ANXA1在肿瘤细胞多药耐药和药物代谢酶CYP3A4表达调控中的作用

ANXA1在肿瘤细胞多药耐药和药物代谢酶CYP3A4表达调控中的作用 ANXA1在肿瘤细胞多药耐药和药物代谢酶CYP3A4表达 调控中的作用 ‘j、毒 、轰lI】;，r耋i,。I 论文评阅人l: 评阅人2: 评阅人3: 评阅人4: 评阅人5: 答辩委员会主席: 扬 这熬援 浙江太堂 委员1: 睦国独盟究员 澎江笪医堂叠堂院 委员2: 整惠搓数援 逝江太堂 委员3: 睦 盅熬援 浙江太堂 委员4: 鱼趟至熬援 浙江太堂 :tt鼍li，，一 委员5: 答辩日期:―上010(6(4 Author’S signature - ? ? 一 7S Supervisorsignatur Thesisreviewer1: ?坠Q堕?卫i!Y ‘ r”11 ^ lhesisreviewerz: ?nQ堕Y塑i!Y Thesisreviewer3: ?塾Q堕如卫i!Y Thesisreviewer 4: ?堕Q堕 堂i!Y reviewer5: Thesis ?坠Q堕?坠i!Y Chair: ,!Q,旦Q坠坠Ig兰b自i垒ng堕旦iy曼,鱼鲤 oral of Committeedefence Committeeman Q,丛星鱼iQ垒!S曼i曼n曼曼墨 1:,!受,鱼垡Q墨h曼n，,旦星N圣h自i垒ng?堡垒亟曼!卫Y Committeeman2: ,投,H丛i鱼i』I?盟g至鱼自i垒ng堕熊Y曼 ,煎!Y Committeeman 3:,煦,ZhQng,H曼世圣b自i垒堕g堕niy曼【墨i!Y Committeeman 4:,艘,Qi垦翊坠n H星圣塾曼ji垒ng堕廷iy曼!堑!Y Committeeman5: Dateoforaldefence:201O一6―4 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘鲎或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 签字同期:衣矽扣年岛月f1日 学位论文版权使用授权书 有权保留并向国家有关部门或机 本学位论文作者完全了解 迸姿态堂 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书 导师签名: 学位论文作者签名: 同 签字同期:，L舻年C，月噍 签字同期:必f口年6月 日 致谢 浙江大学博十学位论文 致 谢 博士论文付梓之际，五年的研究生生涯即将结束。在这些激情燃烧的岁月里， 西子湖畔近九年的寒窗苦读，我在浙江大学实现了从一个懵懂的高中毕业生到一 名博士毕业生的蜕变。期间的风风雨雨，苦乐甘甜，有科研路途上的困惑绝望， 有攻克难题时的振臂欢呼，也有披星戴月，风雨兼程，我付出很多，收获更多， 回首求学路上的点点滴滴，我的每一步成长都离不开我的恩师们和亲友们的鼓励 和帮助，衷心感谢你们! 感谢我的导师曾苏教授。是您严谨的治学态度，为我树立了优秀学者的榜样 和;是您渊博的知识，为我把握课题方向;是您为我创造了出国交流学习的 机会，帮助我打开更广阔的视野;也是您一遍遍审思和斧正我的论文并督促我反 复思考实验设计思路与修改，为我的顺利毕业倾注无数心血和汗水。您厚德载物， 虚怀若谷，一心为学生着想，遇到这样的导师，是我的幸运和一辈子的感激。 感谢邵逸夫医院曹江老师。您殷殷关切我课题的每一次实验，从实验设计到 结果分析，无论我向您请教什么问题，您都耐心解答;于此同时，您又注重训练 我独立思考和解决问题的能力，以高标准要求我。生活中您平易近人，亦师亦友， 您的品格和对我的关怀我毕生难忘。我所取得的每一点成绩都凝聚着您的心血。 的学习，关心我的生活，为培养我交叉学科背景不遗余力。 感谢浙江大学药学院姚彤炜教授、蒋惠娣教授、余露山副教授、陈枢青教授、 陈静老师、刘瑶老师;邵逸夫医院张行老师、陈萍老师、王琦老师、林晓霞老师; SeattleChildren’S Jin Center张凡博士后、戴洁玉博士后、Hua Hospital&Regional SoundBlood Center的XiaoyunFu教授、王以博士后，感谢您们在 博士后;Puget 课题完成中给予的指导和帮助。 感谢一起在邵逸夫生物治疗重点实验室奋战的战友们;感谢浙江大学药学院 药物分析学各师兄师姐，同学和师弟妹们，由衷感谢你们对我的关心和帮助。 I 浙江人学博一J:学位论文 致谢 感谢我的亲朋好友，你们以最大的热情和宽容陪伴我，分享我的喜悦，倾听 我的烦恼，支持我，鼓励我，没有你们的一路支持，我的生活将失去色彩。 最后，衷心感谢我的父母，你们永远坚定地站在我身后，默默无私地奉献着 爱与宽容。你们是我最坚强的后盾，为我遮风挡雨，为我筑起缓解生存压力的减 震墙，让我尽情追寻梦想和信念，也永远张开双臂，告诉我家是我永远的港湾。 谨以此论文献给所有关怀、帮助、支持、鼓励我的亲人、师长、学友和朋友 们! 朱逢佳 2010年4月于紫金港 浙江大学博一I:学位论文 莉舌 前 言 随着人类基因组的实施和推进，生命科学研究进入了后基因组时代。而 蛋白质作为生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能 的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。