为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

基因体外定点突变技术的研究进展

2017-09-27 6页 doc 21KB 27阅读

用户头像

is_266065

暂无简介

举报
基因体外定点突变技术的研究进展基因体外定点突变技术的研究进展 分类号 Q754 目前分子生物学技术在医学检验工作中得到广泛 Ml3 单链 DNA ; ?用化学法合成带错配碱基的突 因的 的应用 。分子生物学技术对于疾病的快速诊断及从分 变寡核苷酸引物 ,并将突变引物 5’端磷酸化 ; ?与含 子水平上阐明疾病的发病机理都具有重要意义 。定点 目的基因的 M13 单链 DNA 混合退火 ,在待突变的核 ( ) 突变 site2directed mutagenesis技术除用于改变编码特 苷酸部位及其附近形成一小段碱基错配的异源双链的 定氨基酸的碱基 ,获得...
基因体外定点突变技术的研究进展
基因体外定点突变技术的研究进展 分类号 Q754 目前分子生物学技术在医学检验工作中得到广泛 Ml3 单链 DNA ; ?用化学法合成带错配碱基的突 因的 的应用 。分子生物学技术对于疾病的快速诊断及从分 变寡核苷酸引物 ,并将突变引物 5’端磷酸化 ; ?与含 子水平上阐明疾病的发病机理都具有重要意义 。定点 目的基因的 M13 单链 DNA 混合退火 ,在待突变的核 ( ) 突变 site2directed mutagenesis技术除用于改变编码特 苷酸部位及其附近形成一小段碱基错配的异源双链的 定氨基酸的碱基 ,获得突变体蛋白质来研究基因的结 构与功能关系的基础研究之外 ,还有用于医学检验的 DNA 。在大肠 杆 菌 Klenow 大 片 段 酶 的 催 化 下 , 引 物 趋势 。了解该技术的原理 ,对于理解疾病的基因诊断 链便以 Ml3 单链 DNA 为模板继续延长 ,直至合成出 以及医学检验工作中相关分子生物学技术有一定的作 全长的互补链 ,而后由 T4DNA 连接酶封闭缺口 ,最终 用 。目前成熟的定点突变方法有寡核苷酸引物突变 、 在体外合成出闭环的异源双链的 Ml3DNA 分子 ; ?这 PCR 突变及盒式突变 。 些体外合成的闭环异源双链 DNA 分子转化大肠杆菌 1 寡核苷酸引物突变后 ,产生同源双链 DNA 分子 ,转化子会产生出两种类 型的噬菌体 ,一种是野生型的 ,另一种是突变型的 ; ? 其原理是用 1 . 1 寡核苷酸引物突变的原理和过程 根据不同的具体情况 ,可以用如下四种方法之一 ,即链 合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物 ,启动单 终止序列法 、限制位点筛选法 、杂交筛选法和生物 链 DNA 分子进行复制 , 该 寡 核 苷 酸 引 物 作 为 新 合 成 学筛选法来筛选突变体克隆 ;其中 ,杂交筛选法最简单 的 DNA 子链的一部分 。产生的新链具有突变的碱基 也最常用 ,它是用 T多核苷酸激酶使突变寡核苷酸引 4 32 物带上P 同位素作为探针 ,在不同的温度下进行噬菌 序列 。为了使目的基因的特定位点发生突变 ,所设计 斑杂交 ,由于探针同野 生 型 DNA 之 间 存 在 着 碱 基 错 的寡核苷酸引物序列除了所需的突变碱基之外 ,其余 配 ,而同突变型则完全互补 ,于是便可以依据两者杂交 的则与目的基因编码链的特定区段完全互补 。用作定 稳定性的差异 , 筛 选 出 突 变 型 的 噬 菌 斑 ; ?对 突 变 体 点突变的寡核苷酸引物现通常采用化学法合成 ,长度 DNA 作序列分析 。 范围一般为 10,30 个核苷酸 ,错配碱基应设计在突变 1 . 2 寡核苷酸引物突变法的改进 应用寡核苷酸引 寡核苷酸分子的中央部位 。为避免大肠杆菌 DNA 聚 物突变法常产生突变效率低的现象 。其原因是大肠杆 合酶 I 的 5 ’和 3 ’端 外 切 核 酸 酶 活 性 , 使 用 大 肠 杆 菌 菌中存在有甲基介导的碱基错配修复体系 ,将细胞中 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 大片段酶消除 5’外切核酸酶 那些尚未被甲基化的新合成的 DNA 链中错配的碱基 的活性 。另外在错配碱基的 3’端外存在有一个以上 被优先修复 , 从而 阻 止 了 突 变 的 产 生 , 造 成 突 变 效 率 的其它碱基 ,就可以抵制 3’外切核酸酶活性 。寡核苷 低 。针对寡核苷酸引物突变法存在的问 , Kunkel 早 酸引物诱发的定点突变最早是使用噬菌 体 øX174 作 在 1985 年对此进行了改进 , 降低野生型本底 。近几 为待突变的目的基因的载体 ,之后又发展出了一种更 年来 ,几家生物公司对此进行了进一步的完善 ,并相继 加简单高效的程序 。将目的基因插入到 M13 派生载 推出了本公司的产品 。