人巨细胞病毒蚀斑实验条件的优化及在抗病毒物质活性测定中的应用

人巨细胞病毒蚀斑实验条件的优化及在抗病毒物质活性测定中的应用 张俊玲 ,王明丽 ( ) 摘要 目的 探讨人巨细胞病毒 HCMV 的蚀斑形成实验 负担 ,而且严重影响了下一代的健康和国民素质 ,不 最适工作条件 ,建立稳定易行的 HCMV 蚀斑技术 ,用于 HC2 利于国家优生优育政策的落实 。随着人们对 HCMV MV 的定量测定及体外抗病毒物质活性测定的研究 。致病机制的认识不断加深 ,促进了对 HCMV 感染性 ( )HCMV 病毒悬液接种至人胚成纤维细胞 H F单层 , 37 ?吸 疾病的诊断 、治疗 、预防的研究 ,其中抗病毒药物和 附 1 h, 分 别 用 含 01463 ‰、01925 ‰ N aHCO及 015% 、1 % 3 疫苗的研发受到广泛重视 ,而这些抗病毒物质的开 DM SO 琼脂糖覆盖 , 1周后加盖第 2 层 ; 2 周后用 015%结晶 紫染色 5 m in,计数 、计算 p fu /m l,采用 PCR 法对蚀斑培养物 发及效果都需对 HCMV 进行定量测定 。蚀斑 进行鉴定 ;分别用患者血清 及 HCMV AD169 株兔免疫血清 形成实验作为病毒定量的金标准 ,还广泛地应用于 进行蚀斑抑制实验 ,计算中和抗体滴度 ; 蚀斑减少实验测定 鉴定病毒及测定病毒活性和筛 选变 异 株等 病毒 研 ( ) 不同浓度更昔洛韦 GCV 的抗 HCMV 活性 。结果 HCMV 究 ,但该技术本身要求较高 ,方法较为繁琐 ,特别是 对照孔在 5 d 出斑 ,蚀斑为圆形 、实心 、不透明状 ; 两种浓度 N aHCO对蚀斑形成数量 、大小有明显影响且病毒滴度差异 出斑时间的掌握较 难 , 从而 影响 其 使用 ; 而 且由 于3 ( ) 有显著性 P < 0105 。在含 01463 ‰ N aHCO培养 孔内 , 出 3 ( ) HCMV 在体外人胚胎成纤维细胞 H F上增殖缓慢 ,斑时间提前至 3 d;但不同浓度的 DM SO 对蚀斑数量 、大小以 子代病毒多数在感染后 4,6 d时才大量增殖 ,上清 ( ) 及病毒滴度的影响 差异无显著性 P > 0105 。 HCMV 患者 中病毒数量有限 ,又具有不稳定性 ,易被理化因素灭 血清及 HCMV AD169株兔免疫血清均可以抑制蚀斑 形成 。 利用蚀斑减少实验测定 GCV 抗 HCMV 活性 ,可在 7 d 内获 活 ,这些又给该病毒定量研究增加难度 ,使得 HCMV 得结果 。结论 HCMV 蚀斑形成实验条件经优化后 ,可以方 蚀斑形成 实 验 操 作 难 以 掌 握 。现 以 H F 细 胞 进 行便稳定地对 HCMV 进行定量测定以及抗病毒活性物质的筛 HCMV 蚀斑形成及蚀斑抑制实验 ,探讨蚀斑形成的选和评价 。 影响因素 ,通过实验改变覆盖层中 N aHCO 浓度加 3 主题词 巨细胞病毒 /分离和提纯 速蚀 斑 形 成 , 建 立 稳 定 易 行 的 HCMV 蚀 斑 滴 定 技 自由词 蚀斑实验 ;蚀斑抑制实验 术 ,摸索最佳出斑时间为 3 d,测定时间缩短为 7 d, 中图分类号 R 37319; R 446 能在较短的时间内对体外药物的抗病毒活性进行筛 ( ) 文献标识码 A 文章编号 1000 - 1492 200705 - 0485 - 05 选和评价 。 1 材料与方法 1. 1 病毒 HCMV AD 169株由原上海医科大学微 ( )人巨细胞病毒 hum an cytom ega loviru s, HCMV , HCMV 毒株复苏后接种 H F 单生物学教研室提供 在人群中感染非常普遍 ,在发达国家和发展中国家 [ 1 ] 层细胞 ,经连续传代 3次 ,使病毒毒力达到感染 24 h感染率分别为 60 %和 90 % ,且绝大多数以先天性 后出现明显广泛病变 ,继续培养 4 ,6 d后 ,反复吹打 感染和潜伏感染为主 ; HCMV 先天性感染可以导致 使病毒释放 , 4 ? 3 000 r /m in 离心 10 m in,取上清 胎儿畸形 、智力低下和发育迟缓等严重后果 ,而潜伏 备用 。感染在免疫功能不全或低下的个体则会引起较高的 [ 2 - 3 ] 1. 