传统的对蛋白质进行研 究的方式已无法满足后基因组时代的要求，蛋白质组学 Proteomics 便应运而生， 它是分子生物学的大规模筛选技术，以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为 研究对象，目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别 蛋白，最终阐明它们的关系与功能【l】。蛋白质组学研究的开展不仅是生命科学研究 进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 肿瘤的多药耐药现象已成为肿瘤化疗失败的主要原因之一。产生耐药的肿瘤 细胞逐渐对大量结构和功能截然不同的药物同时表现出耐受性的现象，即为多药 resistance，MDR 。药物耐受性作为一种临床表现，其机制研究已 耐药 multidrug 经历了许多年，并且一直是肿瘤基础和临床研究的热点之一。 然而，耐药机制的产生及发生作用是一个复杂的过程，近年来利用蛋白质组 学技术研究肿瘤耐药机制也越来越受到关注。但是，药物代谢酶对于肿瘤多药耐 药的影响却一直没有受到相应的重视。人细胞色素P450酶系作为人体内最重要的 3A4 负责内源及外源物代谢的酶类，一直受到了较大的关注。人细胞色素P450 CYP3A4 参与50,以上临床常用药物的代谢和诸多典型致癌物的活化。其活性 可以被许多物质所诱导或抑制，这使得临床上在药物合用时会产生毒副作用增加、 药效降低甚至无效的结果。因此，细胞色素P450酶系也已经成为了临床上指导个 体化给药，研究毒物暴露引起的疾病，以及遗传代谢相关疾病的生物标记物。 事实上，国内外对于K562阿霉素诱导多药耐药细胞的耐药机理的研究为空白。 因此，利用蛋白质组学研究手段进行MDR相关因素研究尤其是与药物代谢酶的关 系的探索，是一项具有重要理论意义和广阔前景的应用基础性工作。 III 浙江大学博上学位论文 前言 本课题正是基于以上推论，通过建立K562多药耐药细胞系，进行双向电泳发 现可能与药物代谢酶相关的蛋白，建立相应的稳定转染细胞株，考察蛋白对其多 药耐药特性的影响，并进一步探讨信号通路的调控，为补充阐明肿瘤多药耐药机 制和指导临床药物个体化给药提供依据。 IV 浙江人学博一 :学位论文 中文摘要 ANXAl在肿瘤细胞多药耐药和药物代谢酶 CYP3A4表达调控中的作用 浙江大学药学院: 药物分析学 2005级博士研究生:朱逢佳 导 师: 曾苏教 授 曹江副研究员 中文摘要 人细胞色素P4503A4 CYP3A4 参与50,以上临床常用药物的代谢和诸多 典型致癌物的活化。其活性可以被许多物质所诱导或抑制，这使得临床上在药物合 用时会产生毒副作用增加、药效降低甚至无效的结果。了解CYP3A4的调控将有 助于指导临床合理用药，为减轻或避免药物的毒副作用提供科学依据。本文采用建 立阿霉素体外逐步诱导的方式建立了多药耐药细胞K562细胞模型，蛋白质组学技 术手段寻找与耐药相关蛋白，研究其在肿瘤多药耐药中的贡献，及与CYP3A4之 间的关联，为理论及临床应用提供依据。 1(K562耐药细胞的建立及双向电泳法寻找分子靶点 采用建立阿霉素体外逐步诱导的方式建立了多药耐药细胞K562细胞模型， K562细胞与阿霉素ADR共存的初期，细胞总处于增殖死亡的动态过程中，直至 半年后，药物一直维持在1 mg,L浓度下，细胞的耐药特性趋于稳定。细胞的形态 转好，增殖周期加快，与母细胞无异。诱导的K562,ADR细胞与母细胞相比，不 但表现出对ADR高度耐受，而且有多药耐药现象，尤其是长春新碱 VCR 和伊马 V 浙江人学博:b学位论文 中文摘要 和63(3倍，提示所建的耐药细胞获得了多药耐药特性。 hr 应用高效液相色谱法测定耐药株细胞内阿霉素的积聚情况，结果显示，在2 的含量1(522 用，将阿霉素排出细胞。1 内的阿霉素积聚显著升高但不影响其生理活性，提示K562,ADR细胞内除了P(gP 药物外排泵还有其他耐药机制在发挥着作用。此外，由于阿霉素主要通过CYP3A4 果显示CYP3A4表达变化不是引起K562细胞多药耐药产生的原因。 为全面了解K562多药耐药产生的分子机制，利用蛋白质组学技术，用固相pH 梯度等电聚焦双向凝胶电泳，对所建立的以转运蛋白高表达为主要耐药机理的 K562,ADR细胞进行了研究，探讨细胞耐药后蛋白的变化，对只表达变化差异大的 白的身份，这些蛋白质表达情况的变化，是人白血病细胞K562从对药物敏感到接 触到化疗药物ADR后转运蛋白高表达，以至产生多药耐药特性这一变化中细胞内 一系列分子事件的直接体现，是转运蛋白及其表达调控的分子基础。这些蛋白根 据功能的不同总体可分为钙结合蛋白、分子伴侣 chaperones 、代谢酶相关蛋白、 蛋白合成或DNA合成相关蛋白等等。 2(ANXAI蛋白的调节对I 562细胞耐药行为的影响 blot与细胞免疫化学 为证实双向电泳结果的可靠及真实，进一步利用Western 62,ADR细胞中的表达差异。应 blot ，并稳定转染得到经western 之后以该细胞系完成了对ADR 表达上调的K562,ADR细胞对 工合成miRNA技术手段，构建 estem blot鉴定的下调 ANXAl 浙江人学博士学位论文 中文摘要 表达下调的K562细胞对ADR的耐受程度显著提高，而对VCR的耐受程度几乎和 ladder情况，结果显示ANXAl表达上调的转染细胞的细胞凋亡情况比对照细胞有 所增加，提示ANXAl通过介导K562细胞凋亡发挥作用。 