合成SSB／La多肽与DNA共同免疫动物导致DNA抗体产生抑制

合成SSB／La多肽与DNA共同免疫动物导致DNA抗体产生抑制 合成SSB,La多肽与DNA共同免疫动物导 致DNA抗体产生抑制 徐州医学院ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(12)?777? 死亡过程,与坏死在形态学,生物化学及分子生物 机制等方面有本质区别J.对脑缺血的治疗主要 集中在防止发生DND,从而减轻神经细胞的损伤, 起到治疗作用. GST一22作为一种新型中草药提取物,具有较高 的纯度.本研究结果显示,实验大鼠腹腔给予GST一 22能明显减轻大鼠全脑缺血/再灌注模型海马CA1 区的神经细胞凋亡,对脑缺血所产生的神经细胞损伤 从形态学上观察有较明显的保护作用;说明本药能够 较好地透过血脑屏障,作用于脑神经细胞. 目前所研究治疗脑缺血的药物多数是于缺血前 给药有明显的保护作用,而缺血后给药效果不理想. 本实验中GST一22不仅在缺血前给药有显着的保 护作用,在缺血后给药亦表现出较为明显的保护作 用,此结果提示有临床用药可能. 目前,GST一22保护脑缺血神经细胞损伤的作 用机制仍不清楚,有待进一步深入研究. 参考文献 [1]PeiDS,WangXT,LiuY,eta1.Neuroprotectionagainstischae— micbraininjurybyaGluR6—9cpeptidecontainingtheTATpro— teintransductionsequence[J].Brain,2006,129(Pt2):465— 479. [2]WangC,ZhangD,LiG,eta1.Neuroprotectiveeffectsofsafflor yellowBonbrainischemicinjury[J].ExpBrainRes,2007,177 (4):533—539. [3]PulsinelliWA,BrierleyJB.Anewmodelofbilateralhemispheric ischemiaintheunanesthetizedrat[J].Stroke,1979,10(3):267 — 272. [4]NagataS.Apoptosisbydeathfactor[J].Cell,1997,88(3):355 — 365. [5]VauxDL.Towardanunderstandingofthemolecularmechanisms ofphysiologicalcelldeath[J].ProNat1AcadSciUSA,1993,90 (3):786—789. 收稿日期:2007—11—05修回日期:2007—12—10 本文编辑:孙立杰 合成SSB/La多肽与DNA共同免疫动物导致DNA抗体产生抑制 丁敏,李厚敏,陈雪.,张建中. (1.徐州市中心医院皮肤科,江苏徐州221009;2.北京大学人民医院皮肤科,北京 100044) 摘要:目的观察SSB抗原与DNA抗原共同免疫动物时不同抗体滴度的变化,研究 合成SSB/La多肽与 DNA共同免疫动物是否导致DNA抗体产生抑制.根据人SSB抗原cDNA编 码的氨基酸序列,设计合成 214—225位的12个氨基酸多肽,将人工合成多肽与血蓝蛋白 (keyholelimpethemocyanin,KLH)进行耦联,与ds— DNA,SSB联合DNA,KLH,PBS分别作为抗原对5组家兔进行免疫,用ELISA法检 测产生的抗体.并取动物心, 肝,肾,脾和皮肤进行组织学检查和免疫荧光检测.结果ELISA法检测发现,不同抗 原免疫家兔均能诱导相应 抗体产生.联合免疫组SSB/La抗体的滴度明显高于单独SSB免疫组,而dsDNA抗 体的滴度明显低于单独免疫 组.此外,混合免疫组中同一家兔SSB抗体效价显着高于DNA抗体效价.免疫后未 发现动物以上器官组织学改 变.结论SSB多肽,DNA免疫家兔后抗体产生规律存在差异,合成SSB/La多肽与 DNA共同免疫家兔后可导致 DNA抗体产生抑制. 