2 细胞 H F细胞 ,按常规方法由本室制备 ,本研 发病率和致死率 ,不仅造成家庭与社会的沉重 究所用 H F细胞均为 6,8代之间 。 1. 3 主要试剂 DM EM 购自 Gibco 公司 ,琼脂糖购 2007 - 10 - 18 接收 ()自 O xo id公司 ,二甲基亚砜 DM SO 购自 Am re sco公 () 基金项目 :教育部科学技术研究重点项目 编号 : 01052 ; 安徽省“十 ) ( ( (司 , M TT 噻唑蓝 Sigm a购自公司 ,更昔洛韦 Ganc i2)五 ”生物医药重大科技专项 编号 : 01303003 作者单位 :安徽医科大学微生物学教研室 ,合肥 230032) c lovir, GCV 来 自 广 东 阳 江 制 药 厂 有 限 公 司 , 250 作者简介 :张俊玲 ,男 ,硕士研究生 ;m g /支 ,批 号 为 0605024 , 细 胞 培 养 板 购 自 gre ine r 王明丽 ,女 ,教授 ,硕士生导师 , 责任作者 , E2m a il: wangm lli b io2one公司 ;主要化学和分子生物学试剂分别购自@m a il. hf. ah. cn Sigm a公司 、P rom ega 公 司 、华美 生物 工 程公 司和 晶 美生物有限公司 。 HCMV UL83 基因 PCR 引物37 ?吸附 1 h后 ,吸去感染液 , PB S洗涤 1 次 ,用琼 序列 设 计 如 下 : 上 游 : 5 ′2GA GGACCTGACGA TGAC2脂覆盖 。观察 、计数等步骤同蚀斑形成实验 。以能 CCG23 ′,下游 : 5 ′2TCTGACCCTGAACCGTA GCC 23 ′;引 够完全抑制蚀斑形成时的血清最高稀释度作为蚀斑 物分别位于 HCMV UL83 基因的第 754 ,773 bp 和 中和抗体滴度 。 1 500,1 519 bp处 ,产物长度为 766 bp ,由上海生物1. 7 HCM V阳性蚀斑培养物 PC R 扩增鉴定 挑 工程公司合成 。取单 个 蚀 斑 接 种 H F 单 层 细 胞 , 次 日 予 以 更 换免 疫 血 清1. 4 HCMV、水 痘 - 带 状 疱 疹 病 毒 DM EM 维持液 , 37 ?培养观察 ,待出现细胞病变 7 , () ( ) 8 时 ,收获病毒感染细胞于 Epp endo rf管中 ,常规蛋 V ZV 、单纯 疱 疹病 毒 ?、?型 H SV 21、H SV 22 阳 ( ) 性血清系 本室 制 备并 鉴定 , 分 别 为 HCMV CH S、白酶 K2酚氯仿法抽提 DNA , 进行 PCR 扩增 。取各 μμ() ( ) ( ) V ZV VH S、H SV 21 HH S1 、H SV 22 HH S2 抗体阳 样本模 板 3 l于 Epp endo rf 管 中 , 分 别 加 2115 l μ性的患者血清 ,皆为相应病毒特异性阳性血清 ;正常 PCR 反应混合物 , 015 l Taq 酶混匀 ,然后加 1滴石 ( ) 蜡油 ,瞬时离心 , 95 ?预变性 5 m in后 ,按以下参数 人血 清 NH S 由 本 室 鉴 定 HCMV、V ZV、H SV 21、 H SV 22 均 为 阴 性 的 人 血 清 ; HCMV 兔 免 疫 血 清扩增 35 个 循 环 : 95 ? 1 m in、57 ? 45 s、72 ? 1 ( ) ( ) CR S、正常兔 免 疫 血 清 NR S为 本 室 制 备 ; 血 清m in,最后 72 ?延伸 10 m in。 PCR 产物经 115 %琼脂 1 ?2 稀释后 ,臵56 ?水浴灭糖凝胶电泳检测 ,在 766 bp 处出现特异性核酸扩增 - 20 ?保存 ,使用前 活 30 m in。条带者为阳性 ,反之为阴性 。正常细胞对照 、病毒对 1. 5 蚀斑形成实验照分别作为阴 、阳性对照 。 1. 5. 1 H F细胞单层的制备H F 单层细胞经胰酶1. 8 GC V的抗 HCM V活性实验 9 消化后 ,吹 打 均 匀 , 制 成 1 ×10/L 细 胞 悬 液 , 加 入 1. 8. 