3(乳腺癌MCF(7细胞中ANXAl和CYP3A4表达调控研究 本部分实验分析乳腺癌细胞MCF(7敏感细胞与耐药细胞ANXAl的表达情 况，与K562中ANXAl的表达情况相反，提示ANXAl在实体肿瘤细胞和血液系 存在信号通路调控通路。结合国内外文献检索报道结果，推测实体肿瘤MCF(7细 胞中，ANXAl表达通过IL(6调控下游CYP3A4行为，影响药物代谢情况，这也 可能是肿瘤产生多药耐药的原因之一。这些结果为将来进一步利用本实验中建立 的细胞体系对ANXAl和CYP3A4在肿瘤细胞多药耐药中的作用及表达调控研究、 指导临床用药及初期诊断提供依据。 4(胃癌ANXAl核定位与腹腔转移的研究 肿瘤多药耐药现象是临床肿瘤恶性行为之一。除了多药耐药现象外，肿瘤的 分化、浸润深度、淋巴结转移等也是肿瘤进程的重要指标。本文考察了浙江大学 附属邵逸夫医院肿瘤科收集的104对胃癌病人组织样本中ANXAl的表达与定位。 免疫组化结果显示，ANXAl在胃癌组织与正常组织中均表达。ANXAl同时存在 胞浆定位和核定位。分析ANXAl胞浆定位和核定位与临床病理参数的关系后显 示，ANXAl不仅与多药耐药的肿瘤临床恶性行为有关，ANXAl的核定位与肿瘤 大小、腹腔转移和TNM分期高度相关。ANXAl可作为胃癌独立预后指标指导临 床诊断与治疗。 关键词:细胞色素P450氧化还原酶，肿瘤多药耐药，蛋白质组学，核定位 VlI Abstract 浙江人学博上学位论文 EffectsofANXA1andCYP3A4ontumor multidrug ? l - ? ? l ??? l ? O ? resistanceanllrelative mecllanismsinvitro moaulatinR ofPharmarceutical College Sciences，ZhejiangUniversity: PharmaceuticalAnalysis 2005 Zhu Graduate student:Fengjia Su Supervisor:ProfZeng AssociateProf Cao Jiang Abstract CYP3A4isamemberofthe P450 of cytochromesuperfamilyenzymes(CYP3A4 isinvolvedinmorethan50,ofclinicalmetabolismandactivationof drug many Canbeinducedorinhibited substances( typicalcarcinogens(Itsactivity bymany ofthe ofCYP3A4will theclinicaluseof Understandingregulation helpguide drugs， to reduceoravoidthetoxicsideeffectsof this thesis， anadriamycin drugs(In K562,ADR human cellline wasestablished ADR -resistanterytholeukemia by selectioninvitro ADR(Proteomicswere to stepwise using techniquesapplied andtheirrelationofCYP3A4(Thesedatawill resistance-associated investigate protein bevaluableforfurtherofmechanismsofMDRand reveala new study may potential CYP3A4( functionof 1( Establishmentof human ADR 一resistant adriamycin celllineK562,ADRand ofK562 erytholeukemia proteomeprofiling andK562,ADRcellIines human celllineK562, ADRwas Adriamycin ADR -resistanterytholeukemia Abstract 浙江大学博上学位论文 established selectioninvitro ADR(Intheselection using bystepwise earlystage， the cellswereinthe anddeaths about6 proliferationdynamicprocess(Aftermonths，the at1 concentrationwasmaintained resistantcellswerestabilized( drug mg,L，thedrug Thecell tumed becamefaster:it’ snodifferentwith morphologybetter;theproliferation themothercellK562(Itwas thatK562,ADRshowedresistancenot to interesting only toother butalso chemicals，about adfiamycin resistanceto