关键词:SSB多肽;dsDNA;共同免疫;抗体产生抑制 中图分类号:R593.24文献标识码:A文章编号:1000—2065(2007)12—0777—04 SSBpeptidesandDNACO——immunizationinducesinhibitionof anti——dsDNAantibodyproduction DINGMin,LIHou—min., CHENXue., ZHANGJian—zhong. (1.DepartmentofDermatology,XuzhouCentralHospital,Xuzhou,Jiangsu221009,China; 2.DepartmentofDermatology,PeopleSHospitalofPekingUniversity,Beijing100044) Abstract:ObjectiveTheaimofthepresentstudyistoobselvetheanti—SSBantibodyandanti —dsDNAantibod一 基金项目:国家自然科学基金(30271194) ? 778?. 徐州医学院ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(12) YproductionprofilesfollowingimmunizationwithsyntheticSSBpeptidesalone,DNAaloneorco—immunizationwith thesetwoantigens.MethodsSSB214— 225aapeptidewassynthesizedbyo~amcchemistrysolid—phasepeptidesyn— thesis.5groupsofrabbitswereimmunizedwiththefollowingantigens:syntheticSSBpeptideslinkedwithkeyholelimpet hemocyanin(KLH),dsDNA,SSBplusDNA,KLHandPBS.TheantibodiesproducedweredeterminedbyELISA.His. topathologyanddirectimmunofluorescenceassaywerealsoperformed.ResultsAnti——SSBandanti——dsDNAantibodies wereproducedthroughimmunizationwithSSBpeptideandDNArespectively.Thetitreofan ti—SSBantibodyinCO—im- munizationgroupwashigherthanthatinSSBpeptideimmunizationgroup,whilethetitreofa nti—dsDNAantibodyinCO — immunizationgroupwaslowerthan山atinDNAimmunizationgroup.Itwasalsorevealedthatthetitreofanti—SSB antibodywasrelativelyhighandthatofanti—DNAantibodywasrelativelylowintheCo—immunizationgroups.PatholOgy showednomorphologicalorimmunologicalabnormalitiesintheheart,liver,kidney,spleena ndskintissues.Conclmion Inhibitionofanti,DNA—antibodyproductionwillbeinducedbyCO—immunizationwithsynthesizedSSBpeptidesand DNA,implyingthatthemildermanifestationsinsomeformsofLEmaybe,atleastpartly,asso ciatedwiththeupper— handformationofanti—SSBantibody. Keywords:SSBpeptides;dsDNA;CO—immunization;restraintofanti—DNAantibodyproduction 系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中往往有多种 自身抗体,如抗dsDNA,抗Sm抗体,抗SSA抗体和 抗SSB抗体等.研究证明,在红斑狼疮(LE)等自身 免疫性疾病的发病机制中,抗dsDNA抗体为最具有 致病性的自身抗体,可参与肾脏损害以及其他脏器 损害的形成【卜.