盆腔器官脱垂患者主韧带和阴道前壁弹性蛋白、elafin的表达及意义（可编辑）

盆腔器官脱垂患者主韧带和阴道前壁弹性蛋白、elafin的达及意义（可编辑） 盆腔器官脱垂患者主韧带和阴道前壁弹性蛋白、elafin 的表达及意义 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责 任。 卅眇??Z 日期: 论文作者签名:(盏翻 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容 保密内容除外 ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名:盏幽 指导教师签名::堡至兰邕 日 期:2[竺:! 目 录 一、摘要 中文论著摘 要…………………………………………………………………((1 英文论著摘 要…………………………………………………………………3 二、英文缩略 语…………………………………………………………………((6 三、论文 ―U(―jL一 刖 舌……………………………………………………………………………………………………7 材料与方 法……………………………………………………………………7 实验结 果………………………………………………………………………lO 讨 论……………………………………………………………………………………………………15 结 论………………………………………………………………………………………………………l8 四、本研究创新性的自我评 价……………………………………………………((19 五、参考文 献………………………………………………………………………20 六、附录 综 述………………………………………………………………………………………………………21 致 谢………………………………………………………………………………………………………29 个人简 介…………………………………………………………………………30 著摘要?? 盆腔器官脱垂患者主韧带和阴道前壁弹性蛋 白、elafin的表达及意义 目 的 检测女性盆腔器官膨出 pelvicorganprolapse，pop 患者子宫主韧带和阴 表达变化与POP发生发展的关系。 材料与方法 一、材料 5l例子宫脱垂患者的主韧带、膨出阴道前壁全层组织及20例非脱垂患者的 主韧带及阴道前壁全层组织来自2007年10月到2009年10月间中国医科大学附 属盛京医院妇科手术切除的组织。所有组织均经福尔马林固定，常规石蜡包埋。 二、主要试剂 elafm鼠抗人单克隆抗体及弹性蛋白兔抗人多克隆抗体购自美国Santa公司， 二氨基联苯胺 DAB 显色剂及S-P试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。 一(‘,--一 二、万冶 免疫组织化学染色 按链霉素抗生物素蛋白(过氧化物酶 S(P 法行免疫组织化学染色。切片常 规脱蜡至水，高温高压进行抗原修复，一抗4"C孵育过夜，DAB显色，苏木素复 染。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:细胞外基质内见棕黄色颗粒为阳 性表达。光镜下在每张切片中随机选取10个高倍视野，:0，无阳性区域; 1，阳性区域面积1(20,;2，阳性区域面积20(50,;3，阳性区域面积 50,。0(1: 为弹性蛋白或elafin阴性表达;2―3:弹性蛋白或elafm阳性表达。 四、统计学 为有统计学意义。 结 果 一、elafin蛋白阳性表达于细胞外基质，在POP组患者阴道前壁及子宫主韧带 组织elafin阳性表达水平分别为67,、63,。而在对照组阳性表达水平分别为30,、 20,。二者有显著性差异 卢O(005、0(001 。统计学分析表明，伴有压力性尿失 VS 禁者 产0(003、0(001 和脱垂程度较重者 11HI、IV，P 0(028、0(014 子宫 主韧带及阴道前壁组织中elafmg日性表达率明显增高。而 elafin蛋白表达与患者绝经 状态 尸 0(212、O(353 及阴道分娩次数俨1(000、O(164 无关。 二、弹性蛋白亦表达于细胞外基质，弹性蛋白在POP组阴道壁、主韧带表达水 VS 三、POP组患者阴道前壁dafin与弹性蛋白共表达阳性者为12例，elafin与弹性蛋 0(689 ，在子宫主韧带组织亦无统计学意义 P-O(105 。 结论 一、POP患者盆底结缔组织中弹性蛋白的表达与POP的发生、发展有关。 二、elafin表达可能是导致POP发生的原因之一。 关键词 盆底功能障碍性疾病;盆腔器官脱垂;压力性尿失禁;弹性 蛋白;弹性蛋白酶 抑制物: 2 ofelastinandelafinin and Significance amentandAnteriorWallTissue Vaginal ofPelvic OrganProlapse ective obj To theelastinandelafin incardinal ofwomenwith investigate expression ligament Pelvie astodeterminethealterationthatcontributestoPOE organProlaPse POP SO Materialsandmethods and 1、Tissue samplesgroups anterior POPandseventeenNON??