the cellline adriamycin，vincristin，andimatinib， respectively,thanparental K562( The accumulationresultsresultsdemonstratedthat Was adriamycin adfiamyein accumulatedinK562muchmorethanin 2hincubatedwith K562,ADR p 0(001 by 2(925 1(522 adfiamycin，aboutmmol,L??mg K562 andmmol,L??mg K562,ADR ， contributetothedecreaseofaccumulationof respectively,suggestingP―gPpumpmight ADRinK562,ADR(Butwhatismore Wasthatafter1 interesting week，drug Abstract 浙江大学博十学位论文 metabolic relatedto orDNA enzymes，proteinsproteinsynthesis synthesis，andproteins relatedto transduction( signal in 2(EffectofANXAl K562cellsonADRresistance regulation Thedifferential levelsof determined expression spots1 ANXA1 were by Westernblot andimmunochemical well-characterized staining(ANXA1，a analysis new memberofthecalcium??-and ofits phospholipid--bindingproteinfamily,because rolein ofcancerrevealed thatANXA1 apoptosis recently(Wereasonablyhypothesized acontributorto resistanceinK562,ADRcells(Forthe to be may multidrug purpose evaluatethis knockeddownANXAl hypothesis，we expressionusingANXAl-targeting artificialmiRNAinK562 theANXA1 cDNAinto cells，andmeanwhile，transfected toADRwas ANXA1 ablationinK562 K562,ADRcells(The decreased sensitivity by andviceversa(Thefunctionalvalidationshowedthatthe ANXA1 downregulated contributes to resistanceinK562, ADRcells(Ourstudies considerably expression drug roleforANXA1 in tothe oftumorcells an suggestimportant contributingresponses toward andrevealedmorecluestothe ofthemechanismsofMDR( chemotherapy study 3(StudiesonANXAlandCYP3A4 mechanism modulating While to K562,ADR,ANXA1 adriamycin，both 1 ANXA exposed upregulated were DNA K562,ADR K562,ADRcells observed cells and typicallypronounced theDNA inANXA1 transfectedK562, ADRcellswasmuch ladder,butfragmentation inK562,ADR that ANXA1 than cells，whichsuggested stronger upregulatedexpression inK562,ADRcellscouldresensitizethecellsto viaincreased adriamycin apoptosis( ANXA1 is inMCF一7,ADRcelllinesthanMCF一7 is higher cells，which expression mRNAand differentfrom cancercelllines(Both levelsof hematological protein ANXA CYP3A4inMCF-7andMCF一7,ADRshowedthere existsa 1，IL一6，and might CYP3A4inMCF一7 thereis amongANXAl，IL-6，and cells，while signalingpathway notinK562cells(The levelsofANXAl thedownstreamCYP3A4 expression regulated XI