临床上,抗dsDNA抗体滴度消长 往往与LE活动和其严重性相关;抗SSB抗体主要 见于干燥综合征及某些LE患者,而临床上发现有 抗SSB抗体的LE患者往往病情较轻,预后较 好_3J.说明不同抗体不仅有诊断意义,而且可能 还有一定的预后意义.本研究用合成SSB多肽和 DNA抗原免疫动物,观察在分别免疫和共同免疫后 相应抗体产生的情况,以了解在不同抗体产生中有 无相互作用. 1材料和方法 1.1主要试剂与仪器Fmoc一氨基酸,小牛胸腺 DNA(鼎国公司,北京),血蓝蛋白(KLH,Sigma公 司),羊抗兔IgG(Sigma公司),四甲基联苯胺(Sigma 公司),96孔酶联板(Coming公司),多肽自动合成 仪(ABI433A型),高效液相色谱仪(Waters600E), 冷冻抽干机(Virtis). 1.2动物健康新西兰白兔1O只,雌性,体重2kg 左右,分为5组(每组2只).SSB组:标为SSB1, SSB2.DNA组:标为DNA1,DNA2.SSB+DNA组: 标为联合1,联合2.KLH组:标为KLH1,KLH2. PBS组:标为PBS1,PBS2.分别用以下5种抗原进 行免疫:a.合成多肽SSB/La20mg与载体蛋白 KLH交联制备抗原KQKLEEDAEMKS—Y—KLH; b.小牛胸腺DNA;C.SSB+DNA,取SSB—KLH抗 原与DNA抗原混合;d.KLH;e.PBS. 1.3方法 1.3.1多肽抗原氨基酸序列的预测与设计通过 专门结构软件,综合蛋白的二级结构,亲水性, 表面可及性等,结合免疫原性表位,设计合成SSB/ I且多肽.多肽序列:SSB/La214,225aaKQKLEE— DAEMKS—Y.羧基末端加上Y(酪氨酸)以便与载 体(KLH)耦联. 1.3.2抗原表位多肽的合成设计的抗原表位多 肽采用有机化学固相合成法(Fmoc保护的氨基酸, 固相载体为树脂),采用多肽自动合成仪,白多肽的 羧基端向氨基端合成,得到肽树脂,再用TFA法将 多肽从树脂上切割下来,粗提.纯化方法:用Waters 600E高效液相色谱仪,C18反相高效液相色谱法分 离纯化,纯度95%以上.Viais冷冻抽干机抽干. 1.3.3家兔免疫采用浓度为1g/L的抗原多肽 对家兔进行免疫.初次免疫:抗原多肽和弗氏完全 佐剂(CFA)各1ml充分乳化后免疫,背部多点(40 , 5O个点)皮下注射.加强免疫:抗原多肽和弗氏 不完全佐剂(IFA),每间隔2O天加强免疫1次.共 进行免疫4次.在第2,3,4次免疫后1O天左右进 行耳静脉采血,分离血清采用间接ELISA法测定免 疫血清的抗体效价.免疫后14天处死兔(颈动脉 放血),留取血液静置,分离血清行ELISA检测. 1.3.4ELISA法检测抗体用抗原多肽片断(不含 有KLH),DNA,多肽片断+DNA,KLH包被96孔酶联 反应板:多肽片断,0.1mJ/~L,含0.2抗原;DNA,0.1 nd/孔,含2lag抗原;KLH,0.1mJ/~L,含2抗原;pH 9.6碳酸盐缓冲液4~C过夜.PBS—T(O.O1mol/LPBS, pH7.4,含0.05%土温一2o)洗4次,控干.封闭:1% 徐州医学院ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(12)'779' BSApH9.6磷酸盐缓冲液0.1mL/~L37~C1h.PBS— T洗4,5次,控干.将兔血清稀释成(用1%BSAPBS — T):1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200, 1:6400;用正常家兔血清(免疫前的)作阴性对照,稀释 成1:1000,0.1mL/~L37oC30min,PBS—T洗4,5次, 控干.二抗用辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG0.1 mL/~L,37oC40min,PBS—T洗4,5次.显色剂用四甲 基联苯胺(TMD)显色系统.终止液:1mol/LHSO. 测光密度(D)值,检测波长为:450Rill.阴性对照D值 2.1倍以上判定为阳性,阳性结果的最高稀释度为抗体 滴度. 1.3.5组织病理及直接免疫荧光检查处死兔后 立即取肝,脾,心,.肾及皮肤组织分别行组织病理及 直接免疫荧光.按常规操作进行. 