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脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用

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脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作 用 暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 中 文 摘 要 目 的 : 1. 体外纯化培养人羊膜上皮细胞(H A E C s )及羊膜间充质干细胞(A D M S C s ) 。 2. L P S H A E C s A D M S C s W J M S C s 研究不同浓度 脂多糖 ( ) 对 、 、 脐带间充质干细胞 ( ) 的炎症损伤作用,比较三种细胞对 L P S 的耐受程度...
脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用
脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作 用 暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 中 文 摘 要 目 的 : 1. 体外纯化培养人羊膜上皮细胞(H A E C s )及羊膜间充质干细胞(A D M S C s ) 。 2. L P S H A E C s A D M S C s W J M S C s 研究不同浓度 脂多糖 ( ) 对 、 、 脐带间充质干细胞 ( ) 的炎症损伤作用,比较三种细胞对 L P S 的耐受程度。 3. 用 L P S 刺激 H A E C s 建立 体外炎症损伤的模型 , 探讨 W J M S C s 对炎症损伤 H A E C s 的修复作用。 方 法 : 1. 10 取 无 妊 娠 合 并 症 的 例 足 月 剖 宫 产 产 妇 的 羊 膜 组 织 , 采 用 机 械 分 离 联 合 酶 消 化 法 分离纯化培养 H A E C s 、A D M S C s ;台盼兰染色计数原代提取细胞的活力,细胞传代后 取 P 1 代 H A E C s 、 A D M S C s , 分 别 用 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 的 上 皮 源 性 和 间 质 源 性 并 计 算 细 胞 的纯度, 取细胞纯度和细胞活力均大于 90% 的标本进入后续的实验 ; A D M S C s 采用流式细 胞仪检测干细胞相关标记及进行成骨和成脂诱导;取 P 1 代 H A E C s 和 P 3- P 6 代 A D M S C s 、 W J M S C s W J M S C s M T T 1 3 5 7 9 1 1 13d ( 由 广 州 脐 血 库 惠 赠 ) , 法 检 测 第 、 、 、 、 、 、 、 三 种 细 胞 活 性 ( O D 值 ) 并 绘 制 细 胞 生 长 曲 线 并 比 较 生 长 曲 线 的 差 异 、 倒 置 相 差 显 微 镜 观 察 细 胞的形态学特征。 2. L P S 不同浓度 作用于 H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s 不同天数 , 通过原子力显微镜 观察细胞面形貌特征的变化 (L P S 终浓度为 10? g/ m l 、 1? g/ m l 、 0? g/ m l , L P S 作用天数 为 3d M T T L P S 50? g/ m l 10? g/ m l 1? g/ m l 0? g/ m l ) 、 检测细胞活性的差异 ( 终浓度为 、 、 、 及完 全培养基组, L P S 作用天数分别为 1d 、 3d、 5d ) 、 T U N E L 检测细胞的凋亡的 情况 (L P S 终 浓度为 50? g/ m l 、10? g/ m l 、1? g/ m l 、0? g/ m l , L P S 作用天数分别为 1d、3d、5d) 。 3. 建立 H A E C s 体外炎性 损伤的模型, 分三组:单纯 H A E C s (未共 培养组 ) 、H A E C s 与 W J M S C s 按 1: 1 混匀 直接混合共培养 组 ( 直接混合培养组 ) 、 H A E C s 和 W J M S C s T r a ns w e l l T r a ns w e l l L P S 50? g/ m l 10? g/ m l 1? g/ m l 0? g/ m l 共 培养组 ( 共 培养组 ) , 刺 激浓度分四组 ( 、 、 、 ) , 共培养前 L P S 作用的时间分三组 (1d 、 3d、 5d) , 共培养 48h 后, 用 M T T 法检测细胞活性 、 T U N E L 法 检 测 细 胞 凋 亡, 比 较 三 组 细 胞 活 性 和 凋 亡 情 况 的 差 异 。 评 价 W J M S C s 对 不 同 炎 性损伤程度的 H A E C s 是否有修复作用且不同共培养的方法修复作用的差异。 I暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 结 果 : 1. 5 例 标 本 通 过 机 械 分 离 联 合 酶 消 化 法 得 到 纯 度 和 活 性 均 大 于 90% 的 H A E C s 、 A D M S C s 。 