Abstract 浙江大学博上学位论文 alsobeoneofthecausesoftumor behavior,influencedmetabolism，whichmay drug resistance(Theresistantcellmodeestablishedinthe work multi??drug multi??drug present the befurther in studiesof CYP3A4 ANXAl，IL-6，and may applied signalingpathway, andalsocouldbeusedto clinicaluseof guide drugs( 4(NuclearlocalizationofANXAlcorrelateswithadvanceddisease and in with carcinoma dissemination peritoneal patientsgastric Atotalof104 resected adenocarcinomaand normal paired gastric corresponding werecollectedinthis ofANXA1 wasexamined specimens study(Expression by immunohistochemical andnuclearANXA1 levels staining(Bothcytoplasmic expression their wereassessed(ANXA1 and correlationwith clinicopathologicalparameters protein was in72of tissuesand47of expressionpositive 104 69(2, normal 104 45(2, was adenocarcinomatissues(ANXAl localizedinthe gastric stainingpredominantly inall72ANXA normal 12ANXA specimens，while1-positive cytoplasm 1-positive nuclear adenocarcinomashowed gastric specimenspositive staining(Thepositive nuclear correlatedwellwithserosal disseminationand staining invasion，peritoneal TNM with nuclear more stage(Casespositive stainingpresentedperitoneal thosewith nuclear dissemination 41(7,，5,1 2 than negative staining 8(7,，8,92; P modelrevealedthat ANXA1 nuclear had O(007 (Alogisticregression positive staining an associationwith ratio， independent peritoneal 59-77(81 resultsindicatedthatANXAlis 9(499;95,confidenceinterval，1(1 5 (These in both adenocarcinomaandnormaltissues(In expressed gastric gastric adenocarcinomatissuesANXA1 is bothin andnucleusandits expressed cytoplasm nuclearlocalizationcorrelateswithadvanceddisease and stage peritoneal dissemination( P450 enzymes，tumor Keywords:humancytochrome multi-drug nuclearlocalization XII 缩略词 浙江大学博十学位论文 缩略词 氨苄青霉素 Amp Ampicillin 碱基对 bp Basepair BSABovineserumalbumin 牛血清白蛋白 cDNA acid互补脱氧核糖核酸 deoxyribonucleic Complementary P450 CYP 细胞色素P450酶 Cytochrome DMSO sulfoxide 二甲基亚砜 Dimethyl DNA acid 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic dNTPFour 四种脱氧核糖三磷酸 deoxynucleotidetriphosphates EB Ethidiumbromide 溴化乙锭 Escherichiacoli E(Coli 大肠杆菌 serum FBS Fetalbovine 胎牛血清 LB Luria(Bertani LB培养基 lethalconcentration LC50Median 半数致死浓度 MTT 3( 4，5(dimethylthiaz01(2(y0(5(3一 4，5-二甲基噻唑 -2一烃基 3-carboxymethoxyphenyl 