1 GCV 细胞毒性实验 在 96 孔板上 ,加 1 × 9 12孔细胞培养板 ,每孔 1 m l, 24 h后长成单层备用 。10/L 浓度的 H F细胞 ,每孔 011 m l,培养 24 h后生 ( 1. 5. 2 稀释病毒 在冰盘上用 DM EM 维持液 含长成单 层 , 弃 培 养 液 , 分 别 加 含 不 同 浓 度 的 GCV ) 3 %小牛血清 、1 %青霉素和链霉素 将病 毒 悬液 进DM EM 维持液 ,每孔 011 m l。 GCV 浓度分别为 10、 - 1 - 2- 9 行 10倍递增稀释 ,即稀释为 10 、10 10 。 5、215、1125、01625、01313、01156、01078 g /L , 每 个 8孔 ,同时设不加药物的正常细胞对照孔 。浓度重复 1. 5. 3 覆盖层制备 覆盖层的基本组分为 :用等量 含有 1 %双抗 、6 %小牛血清的双倍 DM EM 与 115 %37 ?培养 72 h后 ,每孔加入 5 g /L 的 M TT溶液 10 μ 琼脂糖混匀 , 50 ?保温备用 ; 实验前分别临时添加l,臵 37 ?孵育 4 h,弃培养液上清 ,加入 DM SO ,每 ( ) μDM SO 孔 100 l,混匀 10 m in,臵酶标仪上于 490 nm 波长 不 同 浓 度 N aHCO01463 ‰、01925 ‰或 3 ( ) 015 % 、1 % 。下测定 OD 值 。计算细胞存活率 , 得出 GCV 对 H F ( ) ( ) H F 细1. 5. 4 病毒接种与观察 弃去培养板孔内细胞的最 大 无毒 浓度 TD。细 胞 存 活 率 % = 0 () 实验孔 OD 值 /对照孔 OD 值 ×100 % 。 胞培养液 ,加入经稀释的病毒 ,每孔 012 m l, 37 ?吸 ) ( 附 1 h 每 15 m in轻轻摇动 1 次 ,吸去感染液 , PB S1. 8. 2 GCV 对 HCMV 增殖抑制实验 按常规培养 洗涤 1次 ,然后加上述琼脂糖覆盖层 ,每孔 1 m l,同 细胞 , 24 h 长成 单 层后 弃培 养 液 , 接 种 100 p fu /m l 时设未加病毒的细胞对照组 ; 培养 7 d 后 ,再覆盖第 的 HCMV , 每 孔 012 m l, 37 ?吸附 1 h, 弃感 染 液 , (二层 ,继续培养 7 d,加入 015 %结晶紫染液 2 m l 含 洗涤 1次 ;将 GCV 从 TD稀释为 215、2、115、1、 PB S0 ) 10 %甲醛 ,染色 5 m in。每日镜下观察并记录蚀斑 015、011 g /L 6 个 浓 度 , 分 别 与 含 01463 ‰N aHCO 3 形成时间 、形态大小和数量 。染色后计算蚀斑滴度 。 的覆盖层混匀 ,加入病毒吸附的细胞板 ,每孔 2 m l; ( ) (蚀斑形成单位 p fu /m l= 每孔平均蚀斑数 ×病毒 每个浓度 重 复 4 孔 , 同 时 设 不 含 药 物 的 病 毒 对 照 [ 4 ] ) 稀释倍数 /每孔接种病毒量 ,病毒滴度以 L g p fu /m l 孔 ,每日镜下观察 ,计数蚀斑步骤同前 ,计算蚀斑 ( ) (示 。 减少率 。蚀斑减少率 % = 病毒对照组蚀斑数 - ) 1. 6 蚀斑形成抑制实验 采用固定病毒稀释血清 药物处理组蚀斑数 /病毒对照组蚀斑数 ×100 % 。 的方法 ;将 1 ?2 稀释的血清进行两倍系列稀释后与 1. 9 统计学处理 根据实验结果计算蚀斑形成单 ( ) (固定量的病毒 100 p fu /m l等量混合 病毒对照用 位 、细胞存活率 、蚀斑减少率 ,采用配对资料 t检验 , ) 维持液代替血清 , 37 ?作用 1 h,然后接种至相应 方差分析 ,通过 SPSS 1310 软件将药物浓度与蚀斑 α 细胞培 养 板孔 中的 单 层 H F 细 胞 上 , 每 孔 012 m l, 减少率进行 = 0105水准的直线关系的检验 。 () () 图 1 HCM V形成的蚀斑 A:覆盖琼脂糖营养层的正常 H F 细胞 未染色 ×100; B: HCMV 在 H F 细胞上形成的蚀斑 未染色 ×100; C: HC2 () MV 在 H F细胞上形成的蚀斑 结晶紫染色 ?