水泡性口炎诊断技术

水泡性口炎诊断技术 ICS 11(220 B 41 YN 中华人民共Sn国农业行业标准 1 188—2006 NY,T 水泡性口炎诊断技术 for vesicular stomatitis Diagnosis techniques 2006—10一01实施 2006—07—10发布 中华人民共和国农业部发布 1 NY,T 188—2006 刖 置 水泡性口炎(VS)是由弹状病毒科的水泡性 口炎病毒(VSV)引起的马、牛和猪的一种水泡性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病，我国将其列为二类疫病。本病临床上与口蹄疫、猪水泡 病、猪水泡疹很难区别，主要表现为口唇部有水泡、溃疡、糜烂，影响采食，导致生长缓慢，影响经济效益。 OIE采用组织细胞、鸡胚、实验动物等方法分离水泡性口炎病毒，进一步用问接夹心酶联免疫吸附 试 验(IS‘ELIsA)和补体结合试验(cF)对分离的病毒进行鉴定;在国际贸易中，OIE指定用液相阻断酶联免疫吸附试验(LP—ELISA)、病毒中和试验(VN)和补体结合试验(cF)检测水泡性口炎血清样品。 本标准中水泡性口炎的病毒分离试验、IS—ELISA试验和病毒中和试验，是根据OIE{哺乳动物、 禽、蜜蜂A和B类疾病诊断实验和疫苗标准手册)(2000版)中的诊断技术以及国内近年来在水泡性口 炎方面的研究成果而制定的，其中病毒分离试验、IS-ELISA试验和病毒中和试验均与OIE的标准性文 件等效。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标 本标准起草单位:农业部动物检疫准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 所。 本标准主要起草人:李其平、龚振华、陆明哲、郑增忍、郭福生、蒋正军、王 海霞。 NY,T 1188—2006 水泡性口炎诊断技术 1范围 本标准规定了水泡性口炎(VS)的病毒分离鉴定试验、间接夹心酶联免疫吸附试验(IS— ELISA)和病毒中和试验(VN)的技术。 本标准适用于水泡性口炎流行病学调 查、临床诊断和实验室检测等。 2病原分离与鉴定 2(1病原分离 2(1(1器材 100 mL玻璃细胞培养瓶，恒温水浴箱，C02培养箱，超净工作台，倒置显微镜。 2(1(2试剂及溶液配制 MEM营养液，PBS缓冲液，犊牛血清，7(5,碳酸氢钠溶液，青霉素(104TU,mL)与链霉素(104mg, 7(2,mL)溶液，3,的谷氨酰胺溶液，Hanks液，灭菌生理盐水，0(25,胰蛋白酶溶液，缓冲甘油(pH 7(7)，配制方法见附录A。 2 1(3样品的采集 2(1(3(1采集发病动物口鼻部位的水泡皮和水泡液，水泡皮加人含50,甘油的PBS缓冲液中，水泡液 置于含2,犊牛血清和5,葡萄糖的灭菌生理盐水中，冷藏送检。保存液的体积不能超过水泡皮或水泡 液体积的2倍。 2(1(3(2不能获得水泡皮和水泡液时，牛可用探杯采集食道,n因(OP)黏液，猪可采集咽喉拭子，置于无 血清的细胞培养液中，冷藏送检。无血清细胞培养液的体积不能超过黏液或咽喉拭子的2倍。 2(1(4样品的处理 mol,L的PBS缓冲液中(含青霉素1 0002(1(4(1将水泡皮剪碎，研磨，悬浮于5倍体积的pH7(2、0(2 r,min离心15rain，取上清液，用O(2m微IU,mL、链霉素l 000mg,mL)，4?浸渍16h-20h，以3000 孔滤膜过滤。 2(1(4(2将水泡液、OP液、棉拭子浸液加青霉素至1 000IU,mL、链霉素至1 000mg,mL，离心，取上清 液，用0(2舯微孔滤膜过滤。 2(1(5细胞接种 2(1(5(1将2(1(4的样品1mL接种长成单层的VERO细胞、BHK一21细胞或IB—RS一2细胞，37?吸 附1 h，中间摇动一次。 2(1(5(2加入9 mL维持液，37*(3、5,C02培养箱中培养。 2(1(5(3每天观察细胞病变效应(CPE)，连续观察3天。 2(1(5(4如果细胞出现圆缩、聚集、固缩、脱落等病变，则进一步按方法2(2进行病原鉴定。盲传 3代 无病变者按2(1(8处理。 2(1(6鸡胚接种 2(1(6(1将鸡胚卵置于蛋架上，气室朝上，以碘酒、酒精棉球消毒气室，用剪刀去除气室部蛋壳。2(1(6(2用无菌眼科镊子撕去一小片内壳膜，在绒毛尿囊膜上滴入2(1(4中的样品0(2mL。 2(1(6(3用无菌脱脂棉撕成薄片盖住蛋壳，用蜡封口，于37?孵育。 1 2(1(6(4如果鸡胚2天内死亡，鸡胚周身呈明显充血、出血，尿囊膜肥厚，收获尿囊膜按2(2方法作进 一步鉴定。