-POPcardinal and Fifty--one ligamentparies underwent at tissue wereobtainedfrom resection vaginasespecimens patients surgical 2007October(and2009 ofChinaMedical between ShengjingHospital University were andembeddedin October(Allthe fixedformalin samples by paraffin( 2、Reagents elafinmouseanti??-humanmonoclonalandelastinrabbitanti??-human antibody antibodieswere fromSanta polyclonal purchased Shan SPkitwere from DAB chromogenicagent purchasedBeijingZhong Co，Ltd( Biotechnology 3、Methods Was the Immunohistochemical stainingperformedby method(Thesectionswere deparaffinized， waterprocessed，treatedbyhi曲 to andincubatedwith at4(0。C antibody overnight( tempretureexposeantigen primary Thecolorwas withdiaminobenzidineandthesectionwerecouterstained developed 3 with the control，the harmatoxylin(Fornonspecific antibodieswere reagent primary PBS(Resultsfound:extracellularmatrixinsee replaced by of positiveexpression slicesineachof10 brown―yellow selected granules(Lightmicroscope randomlyhigh criteria:0，no areaof powerfield，scoring positiveregion;a positiveregional 1-20,;2， the has area sizeof thearea” 50,(O(1:In positive 20-50,;3，the orderto positive elastinor elafin or elafin negativeexpression;2―3:elastin expression( 4、Statistical analysis SPSS13(0 statistical or Application elafin analysissoftware，elastin protein and featuresofthe expression betweenPOP clinicopathological relationship using betweenelastinandelafin chi。squaretest，the relationship protein expressionusing correlation as Spearman analysis;P O(05 statisticallysignificant( Results 1、elafin intheextracellular thePOP of proteinexpression matrix，in grouppatients withanterior and uterine elafin themainlevelof vaginal ligamentsorganization， were67,、63,(Inthe control levelswere30,、 positiveexpression group，expression 20,(Therewasa differencebetweenthe significant showed thatthoseassociatedwithstress analysis urinary 1 andthe heavier VS degree main ofprolapseperson II III，IV，P -O(028、 0(014 ，the and uterinetissueelafin ratewas ligamentsvaginal positive expression significantly elafin and 12、0(3 higher(Theproteinexpression patientmenopausalstatus P O(253 andthenumberof todo( vaginal 64 has deliveries e -i(000、O(1 nothing 2、elastinisalso inthe extracellular inthePOP expressed