×100 2. 3 不同浓度 DM SO 对 HCM V 蚀斑形成的影响2 结果 不同浓度 DM SO 对 HCMV 蚀斑形成与对照组相 株 的 蚀 斑 形 成 特 征HCM V AD 169 2. 1 HCMV 比 ,蚀斑的大小 、形态无明显区别 ,出斑时间相似 ;病 ( )( ) AD169株的蚀斑形成与细胞病变效应 CPE出现的 毒滴度差异无显著性 F = 01795, P > 0105 。结果 时间相一致 。 HCMV AD 169 株一般在 5 d 内出斑 , 见表 2。 蚀斑为圆形 、实心 、不透明 ,细胞内颗粒增多 ; 015 % 表 2 不同浓度 DM SO 对 HCM V蚀斑形成的影响 结晶紫染色后 ,在细胞单层上呈圆形的空心斑块 ,界 ()滴度 L g p fu /m l 限明显 ,周围细胞染色加深 ,蚀斑在培养 10 d 后 ,再 实验次数 1 % DM SO 015 % DM SO 正常对照 () 随时间延长蚀斑易相互融合形成融合斑 图 1 。1 5. 84 6. 04 5. 89 2. 2 不同浓度 Na HCO对 HCM V 蚀斑形成的影 3 2 5. 76 5. 88 5. 76 3 5. 90 5. 72 5. 66 响 观察 覆 盖层 中不 同 浓度 N aHCO对 HCMV 蚀 3 4 5. 79 5. 93 5. 83 斑形成的影响时发现 ,低浓度的 N aHCO对 HCMV 3 5 5. 85 5. 99 5. 95 蚀斑形成有促进作用 ,除蚀斑形成的数量增加外 ,出 6 5. 68 5. 85 6. 01 斑时间亦提前 2 ,3 d,设臵的病毒对照组为 5 d 出 F = 01795, P > 0105 斑 ,而实验组则 3 d即可观察到 ; 同时蚀斑直径也增 () 加 ,使蚀斑变大 ,更易于观察计数 图 2 。且两者病 2. 4 抗血清蚀斑形成抑制实验 7 份已知阳性血 ( ) 毒滴度差异有显著性 t = 311779, P < 0105 ,结果见 清对 HCMV AD169 株的蚀斑形成抑制实验结果见 表 1。 表 3。 表 3 抗血清蚀斑形成抑制实验结果 ()抗免疫 不同稀释度血清中和蚀斑后产生的蚀斑数 斑 /孔 1 ?4 1 ?10 1 ?20 1 ?40 血清种类 CH S 0 0 2 7 NH S 8 12 15 20 VH S 6 9 13 18 HH S1 8 11 13 21 图 2 覆盖不同浓度 Na HCO 形成的蚀斑 3 7 11 14 17 HH S2 () A:覆盖 01463 ‰N aHCO形 成的蚀 斑 未染色 ×100; B: 覆盖 3 CR S 0 3 8 13 () 01925 ‰N aHCO形成的蚀斑 未染色 ?×100 3 NR S 5 10 12 19 表 1 不同浓度 Na HCO 对 HCM V蚀斑形成的影响 3 ()实验 滴度 L g p fu /m l 从表 3可见 ,以完全抑制蚀斑形成时的血清最 0. 463 ‰N aHCO0. 925 ‰N aHCO 次数33 高稀 释 度 作 为 蚀 斑 中 和 抗 体 滴 度 。 VH S、HH S1、1 6. 57 5. 91 2 6. 28 5. 74 HH S2、NH S、NR S对 HCMV AD 169株均未见蚀斑抑 3 6. 21 5. 63 制现象 ; 而 CH S、CR S均能抑制 HCMV AD 169株产 4 6. 49 5. 85 生的蚀斑 ,但两者中和抗体滴度不同 ,前者为 1 ?10 , 5 6. 47 5. 83 6 6. 36 5. 78 后者为 1 ?4 ,即 CH S稀释至 1 ?10时可以完全抑制 t = 311779, P < 0105 HCMV 蚀斑形成 , CR S稀释至 1 ?4时能够完全抑制 HCMV 蚀斑形成 。,在一定药物浓度范围内 ,随药物浓从图中可见 2. 5 HCM V阳性蚀斑纯培养物 PC R 扩增鉴定 挑度降低 ,病毒形成蚀斑减少率下降 ,呈现一定的量效 取单个蚀斑进行培养后 ,收获病毒感染细胞悬液 进关系 ;说明药物浓度越大 ,抑制病毒增殖能力越强 , 行 PCR 扩增 , 同时设臵 HCMV AD169 株 病毒 培 养蚀斑减少率亦越高 。