本 研 究 提 取 的 A D M S C s 表 型 为 C D 29+ 、 C D 31- 、 C D 34- 、 C D 40- 、 C D 44+ 、 C D 45- 、 C D 105+ 、 C D 106- 、H L A - D R - ,可以诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。 2. H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s 三组细胞生长曲线形态相似 , 但 A D M S C s 、 W J M S C s 体外细胞活性比 H A E C s 好(P <0.05)。 3. 在体外 L P S 可以诱导 H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s 细胞 活性下降 ,A D M S C s 、 W J M S C s 对 L P S 的 耐受性比 H A E C s 好 ( P < 0.05 ) ; 与 L P S 0g/ m l 组 相比 , 1、 10 、 50? g/ m l 组 L P S 作 用 于 三 种 细 胞 1d 后 细 胞 活 性 下 降 不 明 显 ( P 0.05) , 作 用 3d 、 5d 后 细 胞 活 性 下 降(P <0.05 ) ;三种细胞活性随 L P S 浓度增加、作用天数增多逐渐下降( P < 0.05) 。 4. 在 体 外 L P S 可 以 诱 导 H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s 细 胞 凋 亡 增 多 和 细 胞 总 数 减 少。 细胞总量随 L P S 浓度的增加逐渐减少 ( P <0.05) , L P S 作用第 5d 比第 1d、 3d 减少 ( P <0.05) ; 细胞凋亡指数 A D M S C s < H A E C s (P <0.05 ) , 与 L P S 0g/ m l 组相比, 10、 50? g/ m l 组 L P S 作用 1d、 3d、 5d 后三种细胞凋亡指数增加( P <0.05) ,而 L P S 1g/ m l 组 L P S 作用 1d 后细胞凋亡指数无变化 (P 0.05) , 作用 3d、 5d 凋亡指数增加 (P <0.05) ; 随 L P S 浓度 的增加、作用天数的增多凋亡指数逐渐增加(P <0.05) 。 5. 在 体 外 L P S 可 以 诱 导 H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s 细 胞 形 貌 特 征 的 改 变 , L P S 作 用 3d 后 原 子 力 显 微 镜 下 观 察 三 种 细 胞 , 随 L P S 浓 度 的 增 加 细 胞 逐 渐 塌 陷 , 表 面 粗 糙 , 细 胞 核 固 缩 、 边 集 甚 至 核 碎 裂 和 溶 解 , 细 胞 质 疏 松 胞 内 出 现 空 泡 。 L P S 10g/ m l 和 1? g/ m l 相对于 L P S 0g/ m l 可以引起三种细胞长度和宽度增加 ( P <0.05) , 细胞胞质平均粗糙度 ( 胞 质 R a ) 和 均 方 根 粗 糙 度 ( 胞 质 R q ) 增 加 ( P < 0.05 ) , 但 胞 核 粗 糙 度 和 测 量 的 细 胞 最 高 径 无差异(P 0.05) 。 6. W J M S C s 与 炎 性 损 伤 的 H A E C s 共 培 养 总 体 来 说 细 胞 平 均 O D 值 未 共 培 养 组 < 直 接 混合共培养 组直接共培养组 、 T r a ns w e l l 共培养组>直接共培养组 ( P <0.05) , 凋亡指 数未共培养组>T r a ns w e l l 共培养组 (P <0.05) 。 I I暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 结 论: 1. A D M S C s 、W J M S C s 体外培养 细胞增殖力比 H A E C s 好。 2. 在体外一定浓度的 L P S 作用一定的时间可以诱导 H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s 细 胞 活 性 下 降 、 细 胞 凋 亡 指 数 增 多 、 细 胞 总 量 减 少 , 诱 导 的 效 应 呈 浓 度 和 时 间 依 赖 性 , 且 A D M S C s 、W J M S C s 对 L P S 耐受性比 H A E C s 好。 3. W J M S C s 与 L P S 损 伤的 H A E C s 采 用 T r a ns w e l l 共 培养 可 以减轻 H A E C s 细 胞活性的 下降和细胞的凋亡。 关 键词: H A E C s ,A D M S C s ,W J M S C s , L P S ,原子力显微镜,T r a ns w e l l 共培养 I I I暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 A A A A bs bs bs bs t t t t ract ract ract ract O O b b j j e e c c t t i i ve ve O O b b j j e e c c t t i i ve ve 1. T o e s t a bl i s h a m e t hod of pur i f yi ng a nd c ul t ur i ng hum a n a m ni ot i c e pi t he l i a l c e l l s H A E C s a m ni ot i c - de r i ve d m e s e nc hym a l s t e m c e l l s A D M S C s i n vi t r o. 