matrix，elastin of group the main in levelswere vaginalwall，the lowerthan ligamentexpression significantly thecontrol levelsin with is group e -o(004、0(001 ，itsexpression patientsPOP(Q relatedto 1 the is closely III，IV，P 0(005、0(0 indexing INs 2 ，while patient stress number accompaniedby urinary incontinence卢0(489、O(123 ， theofvaginal in with deliveries e -o(301、O(149 andpatients menopausalstatus俨 0(841、0(696 has todo( nothing 3、POP of with anterior elafinandelastinfor grouppatients atotalof12 vaginal 4 d Words Key floor pelvic incontinence dysfunction;pelvicorganprolapse; stressurinary elastimelafin 5 ??英文缩略语?? 6 ??论文?? 盆腔器官脱垂患者主韧带和阴道前壁弹性蛋白、 elafin的表达及意义 刖 罱 floor 女性盆底功能障碍性疾病 pelvicdysfunction，PFD 是由于各种病因导 致的盆底支持组织薄弱，进而俞腔脏器移位，连锁引发其它盆腔器官的位置和功 能异常的一类疾病。其主要包括盆腔器官脱垂 pelvicorganprolapse，POP 及压 力性尿失禁 stress urinary 逐年提高，严重影响中老年妇女的生活质量。盆腔器官脱垂 POP 的发生是一个多 因素，多阶段的复杂过程，发病机制尚不清楚。目前研究认为，POP的发生与盆 底支持组织结构功能完整性的破坏密切相关【l】。弹性蛋白 elastin 作为盆底支持组 织细胞外基质的重要功能成分，其功能受影响将导致支持组织失去弹性，盆底松 弛，盆底功能障碍性疾病相继发生。elafin又称弹性蛋白酶特异性抑制物，能使细 胞外基质和上皮细胞免受弹性蛋白酶的破坏溶解，它可在骨盆成纤维细胞中表达。 可能与盆底组织弹性纤维的重塑有内在联系，构成女性POP的发病基础。本实验 通过测定人类子宫脱垂患者主韧带、阴道前壁中弹性蛋白、elafin的表达情况，以探 讨二者与POP的关系。 材料与方法 一、研究对象和分组 子宫脱垂组织标本:51例组织标本均来自中国医科大学附属盛京医院妇产科 2007年10月至2009年10月诊断为子宫脱垂并行子宫全切术和 或 全盆底悬吊术 患者的主韧带及膨出阴道前壁全层组织。标本采集均经盛京医院伦理委员会批准 及获得患者本人或家属的知情同意，并签署知情同意书。术中切取患者主韧带 有患者均已婚，有经阴道分娩史，所有入选者无肺气肿，烟雾病等弹性纤维异常 7 疾病，手术前3个月未用任何雌激素药物治疗，术后病理回报无任何雌激素相关性 疾病 如子宫肌瘤，子宫内膜异位症，功能性卵巢肿瘤等 。诊断标准依据1996 年龄为4肚76岁，其中绝经前10例，绝经后41例;合并压力性尿失禁30例。另取 非脱垂组20例 同期相应年龄因宫颈鳞癌m期手术治疗患者的主韧带及阴道前壁 组织石蜡标本 做对照，POP组与对照组在年龄、产次、体重指数等方面差异无 统计学意义 尸 O(05 ，具有可比性 表1 。 二、主要试剂 免疫组织化学染色所需的常规试剂:磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠，二 甲苯，酒精，过氧化氢，苏木素等。 主要试剂:elafin鼠抗人单克隆抗体及弹性蛋白兔抗人多克隆抗体购自美国 Santa公司，二氨基联苯胺 DAB 显色剂及S(P试剂盒购自北京中杉生物技术有 限公司。 仪器:切片机、洁净工作台、恒温水浴箱、石蜡切片用冷台、 摊片机、烘片 机、显微镜等。 三、实验方法 一 免疫组化方法 1(组织切片在室温常规脱蜡至水 15rain。 1 二甲苯I 2 二甲苯II15rain。 3 无水酒精5min。 4 95oA、85,、75,酒精一带而过。 5 自来水冲洗2min。 6 蒸馏水冲洗2min。 5min。 2(3,过氧化氢浸泡室温1 3(PBS室温冲洗三次每次3min。 4(抗原修复 高温高压法 1 在高压锅中加入适量自来水，以不没过盛抗原修复 液的容器为标准， 烧开。 2 将抗原修复液倒入所需容器内，放入自来水中，再 烧开。 3 将切片置入抗原修复液中。 4 盖上锅盖待保护阀关闭盖上加压阀。 5 上气后1(5(2min迅速移不火源。 6 自来水迅速冲洗锅盖降压。 7 拔掉加压阀，打开锅盖，连同切片一起把盛满抗原 修复液的容器放入 盛满冷自来水的容器中降温，自来水不可溢入抗原修复液中。 8 待柠檬酸缓冲液的温度相当于室温即可。 5(蒸馏水冲洗室温3min。 6(PBS冲洗室温3min。 7(加血清室温20min。 8(加一抗4。C冰箱过夜。 elafin鼠抗人单克隆抗体1:100稀释 9(PBS室温冲洗三次每次5min。 10(加二抗37?恒温箱30min。 11(PBS室温冲洗三次每次5min。 