经直线回归分析 ,药物浓度与 ( 物为阳性对照 ,正常 H F 细胞为阴性对照 。在紫 病毒 蚀 斑 减 少 率 存 在 直 线 关 系 t = 201764 , P < ) 外灯下可见与阳性对照相同的特异性核酸条带 ,大 0105 ,且用低浓度 N aHCO作为覆盖层时出斑时间 3 ( ) () 更早 3 d,蚀斑减少实验测定时间可缩短至 7 d。 小约为 766 bp ,阴性对照无条带 图 3 。 3 讨论 ()N aHCO作为目前商品化细胞培养基 DM EM 3 的常规添加成分 ,广泛的用于细胞培养中 ,而 DM SO 是一种渗透性保护剂 ,常用于细胞 、毒株等的冻存保 [ 5 - 6 ] 护 ;据文献报道 , N aHCO 和 DM SO 对 HCMV 蚀 3 斑形成有促进作用 。实验 表明 , 低 浓度 的 N aHCO 3对蚀斑形成具有明显的促进作用 ,可使蚀斑数量增 加 ,直径变大 ,本次实验结果与文献中采用甲基纤维 素为覆盖层报道一致 ; 而 DM SO 对蚀斑形成的作用不明显 ,与对照组相比 ,蚀斑的数量 、大小及出斑时 间差异不明显 , 与文献报道 不相 符 。N aHCO影 响 3 图 3 HCM V 阳性蚀斑培养后 PC R扩增鉴定 HCMV 在 H F细胞中增殖的作用机制还不很清楚 , 1: M a rke r; 2: HCMV UL83 阴性对照 ; 3: HCMV UL83 阳性对照 ;() 可能是由于宿主细胞在其直接或间接 改变 pH 值 4: HCMV 阳性蚀斑培养后 PCR 扩增产物 作用下生理状况发生改变 ,一些细胞生物大分子的 合成代谢发生变化 ,从而刺激 HCMV DNA 的合成 , 2. 6 GC V对细胞毒性实验 经检测 ,当 GCV 终浓 加速病毒的增殖 ;但是文献同时报道了增加培养液 度为 215 g /L 时 ,细胞形态正常 ,生长良好 ;培养 3 d 中的 N aHCO浓度却不能影响病毒的增殖 ,确切机 3 后经 M TT法检测 , 其 OD 值与正常细胞对照组 OD 制有待继续探讨 。 值最接近 。当超过该浓度时 ,细胞出现肿胀 、坏死 、 测定病毒感染性的大小可通过病毒计数方法来脱落等细胞毒性反应 ,由此确定该浓度为细胞的最 判断 。在电子显微镜下直接观察计数 ,由于仅能检 大耐受浓度 。 测病毒颗粒数目 ,不能区分感染性病毒颗粒和非感 GC V对 HCM V增殖抑制实验 结果见图 4。2. 7 染性病毒颗粒 ,也无法判断病毒的感染力 ,因此该法 ( ) 不常用 ;组织细胞培养半数感染剂量法 TC ID常 50 用于病毒感染性的测定 ,判断以感染的细胞病变不 再进展为终点 。对于 HCMV 而言 ,观察周期长达 2 () ,4 周 ,且在实验过程中会受到缺损干扰颗粒 D IP 等因素影响 ,大大影响其准确性 ;而蚀斑形成实验比TC ID终点法更加精确 , 每个蚀斑是由一个感染性 50 病毒颗粒在单层细胞上增殖后形成 ,是最完善 、定量 最准确的病毒学常用鉴定方法 ,并还可以用于克隆病毒的个别遗传变异株 。 蚀斑抑制实验常用于病 毒的鉴定及中和抗体测 定 ,主要用于疫苗制备的效力检测和评估药物体外抗病毒效果 ;目前蚀斑抑制实验的判断标准不一 ,通 常以可以抑制对照组蚀斑数的 50 %以上作为判断 图 4 GC V对 HCM V蚀斑形成减少实验结果 阳性的标准 ,并以此时抗体的最高稀释度作为蚀斑 [ 1 ] Pass R F, Fow le r K B , Bopp ana S B. Congen tial cytom ega loviru s N aHCO在促进 HCMV 蚀斑形成 ,加快出斑时间的 3 infec tion fo llow ing first trim e ste r m ate rna l infection: Symp tom s a t 同时没有改变病毒本身的生物学性状 , HCMV 的蚀 ( ) b irth and ou tcom e [ J ]. C lin V iro l , 2005 , 11 6 : 215 - 7. 