33 4.2.2 主要仪器. 34 4.3 细胞毒性实验. 34 4.4 血液相容性评价. 35 4.4.1 血液采集. 35 4.4.2 凝血时间测定35 4.4.3 血小板黏附行为研究 35 4.5 与蛋白质相互作用研究 36 4.6 结果与讨论36 4.6.1 细胞毒性. 36 4.6.2 血液相容性研究. 38 4.6.2.1 凝血时间38 4.6.2.2 血小板黏附行为 39 4.6.3 与蛋白相互作用研究 41 4.7 小结43 第五章 磷酸胆碱化壳聚糖纳米粒子的制备及其理化性质 45 5.1 引言45 5.2 实验试剂与仪器 45 5.2.1 主要试剂与药品. 45 5.2.2 主要仪器. 45 5.3 PCCs 纳米粒子的制备 46 5.3.1 离子交联法制备纳米粒子. 46 5.3.2 亲/疏水作用制备纳米粒子46 5.4 测试与表征46 5.4.1 纳米粒子的 TEM 观察 46 5.4.2 纳米粒子的 AFM 观察 46 5.4.3 纳米粒子的粒径分析 47 VI 暨南大学硕士学位论文 5.4.4 壳聚糖衍生物 PCCs荧光光谱及临界胶束浓度的测定 47 5.5 结果与讨论47 5.5.1 离子交联法制备纳米粒子. 47 5.5.1.1 TEM结果分析 47 5.5.1.2 AFM结果分析 48 5.5.1.3 DLS结果分析. 49 5.5.2 壳聚糖衍生物 PCCs的荧光光谱分析. 50 5.5.3 壳聚糖衍生物 PCCs临界胶束浓度 CMC 测定 51 5.5.4 亲/疏水作用制备纳米粒子 52 5.5.4.1 TEM结果分析 52 5.5.4.2 AFM结果分析 53 5.5.2.3 DLS结果分析. 55 5.6 小结55 结 论. 57 参考文献 58 致 谢 66 ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 附 录 67 ………………………………………………………………………………………………………………………………………… VII 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 1.1 壳聚糖简介 甲壳素Chitin是自然界中的唯一一种带阳离子的碱性氨基多糖,其化学名为 2-乙酰 胺基-2-脱氧-D-葡萄糖,广泛存在于自然界的昆虫类、甲壳类和软体类动物的骨骼及某些 藻类的细胞膜和某些菌类的细胞壁中。其生物年产量仅次于纤维素,是地球上的第二大可 再生资源,也是地球上除蛋白质外蕴藏量昀丰富的含氮天然有机化合物。 壳聚糖Chitosan 又名甲壳胺或脱乙酰甲壳素,为白色无定形、半透明、略有珍珠光泽的固体,是甲壳素的 [1,2] 脱乙酰基产物,其基本结构单元是氨基葡萄糖 。 图 1-1 甲壳素和壳聚糖的结构式 Fig.1-1 Chemical structures of chitin and chitosan 1.2 壳聚糖的应用 作为天然高分子材料,壳聚糖具有稳定的物理化学性质,良好的生物相容性、生物可 降解性和低毒性等特点,并且具有多种生物活性。另外,壳聚糖的分子链上含有游离且具 有反应活性的氨基和羟基,可进一步进行化学改性,引入多种功能基团或偶联上一些具有 特殊性能的分子,从而改善其溶解性、生化性质等,或赋予其多种新的功能。因此,壳聚 糖及其衍生物被广泛应用于医药、农业、食品、造纸、印染和日化等领域,并成为 21世 [3] 纪重点开发的生物新材料 。 1.2.1 在医药中的应用 在医学领域,壳聚糖作为生物相容性很好的可降解材料,可制成人工皮肤、人造血管 和手术缝合线等医疗产品;在药学领域,它具有促进伤口愈合、抗癌、治疗心血管疾病等 1 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 功效。