2结果 2.1SSB及DNA抗体产生情况第2,3,4次免疫 后留取的血清ELISA法检测抗SSB及抗DNA抗 体,结果显示不同抗原免疫家兔后诱导了相应抗体 产生,第2次免疫后即可检测到抗SSB及DNA抗 体,且抗体效价随免疫次数逐步升高.抗体效价达 到峰值后即不再升高.SSB与DNA联合免疫家兔 时,所检测到的抗SSB抗体滴度较单独SSB多肽免 疫家兔明显升高(表1);而联合免疫组产生的抗 DNA抗体滴度较单独DNA免疫组明显低(表2). 另外,联合免疫组产生的抗SSB多肽抗体明显高于 抗DNA抗体(表3). 表1第3,4次免疫后SSB免疫组与联合免疫组 SSB抗体滴度 表2第3,4次免疫后DNA免疫组和与联合免疫组 DNA抗体滴度 表3第3,4次免疫后联合免疫组SSB抗体 与DNA抗体产生水平 2.2组织病理及直接免疫荧光检查木同抗原免 疫后的兔肝脏,脾脏,心脏,肾脏及皮肤组织病理无 明显异常.直接免疫荧光检查未发现IgG和C,免 疫复合物沉积. 3讨论 抗dsDNA抗体是SLE特别是LE肾炎的标志性抗 体,而抗SSB/La抗体主要见于干燥综合征和某些LE. Wasicek等曾比较了单纯抗Ro/SSA抗体阳性与抗 Ro/SSA和抗La/SSB抗体均阳性的SLE患者的I临床特 征,发现伴有抗La/SSB抗体的SLE患者的临床表现要 较单纯抗Ro/SSA抗体阳性的患者轻.张建中等对 40例亚急性皮肤型红斑狼疮(SCLE)患者进行3,14年 的随访分析后证实了环形红斑型SCLE抗SSB抗体阳 性率更高,病睛更轻,不容易发展成为SLE,而丘疹鳞屑 型SSB抗体阳性率较低,也容易发展成为SLE;认为抗 SSB抗体与病隋较轻,预后较好相关. 在干燥综合征及LE患者中经常可同时检测到 多种自身抗体,Sm抗体常与U1RNP抗体相伴随产 生,而SSA抗体常与SSB抗体相伴随,抗dsDNA抗 体也往往与其他抗体伴随产生.这些抗体之间有无 相互作用目前还不清楚.SSB/La抗体与dsDNA抗 体之间有无相互作用,人们已进行过一些研究,如 Zhang等报道部分抗SSA,SSB抗体是抗dsDNA 抗体的独特型抗体,此种抗体可以抑制dsDNA抗体 与dsDNA的结合,认为这种抗体在调节LE患者ds— DNA抗体产生中具有重要作用. 近年来对SSB抗原结构的研究有了进一步的深 入,相继发现了一些免疫表位.人SSB/La抗原cD— NA包括1631个碱基,编码408个氨基酸.文献表 ? 780?徐州医学院ACTAACADEMIAEMEDICINAEXUZHOU2007,27(12) 明La1—107位氨基酸,La111—242位氨基酸和La 346—408位氨基酸为免疫优势表位J.Terzoglou 等?用SSB抗原表位多肽免疫家兔产生了抗相应 表位的抗体及其他表位甚至全长SSB抗原的抗体. 本实验通过对SSB抗原分子结构的分析,选择合成 了SSB/La214,225aa十二肽,该多肽位于文献报[3] 告的抗原优势表位区域内. 在本实验中不同抗原免疫家兔后均产生了相应 抗体.在联合免疫组中抗SSB/La抗体的滴度明显 高于抗dsDNA抗体,提示在2种抗原共同免疫过程 中,2种抗体的产生形成了一定的"竞争"现象,而在 此竞争中,抗SSB/La抗体的产生体现出优势效应, 相对抗dsDNA抗体产生就处于弱势.从单独免疫 和共同免疫时抗SSB/La抗体和抗dsDNA抗体滴度 的变化情况,也提示抗SSB/La抗体产生对抗dsDNA 抗体产生有一定"抑制':作用.这种现象产生的机 制还不清楚,但因为dsDNA抗体在LE中是一种致[7] 病性极强的自身抗体,抗dsDNA抗体被抗SSB/La 抗体所抑制可能会导致抗dsDNA抗体相关性炎症 反应及组织损伤的减少,可能会减少DNA一抗DNA 免疫复合物介导的免疫反应,从而减轻病情.另一 方面,尽管SSB/La抗体也是自身抗体,但多与病变 轻微密切相关,提示其致病性弱,如果弱致病性抗体L9J 能对强致病性抗体产生抑制,则具有积极意义. 本实验从抗体生成的角度探讨了SSB/La抗体 和抗dsDNA抗体之间的关系.虽然本实验中SSB『1o] 和DNA免疫后产生了相应抗体,但被免疫动物各器 官的组织病理检查无异常,直接免疫荧光亦无免疫 沉积,提示诱导LE及其他自身免疫病的炎症和组织 损伤除了自身抗体产生外尚需其他因素的参与. 