一2一一5- 3一羧基甲氧基尿苷 一2一 4-磺苯基 一2氢一四唑盐 4-sulfophenyl 一2H―tetrazolium OD 光密度 OpticalDensity PBS bufferedsaline 磷酸盐缓冲液 Phosphate PCR chainreaction 聚合酶链式反应 Polymerase RT-PCRReverse 逆转录一聚合酶链式反应 transcription―polymerase ChainReaction RNARibonucleicacid 核糖核酸 RNase Ribonuclease 核糖核酸酶 XIII 缩略词 浙江大学博一f:学位论文 revolutionsminute rpm 每分钟转速 per SDS-??PAGESodium sulfate-?? 十二烷基磺酸钠(聚丙 烯酰胺 dodecyl 凝胶电泳 olyacrylamidegel edlmalyrcaylop―lh ortceleelectrophoresl‘s TAE "Iris-acetate,EDTA Buffer "Iris。乙酸,EDTA电泳缓冲液 electrophoresis 碱S 三羟甲基氨基甲烷 Tris hydroxymethyl aminomethane XlV 浙江大学博士学位论文 目次 目 次 致 谢…………………………………………………………………………………………………………………((I 前 言……………………………………………………………………………………III 摘 要……………………………………………………………………………………(v 缩略 语………………………………………………………………………………((XIII 目次 1(绪 论……………………………………………………………………………………………………………((1 1(1 肿瘤多药耐药现 象……………………………………………………………l 1(2 CYP3A4基因调 控……………………………………………………………l 1(3 ANXAl蛋白………………………………………………………………………………………((3 1(4 ANXAl在CYP3A4表达调控中作用的假说………………………………6 1(5本实验研究内 容…………………………………………………………………8 2(K562耐药细胞的建立及双向电泳法寻找分子靶 点………………………………(9 2(1 实验仪器及材 料……………………………………………………………((10 2(2实验方 法………………………………………………………………………16 2(3 实验结 果……………………………………………………………………((24 2(4 寸论……………………………………………………………………………………………………35 2(5本章小 结……………………………………………………………………((37 3(ANXAl蛋白的调节对K562细胞耐药行为的影 响……………………………((38 3(1 实验仪器及材 料……………………………………………………………((38 3(2 实验方 法………………………………………………………………………43 3(3 实验结 果………………………………………………………………………53 3(4讨论……………………………………………………………………………………………………60 3(5本章小 结……………………………………………………………………((61 浙江入学博十学位论文 目次 4(ANXAl在CYP3A4表达调控中的作 用…………………………………………(62 4(1 实验仪器及材 料………………………………………………………………62 4(2实验方 法………………………………………………………………………63 4(3实验结 果………………………………………………………………………65 4(4讨论……………………………………………………………………………………………………(68 4(5本章小 结………………………………………………………………………70 5(ANXAl在胃癌组织中核定位研 究………………………………………………。7l 5(1 实验材料及试 剂………………………………………………………………7l 5(2实验方 法………………………………………………………………………72 5(3实验结 果…………………………………………………………………………73 5(4讨论……………………………………………………………………………………………………(76 5(5本章小 结………………………………………………………………………77 6(结论与展 望…………………………………………………………………………78 参考文 献………………………………………………………………………………81 文献综 述…………………………………………………………………………………91 作者简历及在读期间所取得的科研成 果……………………………………………99 1(绪论 浙江人学博上学位论文 ANXAl在肿瘤细胞多药耐药和药物代谢酶 CYP3A4表达调控中的作用 浙江大学药学院: 药物分析学 2005级博士研究生:朱逢佳 导 师: 曾苏教 授 曹江副研究员 1(绪论 1(1肿瘤多药耐药现象 肿瘤的多药耐药现象已成为肿瘤化疗失败的主要原因之一。