、 ( ) 2. S t udy t he di f f e r e nc e be t w e e n t he e f f e c t of di f f e r e nt c onc e nt r a t i on l i popol ys a c c ha r i de L P S s t i m ul a t e di f f e r e nt t i m e on t he H A E C s 、 A D M S C s a nd W ha r t on's j e l l y- de r i ve d m e s e nc hym a l s t e m c e l l s (W J M S C s ). 3. E s t a bl i s h a m ode l of i nf l a m m a t or y i nj ur e d H A E C s i n vi t r o; e va l ua t e t he W J M S C s 's r e pa i r m e n e f f e c t t o t he i nf l a m m a t or y i nj ur e d H A E C s I n vi t r o. M e t h od s M M M e e e t t t h h h od od od s s s 1. H A E C a nd A D M S C s w e r e i s ol a t e d f r om 5 c a s e s ' a m ni on of f ul l - t e r m c e s a r e a n s e c t i on w i t hout pr e gna nc y c om pl i c a t i ons us i ng m a c hi ne r y- E nz ym e di ge s t i on a nd c ul t i va t e d i n c ul t ur e m e di um f or P r i m a r y c ul t ur e a nd P a s s a ge .T r y pa n bl ue s t a i ni ng w a s t o c ount t he pr i m a r y e xt r a c t i on of c e l l s ' vi a bi l i t y; T he pr ol i f e r a t i on c ha r a c t e r i s t i c s a nd t he na t ur e of t he P 1- ge ne r a t i on H A E C s 、 A D M S C s w a s a na l ys i s e d a nd i de nt i f i e d by f l ow c yt om e t r yT a ke t he pur i t y a nd vi a bi l i t y of t he c e l l s w hi c h w e r e gr e a t e r t ha n 90% i nt o t he f ol l ow - up e xpe r i m e ntA D M S C s ' r e l a t e d s t e m c e l l m a r ke r s w a s de t e r m i ne d by f l ow c yt om e t r y a nd t he os t e oge ni c , a di poge ni c i nduc t i on.T he c e l l s vi a bi l i t y gr ow t h c ur ve s t he c ul t ur e d da ys r e s pe c t i ve l y1,3,5,7,9,1 1 ,13 of t he P 1- ge ne r a t i on H A E C s a nd t he P 3- P 6- ge ne r a t i on A D M S C s , W J M S C s W J M S C s w e r e f r om G ua ngz hou C or d B l ood c om pa ny a s gi f t s w e r e a na l yz e d by M T T a nd t he c e l l s ' m or phol ogi c a l f e a t ur e s w e r e obs e r ve d by m i c r os c ope2. L i popol ys a c c ha r i de L P S i n di f f e r e nt c onc e nt r a t i ons c ul t ur e d w i t h H A E C s 、 A D M S C s , W J M S C s f or di f f e r e nt da ys , c om pa r e t he r e s i s t a nc e of t he t hr e e ki nds of c e l l s r e s pe c t i ve l y by C e l l s a c t i vi t y w a s de t e c t e d by M T T F i na l c onc e nt r a t i on, r e s pe c t i ve l y ? 