盲传3代无病变者按2(1(8处理。 2(1(7乳鼠接种 2(1(7(1将2(1(4的样品颈部皮下接种2日--7日龄乳鼠，每只接种0(2mL。 2(1(7(2每天观察乳鼠病变，连续观察5天。 2(1(7(3如果乳鼠出现死亡、生长不良等病变，则按2(2方法进一步鉴定。盲传3代无病变者按 2(1(8处理。 2(1(8可疑非免疫动物样品 d,14 d后的该动物血清，用方法3进行抗体检测。若 盲传3代未分离到病毒者，可进一步采集7 检测结果为阴性，则判为无?、v感染;若检测结果为阳性，则判为有VsV感染。 2(2病原鉴定一间接夹心酶联免疫吸附试验(IS?ELISA】 2(2(1器材40孔带盖灭菌酶标板，单道可调(10,-L--200止)移液器，8和12道可调(50,tL--200 “L)移液器，灭菌塑料滴头。 2(2(2试剂及溶液 2(2(2(1试剂:抗原，豚鼠抗VSv的标准NJ型和IND型血清，兔抗VSV的标准NJ型和IND型血 清，兔抗豚鼠18(3，正常兔血清，卵白蛋白，TMB底物。 2(2(2(2溶液:pH7(2、0(2mol,L的PBS缓冲液，pH 9(6的碳酸盐,碳酸氢盐缓冲液，PBSTB，配制见 附录A。 2(3样品 样品采集、处理与2(1(3--2(1(4相同。 2(4操作方法 2(4(1用pH9(6的碳酸盐,碳酸氢盐缓冲液将兔抗?、v的NJ型阳性血清、IND型阳性血清和正常兔 血清包被ELISA板，每孔50止，于4"C过夜。 2(4(2弃包被液，每孔用磷酸缓冲盐水(PBs)洗1次，加50 pLl,的卵白蛋白(用PBS液稀释)，在室 h。 温下封板1 2(4(3弃封闭液，每孔用PBSTB冲洗3次。 2(4(4将被检样品悬液或2(1中致病变的分离培养物50 pL加到相应的孔中，每份样品均作双孔，振 荡，37?孵育30 min。 2(4(5弃反应液，每孔用PBSTB冲洗5次。 2 4(6将与包被ELISA板的兔抗VsV标准阳性血清相应的豚鼠抗VSV的标准NJ型和IND型阳性 血清用PBSTB稀释，分别加50止到相应的孔中，振荡，37'C孵育30min。 2(4(7重复2(4(5。 min。2(4(8将过氧化物酶兔抗豚鼠IgG结合物用PBSTB稀释，每孔加入50止，振荡，37?孵育 30 2(4(9重复2(4(5。 1M硫酸终止反应，用 2(4(10每孔加活化的TMB底物50止，在室温下反应15min，随后加入50,uL 酶标仪测定吸光值。 2(4(11设标准阳性抗原对照。 2(4(12结果判定 2(4(12(1读取样品与抗vsv的NJ型、Inm型阳性血清和正常兔血清反应的吸光值，计算双孔平 均值。 2 NY,T 1188—2006 2(4(12(2对照抗原与其相应血清反应的吸光值较其与另一型血清反应的吸光值和正常兔血清反应的 吸光值大20,，试验成立。 2(4(12(3如果某个血清型反应的吸光值与另一血清型反应的吸光值和正常兔血清反应的吸光值相比 较，其样品吸光值大于后两者20,，则被检样品为感染该相应血清型的VsV。 2(4(12(4如果某个血清型反应的吸光值与另一血清型反应的吸光值和正常兔血清反应的吸光值相比 较，其样品吸光值大于后两者，但不超过20,，应重复试验，如仍不超过20,，则为阴性。 3中和试验(本方法用于检测VSV抗体) 3(1器材 96孔细胞培养板，其他器材同2(1。 3(2试剂及溶液配制 vsv的NJ型、IND型病毒，VSV的NJ型、IND型阳性血清和阴性血清，细胞培养用培养液及溶液 配制与2(1(2相同。 3(3样品的采集和处理 无菌采集血液，常规分离血清，将待检血清样品置 min。 56"C水浴灭活30 3(4操作方法 3(4(1病毒半数组织培养感染?【TCIDso)的测定 3(4(1(1将?jV标准毒株接种于长成单层的IB—RS一2细胞，接种量为培养基液的1,10，37"C培养， 待出现病变后，冻融，收获病毒。 、10。2 每个稀释度取50皿加入3(4(1(2用MEM培养液将vSV病毒作连续10倍稀释，即10 96孔细胞培养板中，随后加入经0(25,胰酶消化的IB—RS一2细胞悬液150 vtL(总细胞数约为3×105个左右)，每个稀释度作8个孔重复，并设正常细胞对照。置37"C5,C02培养箱中。 d-4 3(4(1(3逐El观察细胞病变，共观察3 d，细胞病变孔数。按照Reed—Muench法计算病毒的 TCI耽o。 3(4 2中和试验 3(4(2(1在细胞培养板各孔中加入50 MEM培养液，随后在第1孔中加入1:2稀释待检血清50止 btL 混合后，用微量移液器取出50止，加到第2孔中，混匀后取出50止再加入第3孔中，依此类推，直到第 048，每份待检血清稀释度作4个孔重复。