据不完全统计 ,普洛麦格公司 体上 ,应用单链噬菌体 DNA 作为目的基因的载体 。它 开发了 Alter sites ? in vit ro Mutagenesis System ,安法 的优越性在于可简单快速地分离单链模板 DNA ,并且 玛西亚公司开发了 U nique Site Eliminatio n Mutagenesis 用放射性同位素标记的突变寡核苷酸作探针 ,可以容 Kit , S TRA TA GEN E 公 司 开 发 了 Qui kChange Site - 〔1〕〔2〕易地筛选出突变体克隆 。L aird和 L e应用该技术 Directed Mutagenesis Kit ,伯乐公司开发了 Muta - Gene 〔3〕 进行了信号转导机理及细胞凋亡的研究 。Fletcherin vit ro Mutagenesis Kit 。Pro mega 公司的试 剂 盒 的 主 利用该技术将组氨酸残基突变引入 J el 103 抗体中 ,使 要改进之处有 : ?采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受 之变成具有催化作用的抗体酶 ,开辟了不同于以往的 菌体 ,大大降低了突变修复频率 ; ?待突变基因克隆至 〔4〕用免疫方法获得抗体酶的 新 途 径 。Ko no为 了 观 察 噬菌体后 ,常要经过制备单链噬菌体的过程 ,该公司推 β赖氨酸在血红蛋白四聚体携氧功能以及亚基间协 66 出的 pAlter - Ex2 质粒 , 可经 热 变 性 后 直 接 进 行 突 变 同性中的作用 ,用定点突变技术制备了 3 个突变体 ,发 径 。如在所设计的引物 5’端加入合适的限制性内切 ,其保真度比 PCR 突变法高 ,经过改进后使该 变方法 酶位点 ,为 PCR 扩增产物后续的克隆提供方便 。同时 方法突变成功率大大提高 ,缺点是操作过程环节复杂 。 4 . 2 PCR 突变 PCR 定点突变法的长处是 , 获得目 可通过改变引物中的某些碱基改变基因序列 ,为有目 的地改造 、研究蛋白质的结构和功能之间的关系奠定 的突变体的效率可达 100 % ,但它亦有两个缺点 。其 了基础 。 一 , PCR 扩增产物通常需要先连接 到 载 体 分 子 上 , 然 2 . 1 重组 PCR 定点突变法 重组 PCR 的定点突变 后才能对突变的基因进行转录 、转译等方面的研究 ;其 法 ,可以在 DNA 区段的任何部位产生定点突变 。使用 二 , TaqDNA 聚合酶拷贝 DNA 的保真性偏低 。因此 , 的这种重组 PCR 定点突变法 ,需要四种扩增引物 ,共 PCR 方法 产 生 的 DNA 片 段 必 须 经 过 核 苷 酸 序 列 测 进行三轮 PCR 反应 。其中 ,头两轮分别扩增两条彼此 定 ,方可确证有无发生其它突变 。 4 . 3 盒式突变 盒式突变法具有比前两者简单易行 、 重叠的 DNA 片段 ,第三轮 PCR 使这两条片段融合起 突变效率高等优点 ,可在一对限制酶切位点内一次突 来 。它在头两轮 PCR 反应中 ,应用两个互补的并在相 同部位具有相同碱基突变的内侧引物 ,扩增形成两条 变多个位点 。缺点是在靶 DNA 区段的两侧需存在一 有一端可彼此重叠的 双 链 DNA 片 段 , 两 者 在 其 重 叠 对限制酶单切点 ,限制了该方法的广泛应用 。然而在 区段具有同样的突变 。由于具有重叠的序列 ,所以在 一般情况下 , 靶 DNA 的序 列 结 构 往 往 难 以 满 足 此 种 去除了未参入的多余 引 物 之 后 , 这 两 条 双 链 DNA 片 要求 ,若一旦具备了这样的条件 ,那么使用由简并的寡 段经变性和退火处理 ,便可能形成两种不同形式的异 核苷酸组成的突变体盒子作盒式突变 ,将合成的突变 源双链分子 。其中一种具 5’凹陷末端的双链分子 ,不 的寡核苷酸盒插入到质粒载体分子上 ,取代结果是形 能作为 TaqDNA 聚合酶的底物 ;另一种具 3’凹末端的 成一种含有不同序列的突变体质粒文库 。在一次的实 双链分子 , 可 通 过 TaqDNA 聚 合 酶 的 延 伸 作 用 , 产 生 验中便可以获得数量众多的突变体 ,大大减少了突变 出具两重叠 序 列 的 双 链 DNA 分 子 。这 种 DNA 分 子 需要的次数 。这对于研究蛋白质中不同位点氨基酸残 再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三轮 PCR 扩增 ,便 基的重要性是非常有用的方法 。 可产生出一种突变位点远离片段末端的突变体 DNA 。 4 . 4 合理选择符合研究需要的方法 三者间并不是〔6〕Mukhopadhyay用该方法将 Bam HI 限制性内切酶的 绝对对立的 。比如 PCR 突变法可以与盒式突变法相 第 54 位半胱氨酸被丙氨酸取代后提高了该酶的活性 。 结合 ,用 PCR 方法合成一段常规化学方法不能合成的 〔8〕2 . 