50? g/ m l ,10? g/ m l ,1? g/ m l ,0? g/ m l ,c om pl e t e m e di um gr oup; f i na l s t i m ul a t e t i m e , 1da ys ,3da ys ,5da ys ; ? A popt os i s of c e l l s w a s de t e c t e d by T U N E L a s s a y F i na l c onc e nt r a t i on, r e s pe c t i ve l y 50? g/ m l ,10? g/ m l ,1? g/ m l ,0? g/ m l ; f i na l s t i m ul a t e t i m e , 1da ys ,3da ys ,5da ys ; ? M or phol ogi c a l c ha nge s w e r e obs e r ve d by A t om i c f or c e m i c r os c ope F i na l c onc e nt r a t i on, I V暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修 复作用 r e s pe c t i ve l y 10? g/ m l ,1? g/ m l ,0? g/ m l ; f i na l s t i m ul a t e t i m e , 3 da ys 3. E s t a bl i s h t he i nf l a m m a t or y i nj ur y m ode l of H A E C s i n vi t r o w i t h t he L P S F i na l c onc e nt r a t i on r e s pe c t i ve l y 50? g/ m l , 10? g/ m l , 1? g/ m l , 0? g/ m l ; f i na l s t i m ul a t e t i m e 1da ys , 3da ys , 5da ys T he i nf l a m m a t or y da m a ge d H A E C s c ul t ur e d w i t h W J M S C s di vi de d i nt o t hr e e gr oups , r e s pe c t i v e l y di r e c t l y m i x e d gr ou p w i t h a c e l l c o nc e n t r a t i o n of 1: 1 ,d i r e c t l y m i x e d c ul t u r e gr o u p , T r a ns w e l l c o- c ul t ur e gr oup, w i t hout c o- c ul t ur e gr oup. C om pa r e t he di f f e r e nc e a f f e c t i vi t y of r e duc i ng t he c e l l s ' a popt os i s a nd pr om ot e c e l l s gr ow t h a m ong t he t hr e e gr oups a f t e r C o- c ul t ur e d w i t h t he W J M S C s f or 48 hour s r e s pe c t i ve l y by f ol l ow i ng m e t hodsA popt os i s of c e l l s w a s de t e c t e d by T U N E L ; C e l l s ’ a c t i vi t y w a s de t e c t e d by M T TA s s e s s t he pos s i bi l i t y of r e pa i r m e n of W J M S C s t o t he i nf l a m m a t or y da m a ge d H A E C s a nd c om pa r e t he e f f e c t i ve di f f e r e nc e of t he t hr e e gr oupsR R R R e e e e s s s s u u u u l l l l t t t t s s s s 1. T he m e c ha ni c a l c om bi ne d w i t h e nz ym e di ge s t i on s e pa r a t e m e t hods ge t H A E C s a nd A D M S C s w i t h pur i t y a nd a c t i vi t y w e r e gr e a t e r t ha n 90% i n 5 c a s e sT he A D M S C s phe not ype s a r e C D 29 + ,C D 31- ,C D 34- ,C D 40- ,C D 44 + ,C D 45- ,C D 105+ ,C D 106- ,H L A - D R - , c a n be i nduc e d di f f e r e nt i a t e i nt o a di pos i t i e s a nd os t e obl a s t s2. T he H A E C s 、 A D M S C s 、 W J M S C s ha ve t he s i m i l a r s ha pe of c e l l gr ow t h c ur ve .B ut t he pr ol i f e r a t i on of t he H A E C s i s l ow e r t ha n t he ot he r gr oups P 0.053. L P S c a n i nduc e t he de c r e a s e of t he t hr e e c e l l s ' a c t