在保健方面,其更被欧美学术界誉为继蛋白质、脂肪、糖类、维生素、无机盐之后 的第六生命要素,对人体具有强化免疫机能、延缓衰老、预防疾病和调节人体生理功能等 [4] 多重作用 。 由壳聚糖纤维制成的手术缝合线,在预定时间内有很高的抗张强度,在血清、胰液、 胆汁、尿中能保持良好的使用强度。另外,其缝合和打结操作性好,而且在体内能被溶菌 酶所酶解,从而被人体自行吸收,因此,当伤口愈合后,不必再拆线,减少病人的痛苦以 [5] 及治疗费用 。 人工皮肤所使用的生物材料除了胶原外就是壳聚糖或甲壳素,壳聚糖人工皮肤柔软、 舒适,既透气,又吸水,具有抑菌消炎、抑制疼痛和止血等功效。而且随着创伤地愈合以 及新生皮肤地生长,能够逐渐降解而被机体所吸收,避免了揭除时因流血多而导致病人痛 [6] 苦 。 壳聚糖分子链上连接上可水解或酶解的药物分子后可以形成一种新的药物控释缓释 体系:壳聚糖载体药物。通过选择和控制所偶联的化学键,药物剂量的合理调控能够得以 实现,从而保证药物以昀佳剂量持续释放或控制药物在体内病灶部位选择性释放,昀终使 [7] 药物的有效利用率提高,达到减少给药频率的目的 。 壳聚糖能够激活、介导机体系统,提高吞噬细胞的系统功能。巨噬细胞表面有细菌多 糖受体的存在,而壳聚糖的结构与细菌多糖相似,因此能够刺激巨噬细胞活化,促进其吞 噬功能,增强它在其它免疫应答中的协同效应,使机体对 T细胞、NK细胞和 B细胞的调 节功能得以实现,介导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答。因此,壳聚糖具有对机体的 [8] 免疫调节作用 。 1.2.2 在农业中的应用 在农业上,甲壳素处理过的植物种子具有较高的抗病虫害能力,农作物产量可以得到 大幅度地提高。壳聚糖可用作土壤改良剂、种衣剂以防止土、种传病害,还可以作为生长 [9] 调节剂、病害诱抗剂,促进植物生长、诱导提高植物的广谱抗病性 。 伴随着农业的快速发展,当今世界农业研究主要集中在增强植物的防病抗病能力,增 强植物自身健康生长机制,昀终实现生态的良性循环。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的氨基 多糖,具有较强的生物活性,能够促进植物对营养物质的吸收和利用,有效调节植物的生 长发育,促进植物开花结果,调整植物生长状态,从而提高农作物产量。用不同剂量的壳 聚糖对小麦、水稻、玉米、棉花、大麦、燕麦、大豆、甘薯、蔬菜等作物进行种子处理均 2 暨南大学硕士学位论文 [10,11] 有增产效果 。 缓释/控释肥料通过对现有肥料进行改性,使得肥料中的养分在施肥后能根据作物需 肥规律缓慢释放,被作物吸收和利用,达到一次性施肥就能够满足作物至少是一季生长的 需要,具有高效、速效、长效和毒性小、施放量小、污染小,以及减少农民在配方施肥、 [12] 追肥等农艺上的投入和困难,减轻劳动强度等优点 。目前,许多国家都 在积极开 发新型缓释肥料,研究改进制肥工艺。其中以壳聚糖和 KCl 为主要原料制备壳聚糖 + [13] 包膜 KCl 的微球,就可实现 K 的缓释 。 壳聚糖具有抗真菌活性,能够有效抑制多种细菌的生长。其抗菌机理包含两方面的内 容:1. 壳聚糖分子链上的氨基所形成的阳离子与微生物细胞壁成分磷脂等阴离子相互吸 引,从而刺激微生物的自由度,引起生育障碍;2. 壳聚糖的低分子化使得其能够进入微 [14] 生物细胞内部,阻止遗传因子 DNA地复制和 RNA地转录,昀终引起生育禁阻 。 1.2.3 在纺织印染工业中的应用 壳聚糖与纤维素分子结构的差别只是氨基和羟基,所以它们两者之间具有很强的结合 能力,并且能够吸附纺织物中的正电荷,从而使织物具有抗静电、易纺织、柔软、着色好 等一系列优良性能。纺织物用壳聚糖整理剂处理烘干后,表面可形成一层十分牢固且不溶 于水的保护膜,使织物具有耐碱、耐热、耐磨、防缩、防皱等性能。壳聚糖 用作有机固色 剂,可显著提高织物的染色牢固度。