参考文献: [1]BalowJE,AustinHA3rd.Renaldiseaseinsystemiclupuserythe- matosus[J].RheumDisClinNorthAm,1988,14(1):l17— 133. ArbuckleMR,JamesJA,KohlhaseKF,eta1.Developmentofanti —- dsDNAautoantibodiespriortoclinicaldiagnosisofsystemiclu— puserythematosus[J].SeandJImmunol,2001,54(1—2):2l1 — 219. WasieekCA,ReichlinM.Clinicalandserologicaldifferencebe- tweensystemiclupuserythematosuspatientswithantibodiestoRo VeTSUSpatientswithantibodiestoRoandLa[J].JClinInvest, 1982.69(4):835—843. TebbeB,MansmannU,W0llinaU,eta1.Markersincutaneous lupuserythematosusindicatingsystemicinvolvement.Amulticenter studyon296patients[J].ActaDermVenereol,1997,77(4): 305—308. 张建中,金江,郭利邵,等.两型亚急性皮肤型红斑狼疮病情 演变的分离现象[J].中华皮肤科杂志,2001,34(1):9一l1. ZhangW,ReiehlinM.Someauto—antibodiestoRo/SS—Aand La/SS—-Bfileanti—-idiotypestoanti—-double—-strandedDNA [J].ArthritisRheum,1996,39(3):522—531. ZhangW,WinklerT,KaldenJR.eta1.Isolationofhumananti— idiotypesbroadlycrossreactivewithanti—dsDNAantibodiesfrom patientswithsystemiclupuserythematosus[J].SeandJImmunol, 2001,53(2):192—197. ZhangW,FrankMB,ReichlinM.Productionandcharacterization ofhumanmonoelonalanti—?idiotypeantibodiestoanti—-dsDNAan— tibodies[J].Lupus,2002,l1(6):362—369. MeNeilageLJ,MacmillanEM,WhittinghamSF.Mappingof epitopesontheLa(SS—B)autoantigenofprimarySj~grenSsyn— drome:identificationofaClOgs—reactiveepitope[J].JImmu— nol,1990,145(11):3829—3835. TerzoglouAG,RoutsiasJG,SakarellosC,eta1.Linearepitopes oftwodifferentauto—.antigens—-La/SSBandmyelinbasicprotein ,一withahighdegreeofmolecularsimilarity,causedifferent humoralimmuneresponses[J].JAutolmmun,2003,21(1):47 , 57. 收稿日期:2007—10—07修回日期:2007—12—10 本文编辑:程春开 乌司他丁对呼吸机所致肺损伤大鼠体内炎性因子的影响 肖刚,赵文静 (徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室,江苏徐州221002) 摘要:目的观察乌司他丁对呼吸机所致肺损伤大鼠体内炎性因子的影响.方法24 只SD大鼠随机分为 对照组,大潮气量通气组和乌司他丁处理组,每组8只.大潮气量通气组和乌司他丁 处理组接受机械通气,通气 参数均设为:潮气量30ml/kg,呼吸频率40次/min,吸呼比1:3,吸入氧浓度21%.机械 通气4h后分别测定支气 基金项目:江苏省科技厅社会发展基金(BS2005019) 通信作者,E—mail:xiaoshengmail@126.corn