i vi t y , t he t ol e r a nc e of t he A D M S C s a nd W J M S C s i s be t t e r t ha n t he H A E C s P 0.05 .T he da m a ge i s i nc r e a s e d w i t h t he hi ghe r c onc e nt r a t i on of L P S a nd t he da ys us e d P 0.05C om pa r e d w i t h L P S 0g/ m l gr oup, L P S 1,10,50g/ m l gr oup c ul t ur e d f or 1da y c a n not de c r e a s e d t he c e l l s ' a c t i vi t y P 0.05 but i ns t e a d s t i m ul a t e f or 3 a nd 5 da ys C a n P 0.054. L P S c a n i nduc e t he de c r e a s e of t he c e l l s ' t ot a l num be r a nd t he i nc r e a s e of t he a popt os i s of t he c e l l s , a nd gr a dua l l y c ha nge d w i t h t he i nc r e a s i ng c onc e nt r a t i on of L P S P 0.05T he t ot a l num be r of t he c e l l s w hi c h c ul t ur e d w i t h L P S f or 3 a nd 5 da ys w a s m uc h l e s s t ha n c ul t ur e d f or 1 da y ( P < 0.05 ) ; T he a popt os i s i nde x of t he t hr e e c e l l s or de r e d by W J M S C s < A D M S C s 、 W J M S C s < H A E C s ( P < 0.05 ) .C om pa r e d w i t h L P S 0g/ m l gr oup, L P S 10,50g/ m l gr oup c ul t ur e d f or m or e t ha n 1da y c a n i nc r e a s e t he a popt os i s i nde x of t he t hr e e c e l l s , w hi l e L P S 1g/ m l gr oup f or 3 da ys (P <0.05). V暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复 作用 5. L P S c a n i nduc e d t he m or phol ogy c ha nge s of t he H A E C s ,A D M S C s ,W J M S C s ,a nd s e ve r e l y w i t h t he i nc r e a s e of t he c onc e nt r a t i on of L P S .A f t e r c ul t ur e d w i t h L P S f or 3 da ys t he c e l l s obs e r ve d unde r A F M ,t he s ur f a c e of t he c e l l s w e r e r oughne s s a nd c ol l a ps eT he nuc l e a r i s c onde ns a t i on, e dge s e t , e ve n nuc l e a r f r a gm e nt a t i on a nd di s s ol ve d, t he c yt opl a s m a ppe a r s l oos e a nd va c uol e sC om pa r e d w i t h L P S 0g/ m l gr oup, L P S 1,10g/ m l gr oup i nc r e a s e d t he c e l l s ' l e ngt h ,w i dt h ,a ve r a ge c yt opl a s m r oughne s s ( R a a nd R q ) of t he t hr e e c e l l s P 0.05 .B ut t he nuc l e us r oughne s s a nd t he hi ghe s t di a m e t e r of c e l l s w i t h no di f f e r e nc e P 0.05 6. T he c o- c ul t ur e m e t hods w i t h t he W J M S C s c a n pr ot e c t t he c e l l s ' a c t i vi t y f r om da m a ge d by i nf l a m m a t i on. T he c e l l ' s a c t i vi t y or de r e d by w i t hout c o- c ul t ur e gr oup di r e c t l y m i xe d c ul t ur e gr oup T r a ns w e l l c o- c ul t ur e gr oup, but w i t h no