在传统的蜡染印花工艺中,利用它的黏合力,将其代 [15] 替蜡液涂在织物上,根据需要进行雕刻、上色、脱胶即可得到精美的印染图案 。 1.2.4 在废水处理中的应用 近年来,壳聚糖在废水处理领域中的应用取得了很大的进展,主要用作重金属离子螯 合剂和活性污泥絮凝剂,具有较强的絮凝作用,无毒,无二次污染,并且能够生物降解。 目前,国内外有关高分子絮凝剂絮凝机理方面的研究大多处于假说阶段,使人信服的实际 验证较少。壳聚糖以其天然、无毒、易降解和对人体健康无害等优点,在水处理领域中作 [16] 为合成有机絮凝剂的有效替代品占据了特殊地位 。 1.2.5 在造纸工业中的应用 化学助剂在造纸生产中起着举足轻重的作用。随着人们对纸张和纸制品需求量的不断 3 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 加大,以及对纸质量的提高,对化学助剂的需求也变得越来越迫切。作为 天然高分子 材料壳聚糖及其衍生物的结构与纤维素结构相近,与纤维素有良好的相容性,而且在酸性 条件下壳聚糖的溶解性与造纸中的抄纸酸性介质相似。因此,长期吸引造纸工作者的关注, 研究开发复合施胶剂、纸张增强剂、纸张表面改性剂等造纸助剂也成为当今的研究热点。 壳聚糖用于施胶剂,较松香施胶剂具有较高的干、湿强度,耐破度和撕裂度,有较好的书 [17] 写和印刷性能,并可在碱性介质中施胶 。 1.2.6 在食品工业中的应用 壳聚糖具有良好的成膜性。用壳聚糖制备的薄膜可以防止空气中的氧气渗入和瓜果呼 吸作用产生的二氧化碳逸出,但是其可以使乙烯气体自由逸出,因而壳聚糖薄膜能抑制果 蔬的呼吸作用,降低果蔬在储藏中营养成分的流失,保持瓜果蔬菜的原色原味。同时,其 还可以阻止微生物侵染,从而降低果蔬的腐烂率。另外,果汁中含有果胶、纤维素等多糖 类物质,存放时间久了果汁会变浑浊。壳聚糖是一种很好的澄清剂,可以用作果汁、酒类、 [18] 食醋、糖蜜的澄清剂,尤其是澄清果汁作用极好 。 1.3 壳聚糖的化学改性 1.3.1 酰化改性 壳聚糖能与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤主要是酰氯等发生酰化反应,在大分 子链上导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基,所合成的壳聚糖衍生物在溶剂中的溶解性 [19] 得到了很大的改善 。壳聚糖的糖残基上具有三种官能团:两种羟基C6-OH,一级羟基; C3-OH,二级羟基和氨基。从空间构象上来说,C6-OH 可以较为自由地旋转,同时位阻 也小,而 C3-OH既不能自由旋转,空间位阻也大些,所以一般情况下 C6-OH 的活性大于 C3-OH,而氨基的活性又比一级羟基的活性大些,即三种官能团的反应活性顺序是氨基 C6-OHC3-OH。酰化反应通常得不到单一的产物,既可发生 N-酰化又可发生 O-酰化, 酰化产物的形成与反应溶剂、酰化试剂的结构、催化剂的种类以及反应温度等因素有关 [20,21] 。 酰化壳聚糖及其衍生物中酰基的引入破坏了壳聚糖及其衍生物分子间及分子内的氢 [22] 键,改变了它们的晶态结构,改善所得产物在常用有机溶剂中的溶解性能。韩怀芬等 用乙酸酐和邻苯二甲酸酐对壳聚糖进行酰化改性以改善其溶解性能,并采用 X 射线衍射 4 暨南大学硕士学位论文 [23] 图谱分析其结晶结构。王周玉等 以醋酸和丙酮为反应介质,在均相条件下用马来酸酐 [24] 对壳聚糖进行酰化改性,得到了具有良好水溶性的 N-酰化壳聚糖衍生物。梁升等 在离 子液体水溶液中,合成了水溶性的 N-乙酰化壳聚糖,并研究了产物的吸湿保湿性能,结 [25] 果表明合成产物具有极好的吸湿保湿性能。Zong 等 研究了壳聚糖和癸酰氯、辛酰氯以 及庚酰氯的酯化反应,并采用红外、核磁等测试方法对衍生物的化学结构进行了表征,同 [26] 时还对其晶态结构和热行为进行了分析。