2 大引物突变法 该方法的核心是以第一轮 PCR 较长片段用于盒式突变中 。史瑾用该方法进行了玉 扩增产物作为第二轮 PCR 扩增的大引物 ,只需三种扩 米叶绿体合成酶亚基的活性研究 。 参考文献 增引物进行两轮 PCR 反应 。第一次 PCR 反应在引物 1 L aird AD , Mo rriso n D K , Shalloway D. Characterizatio n 2 和引物 3 之间扩增 ,引物 2 中含有突变的碱基 ,为突( ) of Raf - 1 activatio n in mito sis. J Biol Chem ,1999 ,274 7:4430 变引物 。将 第 一 次 PCR 扩 增 产 物 纯 化 , 作 为 第 二 次2 L e Dai J ;Bansal R K ; Kern SE. G1 cell cycle arrest and PCR 反应时的引物 ,可获得突变体 DNA 。apopto sis inductio n by nuclear Smad4/ Dpc4 :p henot ypes reversed 3 盒式突变by a t umo rigenic mutatio n . Proc Natl Acad Sci U S A , 1999 , 96 核酸限制性内切酶的限制位点可以用来克隆外源 ( ) 4:1427 的 DNA 片段 。只要有两个限制位点比较靠近 ,那么两 3 Fletcher MC ; Kuderova A ; Cygler M ; L ee J S. Creatio n 者之间的 DNA 序列就可 以 被 移 去 , 并 由 一 段 新 合 成 of a ribo nuclease abzyme t hro ugh site - directed mutagenesis. 的双链 DNA 片段所取代 。盒式突变就是利用一段人 ( ) Nat Biotechnol , 1998 ,16 11:1065 工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段 ,取代野生型 4 Ko no M ; Miyazaki G ; Nakamura H ; Wada Y ; Imai K. Site - directed mutagenesis in hemoglo bin :at tempt s to co nt rol t he 基因中的相应序列 。这种突变的寡核苷酸盒是由两条 o xygen affinit y wit h cooperativit y p reserved. Protein Eng , 1998 , 合成的寡核苷酸组成的 ,当它们退火时 ,会按设计要求 ( ) 11 3:199 产生出克隆需要的粘性末端 , 由于不存在异源双链的 〔7〕5 Wane A ; Pakl K A. Mut ual stabilizatio n of VL and V H 中间体 ,因此重组质粒全部是突变体 。彭贵洪用核 in single - chain antibo dy f ragment s , investigated wit h mutant s 酸限制性内切酶 Eco R I 和 Msc I 消化质粒 DNA ,这两 ( ) engineered fo r stabilit y. Biochemist ry ,1998 ,37 38:13120 种限制酶的切割位点是位于待突变序列的两侧 。将这 6 Mukhopadhyay P ; Roy KB. Protein engineering of 一小段切割产生的含有部分野生型序列的 DNA 片段 Bam HI rest rictio n endo nuclease : replacement of Cys54 by Ala en2 移走 ,并用一段具有期 望 突 变 序 列 的 DNA 片 段 取 而 ( ) hances catalytic activit y. Protein Eng ,1998 ,11 10:931 代之 ,连接到质粒载体上 。这段突变体 DNA 片段由两 7 彭贵洪 ,马 忠 ,薛宇鸣等. 尿激酶变体的构建及其性 条互补的合成的寡核苷酸组成 ,当它们退火时会产生 ( ) 质研究. 生物化学与生物物理学报 ,1997 ,29 6:547 出匹配的两个粘住末端 ,用该方法进行了尿激酶变体 8 史 瑾 ,魏家绵 ,沈允钢. 玉米叶绿体合成酶亚基的定 ( ) 的性质研究 。 点突变. 生物化学与生物物理学报 ,1998 ,30 5:483 〔收稿 :2000 - 04 - 10 修回 :2000 - 06 - 09〕4 三种方法的优缺点比较 其是应用范围最广的突 4 . 1 寡核苷酸引物突变法
/
本文档为【基因体外定点突变技术的研究进展】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索