斑仍具有特异性 。 [ 2 ] Lom ba rd i G, Stronati M. Congen tia l cytom ega loviru s infec tion [ J ]. 在进行药物体外抗病毒研究过程中 ,最为常用 ( ) M ine rva Ped ia tr, 2005 , 57 3 : 213 - 27. 的方法是 CPE 法 ,但此法主观性强 , 受病毒感染细 [ 3 ] Swee t C. The p a thogen ic ity of cytom egaloviru s[ J ]. FEM S M ic ro2 ( ) b io l R ev, 1999 , 23 4 : 457 - 82. 胞的 CPE类型影响较大 ,且不能进行精确的定量分 Gillian M. Sco tt, A d riana W e inbe rg, W illiam D. R aw lin son, et a l. [ 4 ] 析 ; M TT法是一种广泛用于药物抗病毒活性的评价 M u ltid rug re sistance confe rred by nove l DNA Po lym era se m u tation s 研究 ,该法 简 便 、直 观 , 但 同 样 需 要 与 CPE 法 相 结 in hum an cytom ega loviru se iso la te s [ J ]. A n tim ic rob A gen ts Che2 合 ,通 过 观 察 CPE 来 确 定 M TT 测 定 的 最 适 时 间 。 ( ) mo the r, 2007 , 51 1 : 89 - 94. 而蚀斑实验作为病毒学研究中经典指标 ,可以准确 V a lyi2N agy T, B and i Z, Bo ldogh I, et a l . H yd ro lysis of ino sito l [ 5 ] lip id s: an ea rly signal of hum an cytom egaloviru s infection [ J ]. 测定有感染性病毒的数量 ,更精确反映药物抗病毒 ( ) A rch V iro l, 1988 , 101 3 24 : 199 - 207. 的活性 ,且取得的数据客观可靠 。 Sadana ri H , Yam ada R , Yam ago sh i T, et a l. The m a jo r imm ed i2 [ 6 ] 该研究探讨了影响 HCMV 蚀斑形成的因素 ,经 a te2ea rly gene s of hum an cytom ega loviru s induce two nove l p ro te in s 反复实验 证 明 改 变 覆 盖 层 中 N aHCO浓 度 可 使 得 3 w ith mo lecu la r we igh ts of 91 nd 102 k iloda lton s[ J ]. A rch V iro l, HCMV 的定量研究稳定 、可靠且易行 ,利用该技术可 ( ) 2000 , 145 6 : 1257 - 66. 根据蚀斑的形态 、大小 、出斑时间等对 HCMV 毒株 Study on the optim iza tion of plaque a ssay for human cytom ega lov irus and detection an tiv ira l activ ity of an ti2v irus substance Zhang Jun ling, W ang M ingli ()D ept of M icrob iology, A nhu i M ed ica l U n iversity, H efei 230032 ( ) A b stra c t O b jec tive To e stab lish a op tim a l p laque a ssay fo r re sea rch ing hum an cytom ega loviru s HCMV by stud2 HCMV wa s inocu