Artphop 等 采用吡啶和三氯甲烷混合溶液为溶 剂,对壳聚糖和长链的酰氯的酰氯化反应进行了研究,合成了能溶解在三氯甲烷等几种有 机溶剂中的壳聚糖衍生物。 1.3.2 烷基化改性 烷基化反应既可以在壳聚糖的羟基上O-烷基化,醚化进行,也可以在壳聚糖的氨基 上N-烷基化进行。如果要使烷基化反应只发生在羟基上,可以采用长链醛类与壳聚糖的 氨基发生席夫碱反应,然后在羟基上引入其他基团,再用硼氢化钠还原得到相应的壳聚糖 衍生物。用该方法引入甲基、乙基、丙基和芳香化合物的衍生物,对各种金属离子有很好 的吸附螯合能力。引入烷基后,壳聚糖的分子间和分子内的氢键被显著削弱,因此烷基化 壳聚糖具有很好的水溶性,但若引入的碳链太长如十六烷基,则所合成的衍生物不完全 [27] [28] 溶于水 。白欣等 制备了巯基化壳聚糖纳米粒子,透射电子显微镜照片显示其呈现均 [29] 匀的球形结构,粒径在 390 nm左右,有望成为一种新型基因载体。李方等 用不同碳链 长度的卤代烷与壳聚糖反应合成了 N-烷基化壳聚糖,测试结果表明引入烷基后壳聚糖分 子间氢键受到削弱,结晶度下降。 1.3.3 酯化改性 用含氧无机酸作酯化剂如浓硫酸、氯磺酸、五氧化二磷等,可使壳聚糖中的羟基形 [30] 成有机酯类衍生物,常见的酯化反应有硫酸酯化和磷酸酯化 。 壳聚糖的硫酸酯化衍生物的结构与肝素类似,而且其具有较强的聚阴离子性质,因此 有很多报道研究其在抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤和抗病毒等方面的应用。常用的硫 酸酯化试剂主要包括浓硫酸、SO /Pyridine,SO /SO ,SO /DMF,HClO S/Pyridine 等, 3 3 2 3 3 在这些硫酸酯化试剂中又属氯磺酸昀 为常用。通常的方法包括:H SO -iso-PrOH 法, 2 4 HClO S/Pyridine 法,HClO S-DMF 法,HClO S-DMSO 法等。壳聚糖结构单元 上的 C 、 3 3 3 3 C 位 OH,2位 NH 三个位点都能发生磺化反应,因此如果要进行选择性磺化,则磺化反 6 2 5 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 [31] 2+ 应要选用合适的磺化条件,并采用相应的基团保护方法。例如,Baumann 等 采用 Cu 和邻苯二甲酸酐对 2 位氨基和三位羟基进行保护后再用硫酸酯化的方法制备了酯化位置 [32] 明确的壳聚糖衍生物。 Nishimura等 先对壳聚糖的 6位 OH和 2位 NH 进行选择性保护, 2 再用 SO /Pyridine 进行硫酸酯化,分别得到 2 位和 2、3 位硫酸酯化壳聚糖衍生物,并与 3 6 位硫酸酯化壳聚糖的抗凝血和抗 HIV 活性进行比较,结果发现硫酸酯化壳聚糖的活性 主要依赖于硫酸酯化位点,在 C ,N 位上选择性硫酸化比 C 位硫酸酯化具有更高的抗 3 6 HIV 活性,而在抗凝血方面则相反:C 位硫酸化衍生物表现出抗凝血活性,C ,N 位上 6 3 选择性硫酸化则没有抗凝血活性。 壳聚糖也可以形成磷酸酯,这类磷酸酯具有良好的耐热性和水溶性,且吸附螯合重金 属离子的能力很强,尤其是富集海水中的铀,因此壳聚糖磷酸酯衍生物的研究也极为重要。 [33] [34] 壳聚糖磷酸化试剂主要包括磷酸/二甲基甲酰胺 和五氧化二磷/甲磺酸 两类。其主要的 制备方法是用五氧化二磷在甲磺酸中与壳聚糖反应,取代度取决于 P O 的用量。壳聚糖 2 5 磷酸酯在水中的溶解性在很大程度上取决于取代度。通常,壳聚糖磷酸酯的取代度低或适 中,则其易溶于水;而高取代度的壳聚糖磷酸酯不溶于水,这可能是由于氨基和磷酸盐之 间形成了分子内或分子间盐键,这种现象在两性聚电解质中通常会被观察到。