产生耐药的肿瘤 细胞逐渐对大量结构和作用机理截然不同的药物同时表现出耐受性的现象，即为 resistance，MDR 。药物耐受性作为一种临床表现，其机制研 多药耐药 multidmg 究已经历了许多年，并且一直是肿瘤基础和临床研究的热点之一。经过多年研究 而逐渐为人们所了解的机制主要有n一1:药物摄取的减少和能量依赖性转运蛋白质 对药物的外排作用的增强、药物代谢行为的改变、抗凋亡机制的上调等等。 但越来越多的研究证明，产生肿瘤多药耐药的因素不是单一的，根据肿瘤细 胞种类的不同，起主要耐药作用的因素也不同;即使在同一肿瘤细胞中，也往往 是多种因素同时发挥作用。全面认识及阐明肿瘤多药耐药机理具有十分重要的理 论和临床意义。 浙江人学博’ 学位论文 1(绪论 1(2 CYP3A4基因调控 3A4 CYP3A4 参与50,以上临床常用药物的代谢和诸多 人细胞色素P450 典型致癌物的活化。其活性可以被许多物质所诱导或抑制，这使得临床上在药物合 用时会产生毒副作用增加、药效降低甚至无效的结果。转录因子和与核受体相互 作用的多种启动子、增强子调控着CYP3A4的表达。了解CYP3A4的表达调控将 有助于指导临床合理用药，为减轻或避免药物的毒副作用提供科学依。 多数临床常用药物和甾体类激素，如利福平、地塞米松、克霉唑、苯巴比妥和 X 磺吡酮对CYP3A4的诱导，主要通过孕烷X受体 pregnanereceptor，PXR 【51， androstane 组成性雄甾烷受体 constitutive receptor，CAR 【6，7】，维生素D受体 D 01， vitaminreceptor，VDR tS,9】，仪(糖皮质激素受体 glucocorticoidrecptor t，GRot t1 nuclear 肝细胞核因子4仅 hepatocyte retinoidX 31。 已被发现与CAR，PXR和HNF4tx有关【10'1 1(2(1 PXR在CYP3A4调控机制中的作用 代谢的其他药物的治疗效果。此外，PXR通过调控尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶、醛 脱氢酶、磺胺转移酶、谷胱甘肽(s(转移酶和多种转运蛋白质的基因 如多药耐药 蛋白(1、有机阴离子转运多肽 ，对药物代谢产生影响。国内外对PXR等核受体调 控CYP3A4的机理以及对CYP3A4基因启动子激活的核受体研究，揭示了一些功 能性顺势作用反应元件 cis(actingresponse 体编码一个被六个核苷酸 ER6 分割的反转重复序列，后来被认为是PXR结合 之间的一个外源反应增强单元为功能性DR3核受体结合部位 dNRl 。DR3和 浙江大学博L(学位论文 i(绪论 导中，DR3和prER6之间的交互作用也有重要影响【6，171。 1(2(2 CAR对CYP3A4转录调控的作用 组成性雄烷受体CAR，属于核受体NRII家族，其经典的作用是形成CAR(RXR 用，诱导CYP2B的转录表达【l91。但在CYP3A4的转录调控中，CAR也发挥了一 DR3序列，启动其转录。进一步的研究发现，CAR可以与CYP3A4SXR,PXR反 胞进行遗传学处理改变，使其稳定表达CAR后，CYP3A4的表达增加。PXR和 CAR之间具有一定的交互作用。 1(2(3 vDR的作用 VDR(RXR二聚体后与靶基因启动子区域结合，启动靶基因的转录，明显提高下游 靶基因CYP3A4在肠道的mRNA含量、蛋白水平，以及其代谢咪达唑仑的能力。 介导的转运激活中的角色和协调作用尚不清楚，最近发现的eNR3A4和 里CYP3A4的mRNA水平，在转录及转录后水平上调控CYP3A4的表达。 1(3 ANXAI蛋白 膜联蛋白(1 ANXAl 是膜联蛋白超家族中第一个被发现的成员。从 70年代以来的研究发现，ANXAl与抗炎症反应、细胞分化和增殖、细胞死 1(绪论 浙江大学博l:学位论文 调控、凋亡细胞吞噬清除等许多细胞生命活动有密切关系。 人膜联蛋白超家族由13个生物学上和结构上高度相似 40,(60, 的钙依赖 的磷脂结合蛋白组成。它们具有保守的中心结构域和特异的N端序列。中心 结构域 由4个同源重复序列 Annexin repeats 组成，每个Annexin repeat眭,70个氨基酸残 基组成，以钙离子依赖的方式可逆地和细胞膜磷脂结合。N端序列及长度在不同的 膜联蛋白中各不相同，主要起到调节膜联蛋白与蛋白配体的相互作用和调控膜联 酸可以和S100家族蛋白相互作用【24】。尽管这一区域长期以来一直被认为是单独的 折叠实体，但最近的晶体结构分析表明，ANXAlN端也可以部分地整合进入中心 结构域，在与Ca2+ 或膜 结合的状态下，N端区域暴露出来，使得该区域能 够发 可以重新分布。比如，地塞米松和IL(6可以诱导ANXAl从胞浆重定位至胞膜【2q; factor，EGF 、氧化条件或热休克诱导下， 而在表皮生长因子 epidermalgrowth 13(acetate，PMA ANXAl还能进核【271。豆蔻酰佛波醇乙酯 phorbol12一myristate 浙江人学博I’学位论文 1(绪论 3 ( ”+ I丽蕊2蒜列4 l夏犁1 ，辫热镇痛作用囊 耐囊耐富富 ,"唑帕。妇 口 f P ? - , 。G噍住‘ 一疆 r卫 ? 今 ? 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