la ted in to H F ce lls mono laye r , ad2 ying the infuence on HCMV p laque fo rm a tion. M e th ods so rbed a t 37 ?, added two aga ro se ove rlays re sp ec tive ly w ith 01463 ‰, 01925 ‰ o r 015 % , 1 % DM SO w ith in two week s. The ce lls we re sta ined w ith 015 % c rysta l vio le t in 10 % fo rm a lin fo r 5 m in. P laque s we re coun ted accu ra te2 ly. PCR wa s u sed to iden tify the HCMV. P laque2reduc tion neu tra liza tion te st wa s ca rried ou t w ith the se ra of p a2 tien t and the se ra of rabb its imm uned by HCMV AD 169 stra in. The op tim a l p laque reduc tion te st can be u sed in e2 ( ) va lua ting an tivira l ac tivity of ganc ic lovir GCV . R esu lts The tim e of a rou tine p laque fo rm ed wa s 5 days, and it′ s round, so lid, op aque. The num be rs and size s of p laque wh ich ove rlay w ith d iffe ren t concen tra tion of N aHCO 3 ( ) we re d iffe ren t, tite rs had sign ifcan t d iffe rence P < 0105 , P laque cou ld be fo rm ed in 3 days by the low N aHCO3 concen tra tion m e thod than it wh ich eve r u sed a s a rou tine a ssay in HCMV titra tion. The p laque s we re sim ila r w ith ( ) d iffe ren t DM SO , tite rs a lso had no sign ifcan t d iffe rence P > 0105 . P laque fo rm a tion cou ld be neu tra lized no t on ly by HCMV p a tien t se ra bu t a lso by rabb it se ra. It wa s on ly 7 days by the op tim a l p laque reduc tion te st in eva lua tion an tivira l ac tivity of GCV. C on c lu s ion The op tim a l p laque a ssay is stab le and ea sy fo r the quan tita tive de tec tion of HCMV and can be w ide ly app lied to the sc reen ing and eva lua tion of an ti2viru s sub stance. M eSH cytom ega loviru s / iso la tion & p u rifica tion; p a tch te sts Free word s p laque a ssay; p laque2reduc tion neu tra liza tion te st