通过改变 P O 的加入量和反应时间,可以得到不同取代度的壳聚糖磷酸酯。 2 5 1.3.4 醚化改性 壳聚糖分子的结构单元上有 C3-OH及 C6-OH,因此可与烃基化试剂反应生成醚,如 [35] 生成甲基醚、乙基醚、苄基醚以及羟丙基醚等。董炎明等 采用碱壳聚糖的方法合成了 [36] 一系列不同醚化度的液晶性壳聚糖衍生物羟乙基壳聚糖。郭立民等 通过醚化方法,合 成了壳聚糖衍生物,并分析出以异丙醇为反应介质对壳聚糖进行改性研究的昀佳条件。陈 [37] 建勇等 用羟甲基化和醚化等方法合成了羟甲基壳聚糖和羟乙基乙基醚壳聚糖。完莉莉 [38] , 等 利用 C6-OH的亲核性使壳聚糖与 4,4 -二溴二苯并-18-冠-6-冠醚反应合成冠醚交联 壳聚糖,此类冠醚交联壳聚糖在环境保护方面有着重要的应用价值,可用于重金属或贵金 属离子的富集分离和废水处理。壳聚糖经醚化后制得的衍生物具有良好的水溶性、吸湿性 [39] 和保湿性,在医药、日用化学品、造纸工业、烟草工业等方面有着十分广阔的应用空间 。 1.3.5 季铵化改性 壳聚糖分子结构中含有游离的氨基和羟基,可进行季铵盐化反应,将位阻大、水合能 6 暨南大学硕士学位论文 力强的季铵盐基团引入壳聚糖分子中。季铵基团的引入显著削弱了壳聚糖分子内及分子间 氢键,明显增大了壳聚糖衍生物的水溶性。此外,季铵盐化改性还可不同程度地改善其物 [40] 理化学性质,从而使得到的壳聚糖衍生物成为理想的先进材料。许晨等 用异相法合成 了水溶性壳聚糖季铵盐衍生物,研究结果表明所合成的壳聚糖季铵盐衍生物可直接溶解于 [41] 水中,而且其水溶液可以任意比例与乙醇、丙二醇、甘油等混溶。Lim 等 将季铵盐基 团引入到壳聚糖的氨基上,合成了水溶性的季铵盐化壳聚糖:N-2-羟基-3-三甲基氯化 [42] 铵丙基壳聚糖。Holappa 等 将季铵盐化的哌嗪接枝到壳聚糖的骨架上,实现了壳聚糖 [43] 衍生物的水溶性。Xie 等 在碱性条件下将盐酸化氯乙基胺与壳聚糖之间进行烷基化反 [44] 应,从而合成了水溶性的乙胺羟乙基壳聚糖。Sahni 等 合成了新型的部分季铵化壳聚糖 衍生物氯化 N-三甲基壳聚糖TMC,它在中性 pH和水环境中具有良好的溶解性。 1.3.6 接枝改性 在甲壳素或壳聚糖的葡胺糖单元上接枝乙烯基单体或其它单体,合成半聚合物多糖, [45-47] 可将合成聚合物的优异性能赋予甲壳素或壳聚糖 。 [48] 壳聚糖接枝共聚反应所采用的方法主要有化学法和辐射接枝两种方法 。如用铈离 子、过硫酸钾、过氧化氢、亚铁离子等氧化-还原引发剂,偶氮二异丁腈引发剂,或通过 60 γ-射线、 Co 射线、电子束辐照、低压汞灯产生的紫外线来引发乙烯基单 体在多糖主链 上进行自由基接枝共聚;还可通过可溶性甲壳素衍生物,如碘代甲壳素、甲苯磺酰化甲壳 素来进行离子引发接枝。 氧化-还原引发剂中,对接枝反应昀为有效地为铈离子,反应通常在非均相条件下进 行。在用铈离子作引发剂时,丙烯酸、丙烯酸酯、丙烯酸酰胺、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯 [49] 等单体可以被接枝到甲壳素或壳聚糖的葡胺糖单元结构上。吴根等 以硫酸铈铵为引发 剂,在硫酸存在的条件下,采用丙烯酰胺修饰壳聚糖从而制备出 AAM-CHT 乳液。胡宗 [50] [51] 智等 以硝酸铈铵为引发剂引发壳聚糖与甲基丙烯酸接枝共聚。Yazdani-pedram 等 报 道,以过硫酸钾为引发剂,可将丙烯酸或丙烯酰胺接枝到壳聚糖上,丙烯酸和丙烯酰胺的 [52] 60 昀高接枝率分别可达 1800%和 400%。 Singh等 报道用 Co射线引发甲基丙烯酸羟乙酯 [53] 接枝到壳聚糖膜上。Hu 等 通过多步反应将水溶性的聚乙二醇PEG接枝到壳聚糖分子 链上,得到的壳聚糖衍生物的溶解性得到了很大的改善。这种壳聚糖衍生物低取代度时可 溶于水中,当取代度大于 24%时,则可以溶解于 DMF、DMSO等有机溶剂中。 