12(加S-P符合物37?恒温箱30min。 min。 13(PBS冲洗三次每次5 min。 14(DAB显色室温3(10 15(苏木素复染细胞核5min。 1 min。 6(自来水冲洗室温2 17(1,盐酸酒精分化3秒。 min。 18(自来水返蓝30 19(室温常规脱水、透明、封片。 9 1 75,、85,、95,酒精一带而过 2 5’ 100,酒精I 3 5’ loo,酒精II 4 二甲苯I5’ 5 5’ 二甲苯II 20(中性树胶封片。 二 免疫组化染色结果判定 结果判定采用免疫组化半定量法【21，每张切片随机选取5个高倍视野 x400 计数着色强度和染色面积评分 3人单独计数 ，染色程度:不着色记为0分，浅 黄色、略高于背景者记为1分，棕黄色、明显高于背景者记为2分，强染、棕褐 色记为3分。染色面积的百分数:无染色面积为0分，QO,为1分，20,---40,为 2分，染色面积介于40,,-,65,为3分，染色面积之65,为4分。将两评分相乘所得 的总分数作为加权染色强度，呲分为阴性 ( :2~4分为弱阳性 + ;4~6分为 阳性 抖 ;6~12分为强阳性 卅 。 以上染色深度均以多数间质的呈色反应判定，为减少主观片面性，每例分别 由3位病理科医师各自阅片，然后核对所得结果，获得共识。 四、统计学处理 为有统计学意义。 结 果 一、elafin的表达 elafm蛋白阳性表达于细胞外基质，在POP组患者阴道前壁及子宫主韧带组织 elafin阳性表达水平分别为67,、63,。而在对照组阳性表达水平分别为30,、20,。 二者有显著性差异 辟0(005、0(001 。统计学分析表明，伴有压力性尿失禁者 VS 尸 O(003、0(001 和脱垂程度较重者 IIIII、IV，P O(028、0(014 子宫主韧 带及阴道前壁组织中elafin阳性表达率明显增高。而elafm蛋白表达与患者绝经状态 lO e-:--o(212、0(353 及阴道分娩次数 e -i(000、0(164 无关。 表2 二、弹性蛋白的表达 弹性蛋白阳性表达于细胞外基质，弹性纤维在POP组呈碎片状无规则排列， 而在对照组呈规则连续分布 图5、6、7、8 。统计学分析显示:弹性蛋白在POP 组阴道壁、主韧带表达水平明显低于对照组 P -O(004、O(001 ，其表达水平与患 VS III、IV，P -O(005、0(012 ，而与患者是否伴有压力 者POP(Q分度密切相关 II P -O(841、0(696 无关。 表2 三、elafin$[1弹性蛋白表达的相关性 POP组患者阴道前壁elafm与弹性蛋白共表达阳性者为12例，elafin与弹性蛋白均 0(689 ，在子宫主韧带组织亦无统计学意义 尸 O(105 。 表3、表4 表1，脱垂组与对照组患者的临床比较表 组别 例数 年龄 岁 孕次 次 产次 次 体重指数 kg,m2 表2，脱垂组与对照组盆底组织中弹性蛋白、elafin的表达与临床参数的关系。 阴道壁 主韧带 倒 elatin 弹性蛋白 elafm 弹性蛋白 组别 数 ‘+, 叠P ‘+, f P 聋P ??啪 f p ―――――――――――――――――――――――――――――――――――_-?______?-?_-―_――_____―――_-__-_――?―――――_――?_-―__-?―-?-―_________-__――_―_―――_一 正常组 20 7(8520(005l 6 30 0(004 10502 0(001 200 5 75 8(202 4 20 17 85 140(00l POP组 51 34 67 l9 37 1 8 35 33 65 ? 22 48360(0281 8920 11 50 005 6(041 0(014 6279 3 53 7 9 44 1麓54 0(012 Ill+IV 29 23 79 6 22 23 79 6 22 是否绝经 否 10 1(5”0(212 0(841 5 50 4 40 0(04 0(353 0(696 5 50 0(864 3 30 0(153 是 4l 29 70 15 37 项07 1X37 阴道分娩 ~度数 《2 18 I 00011(000 1(069 2 67 5 20 0(301 1(933 O(164 2(081 0(149 9 50 4 22 2 33 2郑7 14 41 23 70 14 42 台并鲫I 是 30 9(1070(003 0(489 25 83 0(00l 2(375 0(123 9 30 0(479 25 83 13(211 8 27 否 21 邓习 蝌3 7 41 l 郇0 表3，子宫脱垂患者阴道前壁弹性蛋白、elafin表达的相关性 弹性蛋白 elafin 阳性 阴性 阳性 12 22 0(689 7 阴性 10 表4，子宫脱垂患者主韧带弹性蛋白、elafin表达的相关性 弹性蛋白 elafin 阳性 阴性 14 阳性 18 0(105 4 阴性 15 12 图1，elafm在POP组阴道壁中阳性表达SP×200 图2，elafm在对照组阴道前壁中阳性表达SPx200 图3，elafin在POP组主韧带中阳性表达SP×200 , 卜( 彳(( VJ -J_，,‘ 0,_ R?，(。 ( 、 , (、 ? ?? ， 、 ’ ? 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