s i gni f i c a nt di f f e r e nc e P 0.05 .T r a ns w e l l c o- c ul t ur e f or 2 da ys a f t e r s t i m ul a t e w i t h L P S f or 1da y , t he c e l l ' s a c t i vi t y or de r e d by : di r e c t l y m i xe d c ul t ur e gr oup w i t hout c o- c ul t ur e gr oup T r a ns w e l l c o- c ul t ur e gr oup P 0.05 ,a f t e r s t i m ul a t e w i t h L P S f or 3 da ys , t he c e l l ' s a c t i vi t y w i t h no s i gni f i c a nt di f f e r e nc e P 0.05 ,a f t e r s t i m ul a t e w i t h L P S f or 5da ys ,t he c e l l ' s a c t i vi t y or de r e d by w i t hout c o- c ul t ur e gr oup di r e c t l y m i xe d c ul t ur e gr oup T r a ns w e l l c o- c ul t ur e gr oup P 0.057. T he c o- c ul t ur e m e t hods w i t h t he W J M S C s c a n r e duc e t he a popt os i s a nd t he r e duc t i on of t he t ot a l num be r of t he c e l l sA nd t he t ot a l num be r of t he c e l l s or de r e d by di r e c t l y m i xe d c ul t ur e gr oup w i t hout c o- c ul t ur e gr oup, di r e c t l y m i xe d c ul t ur e gr oup T r a ns w e l l c o- c ul t ur e gr oup, T he a popt ot i c i nde x or de r e d by T r a ns w e l l c o- c ul t ur e gr oup w i t hout c o- c ul t ur e gr oup P 0.05C C C C on on on on c c c c l l l l u u u u s s s s i i i i on on on on : : : : 1. T he A D M S C s , W J M S C s c e l l s ' pr ol i f e r a t i on i s be t t e r t ha n H A E C s2. I n vi t r o L P S i n c e r t a i n c onc e nt r a t i on a nd s t i m ul a t e f or c e r t a i n da ys c a n i nduc e H A E C s , A D M S C s , W J M S C s de c r e a s e d of t he c e l l s ' a c t i vi t y a nd t he c e l l s ' t ot a l num be r , i nc r e a s e d of t he a popt os i s i nde x s i gni f i c a nt l y P 0.05I nduc i ng e f f e c t of c onc e nt r a t i on a nd t i m e - de pe nde nt , a nd A D M S C s , W J M S C s on t he L P S t ol e r a nc e i s be t t e r t ha n H A E C s3. T he i nf l a m e d da m a ge d H A E C s by L P S c o- c ul t ur e w i t h t he W J M S C s by T r a ns w e l l c a n i nc r e a s e t he c e l l s ' a c t i vi t y a nd r e duc e t he c e l l s ' a popt os i sK K K K e e e e y y y y w w w w or or or or d d d d s s s s : : : : H A E C s , A D M S C s , W J M S C s , L P S , a t om i c f or c e m i c r os c opy , T r a ns w e l l c o- c ul t ur e V I暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修 复作用 目 录. I 中 文摘要 I I I A A A A B B B B S S S S T T T T R R R R A A A A C C C C T T T T. I I I I V V V V 目 录. V V V V I I I I I I I I1 1 前 言. 1 1 1.1 胎膜早破的研究进展2 1.2 干细胞的研究进展 5 1.3 本实验研究的主要内容、目的及意义. 