7 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 1.3.7 交联改性 甲壳素和壳聚糖能够和具有双官能团的醛或酸酐等进行交联反应,得到网状结构的不 溶产物。常用的交联剂为醛类物质,包括戊二醛、乙二醛等,既可在水溶液中进行交联, 也可在非均相介质中进行,而且可在较宽的 pH值范围内发生。反应主要是在分子间发生, 当然也有部分反应在分子内发生;反应的主要方式是醛基与壳聚糖的氨基生成席夫碱结 构,其次才是醛基与羟基反应。交联反应还可采用环氧丙烷系交联剂,包括环氧氯丙烷、 [54] 环硫氯丙烷等,可在交联的同时引入活性基团 。 [55] Gupta 等 用不同分子量和脱乙酰度的壳聚糖分别与戊二醛和乙二醛交联,制备了壳 聚糖交联微球。与戊二醛交联微球相比,乙二醛交联微球的结构更加紧凑、憎水性更强, [56] 对苯并吡喃的持续释放效果更好。Ni 等 曾报道用环硫氯丙烷作交联剂所制得的交联壳 聚糖可作为螯合树脂用于贵金属离子的富集分离。 1.4 磷酸胆碱 磷酸胆碱Phosphorylcholine,PC是广泛存在于动物和植物细胞膜的结构单元磷脂的 亲水极性头部分,其结构如图 1-2所示。从结构来看,磷酸胆碱由带一个负电荷的磷酸基 及带一个正电荷的胆碱季胺基构成,它是一种两性基团,在生理条件下通常呈电中性,且 该电中性的极性头主要是位于磷脂双分子层的外层。研究表明磷酸胆碱不仅对保持正常细 [57] 胞的形状、大小和生理功能具有重要的作用 ,而且还具有免疫调节功能,可以调节原 [58] 核和真核病原体中寄主-病原体的相互作用 。另外,磷酸胆碱还具有显著的蛋白排斥 特性,可以极大程度地降低蛋白质在其上的吸附,从而减少免疫系统的活化 和血小板的沉 [59,60] 积 。 8 暨南大学硕士学位论文a b 图 1-2 细胞膜结构示意图 a 细胞膜的双层结构;b 磷脂分子结构 Fig.1-2 Schematic structures of cell membrane a double-layer structure of cell membrane; b phospholipid 1.5 磷酸胆碱仿生改性高分子研究进展 由于磷酸胆碱在生物膜中的重要作用,近年来设计制备含磷酸胆碱高分子的研究十分 活跃。在高分子骨架上偶联磷酸胆碱功能基团后的仿生高分子,一般具有优异的血液相容 性和良好的水溶性。这些特殊的性质,使含 PC基团的仿生高分子的性能和合成方法愈来 [61] 愈引起研究人员的关注 。 [62] Nakaya 等 在 1982年首先成功合成了第一种磷酸胆碱类单体,即 2-甲基丙烯酸氧乙 [63] 基磷酸胆碱酯MPC,并在 1999年基于 MPC合成了一种抗凝血材料。Hsiue 等 通过接 枝聚合反应将磷酸胆碱类化合物连接到有机硅橡胶上,实验结果表明高浓度 MPC的引入 显著改善了硅橡胶的血液相容性,达到有效抑制血小板黏附与活化,减少对血浆蛋白吸附 [64] 的目的。Ishihara 等 用 MPC 与甲基丙烯酸酯类单体如 BMA共聚,得到与细胞膜结构 极为相似的共聚物。血液相容性实验表明,与 BMA均聚物相比,此类共聚物的抗凝血性 能有了很大程度的改进,而且其吸附血浆蛋白量及引起的血小板黏附量皆随着 MPC的含 [65] 量增高而减少。Iwasaki 等 合成了一种新的膜材料,该膜具有 MPC 和 SPU 的半共穿网 [66] 络IPN结构,研究表明这种膜具有好的血液相容性和力学性能。Iwasaki 等 合成了一系 列不同 PC 含量的水溶性 MPC/碳酸酯共聚物 CPC,并研究其在水溶液中的表面张力随浓 度的变化行为。 由上述可知,含磷酸胆碱的仿生高分子表现出了良好血液相容性和减少蛋白 质吸附等 9 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 优异性能。