10孔，血清稀释度即为1:4、1:8 1:2 h。 3(4(2(2将50pL含1 000个TCII珐。的病毒液加到不同稀释度血清孔中，37*(3作用1 3(4(2(3每血清孔中加入100止经胰酶消化分散的IB—RS一2细胞悬液(总细胞数约为3×105个左右)。 3(4(2(4设立对照组。 000 mL病毒液作3(4(2(4(1病毒回归试验:每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将1 TCID50,50 IB—RS一20(1、1、10、100、1 000倍稀释，每个稀释度作4孔，每fL加50 uL病毒液，然后每孔加150,uL 细胞悬液(总细胞数约为3×105个)。 3(4(2(4(2阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照。 000 d,4 d。病毒回归试验1 3(4(2(5逐El观察，记录病变和非病变孔数，共观察3 TCID50值应为 500-1 330之间，阳性血清和阴性血清的滴度在其预先测定的平均值2倍以内，待检血清和正常细胞对 照成立，测定结果方有效，否则该试验不能成立。 3(4(3抗体中和效价 按照Spearlnann—Karber法计算抗体中和效价。如抗体效价大于1:40，则 判为VSV抗体阳性。 3 NY,T”88—2006 附录A (规范性 培养基及溶液附录) 的配制 A(1细胞生长液 MEM 按常规方法配制 10,犊牛血清 1, 双抗溶液 谷氨酰胺 1, 1,丙酮酸钠 用7(5,的碳酸氢钠调pH至7(0--7(2。置4?保存。 A(2细胞 维持液按常规方法配制MEM，在MEM中按体积比加入 犊牛血清 2, 1,双抗溶液 1,3,谷氨酰胺 用7(5,的碳酸氢钠调pH至7(0--7(2。置4?保存。 A(3双抗(青链霉素)溶液 青霉素 100万IU 链霉紊 100万mg 100mL双蒸水 将双蒸水放于500 kPa 20 roan。青链霉素用少量双蒸水溶解后，再用双蒸水定 mL瓶中高压103(4 容至100mL。 A(4 7(5,的碳酸氢钠溶液 碳酸氢钠 7(5 g(NaHC03) 双蒸水 100mL 先将滤器灭菌后，加入液体过滤后分装于青霉素瓶中放4"C保存备用。 A(5 3,谷氨酰胺溶液 谷氨酰胺 3 双g 100mL 蒸水 过滤除菌，分装于青霉素瓶中冻结保存。 A(6 0(25,胰蛋白酶溶液 氯化钠(Naa) 8(0 g 氯化钾(KCI) 0(2 g 柠檬酸钠(2个结晶水) 1(0 g 4 NY,T 1188—2006 磷酸二氢钠(1个结晶水)0(05 g 葡萄糖 1(0 g 胰蛋白酶 2(5 g1 加双蒸水 000mL 上述试剂依次溶解，胰酶可先用0(5,酚红4mL 少量水37'(3温箱中水浴溶解至透彻清亮，倒人量筒中，用7(5,的碳酸氢钠调pH至7(6--7(8，定容至1 000mL，过滤除菌，分装小瓶，置一20?冰箱保存。 A(7生理盐水 双蒸水氯化钠(NaCI)8(5 g 1 氯化钠融000mL kPa 15 化后分装，103(4 min高压，室温保存。 A(8 Hanks原溶液 氯化钠 g 磷酸氢二钠(12个结晶水)0(6 g氯化钾(KCI)4(0 g (NaCl)80 磷酸二氢钾(KH2PO()0(6 硫g 葡 2(0 g 酸镁(7个结晶水)萄糖 10(09 无 1(4 g 双水氯化钙(CaCl2) 1 000mL 蒸水 在配制时，应先将无水氯化钙用一小烧杯加入约100mL双蒸水，置4?冰箱中溶解。等其他药品 融完后，加入混匀，定容至1 000mL。用滤纸过滤后，加入2mL氯仿，经充分混匀后，置4"C冰箱中 保存。 A(9 7(2、0(2mol,L PBS溶液 溶液甲pH 28 mL(A9(1) 溶液乙(A9(2) 72mL 0(85 氯化钠(NaCl)g 等氯化钠溶解后，置室温保存备用。 A(9(1 磷酸氢二钠(12个结晶水)71(632 g 1 000mL 双蒸水 A(9(2 31(2 磷酸二氢钠(2个结晶水) g 双蒸水 1 000mL A(10 pI-I 9(6的碳酸盐,碳酸氢盐缓冲液 1(59 碳酸钠(Na2C03) g 2(93 碳酸氢钠(NaI-ICCh) g 迭氮钠 0(2 g 000mL双蒸水 加至1 5 NY,T 1188—2006 A(11 PB哪 0(05, 吐温一20 1, 卵白蛋白 正常 2, 兔血清 正常 2, 牛血清 PBS 100mL 补足至 6