而壳聚糖自身也是源自天然高分子,并具有许多优良的生物医学活性,但其在 中性水溶液中的不溶性限制了它的应用范围。因此,制备含磷酸胆碱基团的壳聚糖衍生物 展现出了诱人的前景,近年来相关的研究也越来越多。 [67-69] Zhu 等 在均相反应体系中采用迈克尔加成反应将 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱 MPC键合到壳聚糖的氨基上,同时她也研究了将 2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷COP 键合到苯甲酰化壳聚糖的氨基上,从而合成了偶联磷酸胆碱基团的壳聚糖衍生物以及偶联 磷酸胆碱基团的苯甲酰化壳聚糖衍生物。血液相容性实验表明,接枝有磷酸胆碱基团的壳 聚糖衍生物的凝血时间明显延长,血小板黏附量显著减少。 [70] Tiera 等 采用壳聚糖胺还原磷酸胆碱甘油醛的方法,成功合成了磷酸胆碱取代壳聚 1 糖PC-CH,并用 H NMR 和 FTIR 波谱,浊度法,以及电位滴定法表征出其在生 理 pH 条件下具有良好溶解性能;而且细胞毒性实验确定出 PC-CH 无毒性。有望普遍用于药物 载体和基因治疗的研究中。 [71] Meng 等 采用一种较简单的异相合成法在壳聚糖表面成功接枝了 PC 基团,并且在 每个氨基上接枝了两分子的 PC基团,并将改性壳聚糖与原材料壳聚糖进行了比较,结果 表明改性壳聚糖具有更好的抗凝血性能和生物相容性,能运用于血管等方面,是一种十分 有用的生物材料。 [72] Huangfu 等 在无水条件下将三氯氧磷和氯化胆碱进行反应,从而合成二氯磷酰胆 碱。而后以三氯甲烷为溶剂,通过异相反应,将磷酸胆碱基团接枝到戊二醛交联的壳聚糖 薄膜上。实验结果表明,表面接枝有磷酸胆碱基团的壳聚糖薄膜可以有效抑制牛血清白蛋 白和纤维蛋白原在其上的吸附。血小板黏附实验结果表明磷酸胆碱基团可以有效抑制血小 板的黏附和活化,明显改善交联壳聚糖薄膜的血液相容性。 1.6 课题的提出 1.6.1 目的及意义 如前所述,作为自然界中存在的唯一带正电荷的天然活性多糖,壳聚糖一直是人们研 究的热点。壳聚糖具有优异的生物相容性和生物可降解性,而且无毒、无免疫原性。除此 之外,壳聚糖及其衍生物还具有抗菌性、抗微生物性、抗病毒性、抗癌性,对重金属离子 的螯合性以及促进伤口愈合等一系列独特的性质,这些性质使其广泛应用于伤口愈合、污 水处理、重金属回收、膜分离、化妆品、抗凝血药物、日用化工等领域。然而,壳聚糖的 10 暨南大学硕士学位论文 溶解性能不佳,只能溶于少数的有机酸和无机酸溶液,不溶于中性和碱性水溶液,以及常 用的有机溶剂,如醇类甲醇、乙醇等、卤代烷二氯甲烷、三氯甲烷等、酰胺类N,N- 二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、吡啶等。这种有限的溶解性在很大程度 上限制了它的应用范围。因此,对壳聚糖进行改性是近年来非常活跃的研究课题之一。 磷酸胆碱是广泛存在于细胞膜的结构单元磷脂的亲水极性头部分,由带一个 负电荷的 磷酸基及带一个正电荷的胆碱季胺基构成,对维持正常细胞的形状、大小和生理功能具有 重要的作用。众多研究表明:高分子仿生改性引入磷酸胆碱基团,不仅可以大大提高水溶 性,而且还可抑制其对蛋白质的吸附,从而避免一些不良生物反应的发生,有效改善高分 子材料的生物相容性。为此,我们从仿生的角度出发,选择将磷酸胆碱这一亲水性的两性 基团偶联到壳聚糖的骨架上,合成新型的水溶性仿生壳聚糖衍生物,一方面希望可以改善 壳聚糖的水溶性,另一方面希望磷酸胆碱仿生基团的引入可以进一步改进壳聚糖的生物学 性能。 1.6.2本课题的研究内容 依据研究目的及意义,本论文将具体开展如下图的工作: 1. 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成:基于磷化学的均相反应,利用 Antherton-Todd 反应合成出磷酸胆碱化壳聚糖衍生物,通过调节反应物的摩尔配比,可实现对磷酸胆碱化 壳聚糖衍生物取代度的控制。 2. 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的表征及其理化性能研究:通过核磁共振波谱、 红外光 谱、凝胶渗透色谱以及 X 射线衍射分别表征壳聚糖衍生物分子的化学结构和物理结构; 11 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成、表征及生物学评价 同时,采用差示扫描量热和热失重分析样品的热行为,采用紫外可见分光光谱研究壳聚糖 衍生物在不同 pH水溶液中的溶解性。 3. 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的生物学评价:从细胞毒性、血液相容性以及与蛋白质 的相互作用三个方面对壳聚糖衍生物的生物学性能进行初步研究和评价。 4. 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物纳米粒子的制备及表征:采用静电自组装和亲疏水自组 装两种方法制备壳聚糖衍生物的纳米粒子,利用透射电子显微镜、原子力显微镜观察所制 备纳米粒子的形貌,其粒径和 Zeta 电位则利用马尔文粒度仪进行测试,并考察取代度对 纳米粒子物理化学性质的影响。 1.6.3 本课题的创新之处 1. 本课题从仿生的角度出发,基于磷化学的均相反应成功合成出一系列不同取代度 的具有良好水溶性和生物相容性的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物。 2. 本课题对合成的磷酸胆碱化壳聚糖衍生物与蛋白质之间的相互作用进行 了系统的 研究,并采用自组装的方法成功制备出磷酸胆碱化壳聚糖衍生物纳米粒子,此纳米粒子有 望应用于药物/基因传输系统等领域。 12 暨南大学硕士学位论文 第二章 磷酸胆碱化壳聚糖衍生物的合成方法研究 2.1 引言 近年来壳聚糖的化学改性研究一直很活跃,但是对壳聚糖进行磷化学改性的研究报道 并不多见。基于壳聚糖磷酸酯的消炎作用,以及与金属离子的螯合作用,研究人员对磷化 [73] 学改性壳聚糖做了一些研究。 Ramos 等 合成了一种新型的水溶性 N-甲基磷酸化壳聚糖, [74] 结果表明其具有良好的螯合金属离子的能力。Win 等 基于壳聚糖磷酸酯研制出一种智 [75] 能药物释放载体,可实现药物对 pH值敏感的释放行为。Miyatake 等 研究了甲壳素磷酸 [76] 酯及其衍生物的消炎作用。Wang 等 则报道了采用水溶性的壳聚糖磷酸酯作 助剂,改善 了磷酸钙骨支架的力学性能。 考虑到磷元素在生命过程中的重要作用,结合壳聚糖本身的结构和性能,我们设计合 成以磷酰键方式偶联功能分子或基团的壳聚糖含磷衍生物,研究其合成方法、结构、性能 以及其在生物医药方面的应用价值。一方面壳聚糖磷酰化后自身的活性往往有所改进;另 一方面,磷酰化修饰的壳聚糖衍生物可以赋予壳聚糖新的生物功能,并且磷酰键的偶联方 式也是生物可降解的。 2.2 合成路线设计 由于磷化学改性通常要在无水的有机介质中才能进行,然而壳聚糖的溶解性能不佳, 只能溶于酸溶液中,不溶于中性和碱性水溶液以及常用的有机溶剂。因此,要使壳聚糖的 磷酰化反应在均相条件下顺利进行,必须寻找出新的能够溶解壳聚糖的有机溶剂或者对壳 聚糖进行衍生化改性,以改善其在有机溶剂中的溶解性能。当然,如果仅是对壳聚糖材料 的表面进行磷酰化反应,也可直接进行异相反应。 A 采用新型高极性六氟异丙醇作反应介质,基于 Antherton-Todd反应实现 壳聚糖的 直接磷酰化。 由于壳聚糖分子间存在强烈的氢键相互作用,所以它不溶于水,也不溶于常用的有机 [