7 参考文献8 H H A A E E C C S S A A D D M M S S C C S S WJM WJM S S C C S S 12 12 第 一部分 H H A A E E C C S S 、 A A D D M M S S C C S S 和 WJM WJM S S C C S S 的 体外培养 12 12 1 材料与方法. 12 2 试验步骤与方法14 结 果 20 附录 1:文中图片及简要说明. 25 讨 论 28 参考文献 30 H A E C S A D M S C S WJM S C S L P S. 32 第 二部分 H H H A A A E E E C C C S S S 、 A A A D D D M M M S S S C C C S S S 、WJM WJM WJM S S S C C C S S S 对 L L L P P P S S S 耐 受 性的比较 32 32 32 1 材料与方法. 32 2 实验步骤及方法32 结 果 37 附录 2:文中图片及简要说明. 52 讨 论 61 参考文献 65 第 三部分 脐 带间充质干细胞对羊膜上皮炎症损伤模型的修复作用68 68 68 68 1 材料与方法. 68 2 实验步骤及方法68 结 果 71 讨 论 80 参考文献 84. 85 85 结 论 85 85 英 文缩略语表86 86 86 8688 在 学期间发表的论文 88 88 88 致 谢89 89 89 89 V I I暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的 修复作用 前 言 在临产前胎膜破裂称为胎膜早破(pr e m a t ur e r upt ur e of m e m br a ne s , P R O M ) ,妊娠不满 37周的胎膜早破是未足月胎膜早破(P r e t e r m pr e m a t ur e r upt ur e of m e m br a ne s , P P R O M ),国 [ 1 ] P R O M 10% P P R O M 2.0% - 3.5% P R O M 1% 内报道发生率 约为 , 约为 ; 国外报道 , 发生率约为 , [ 2 ] P P R O M 约占所有早产的 1/ 3 。P R O M 可引起早产、脐带脱垂、胎儿宫内窘迫、母儿感染, 可并发胎儿吸入性肺炎、 胎儿及新生儿颅内出血及感染、 新生儿呼吸窘迫综合症、 胎肺发 育不良、 骨骼畸形、 肺动脉高压等, 因此P P R O M 是临床常见且棘手的问题 。 目前临床上孕 32周前的P P R O M 的处理多倾向于期待疗法 , 期待疗法的目标主要是延长孕周 , 改善新生儿 的预后。但是期待疗法尚存在很多不足之处,首先:胎膜早破可能存在潜在的阴道炎、 绒 毛膜羊膜炎, 胎膜早破的患者因为屏障作用消失可继发宫内感染, 一旦感染的风险超过早 [ 3 ] 产并发症的风险,应考虑终止妊娠 ;其二:P P R O M 患者中只有7.7% - 9.7% 的胎膜破口可 [ 4 - 5 ] 以自然愈合, 妊娠可以继续, 围产儿预后较好 。 对于破膜时孕周太小者, 相当一部分在 期待疗法过程中, 因为胎膜破口的持续存在, 可能发生羊水过少、 影响胎儿的骨骼发育而 形成畸形、胎肺发育不全导致新生儿呼吸窘迫综合症、脐带脱垂、胎儿宫内窘迫;其三: [ 6 ] 持续阴道流液的孕妇, 60% 在7天内发动分娩 导致早产发生率及围产儿死亡率增高, 期待 疗法疗效有限; 四、 期待治疗使部分围产儿预后改观, 但对于离足月较远者 ,长期卧床及 用药增加了孕妇的经济和心理负担。 目前胎膜早破的处理还尝试封闭胎膜破口, 羊膜腔封 闭治疗在动物实验和临床均证实有疗效, 但目前P P R O M 的封闭技术还不成熟 , 存在较多的 并发症的风险, 如因使用材料为异源性材料存在异源性反应、 封闭破口的操作可引起感染、 封闭材料产生胎儿误吸等无法预知的风险, 一直未在临床得到广泛的应用。 间充质干细胞 M e s e nc hym a l s t e m c e l l s , M S C s 是一种有自我复制能力和多向分化潜能的多能干细胞,具 有低免疫原性和免疫抑制作用, 并能优先归巢于损伤组织, 促进组织修复, 为临床组织损 伤的再生修复带来了希望。 羊水中存在来源于胎儿的干细胞, 羊膜中也含有干细胞, 羊膜 [ 7 ] 上皮细胞本身也具有干细胞的部分特性,在再生医学领域的心血管系统疾病 、神经系统 [ 8 ] [ 9 ] [ 1 0 ] 疾病 、肌肉骨骼相关疾病 、糖尿病 等多种疾病的临床试验中得到应用,为临床应用 展示了广阔的前景。 但是胎膜早破的破口为何自愈能力低?自发性胎膜早破的破口较医源 性胎膜早破的破口为何更难愈合?是否与炎症因子对细胞的损伤有关?能否建立一种体 外细胞炎性损伤的模型用于胎膜早破的研究?不同种类的干细胞对炎性损伤的耐受性是 1暨南大学士学位论文 脐带间充质干细胞对炎症损伤羊膜上皮细胞的修复作用 否有差异?干细胞对炎性损伤的组织和细胞是否具有修复作用?故本课题提取原代的羊 膜上皮细胞 ( H um a n a m ni ot i c e pi t he l i a l c e l l s , H A E C s ) 、 羊膜间充质干细胞 ( A m ni ot i c - de r i ve d m e s e nc hym a l s t e m c e l l s ,A D M S C s ) ,为后续实验提 供充足的细胞来源;比较H A E C s 、 A D M S C s 、脐带间充质干细胞 W ha r t on's j e l l y- de r i ve d m e s e nc hym a l s t e m c e l l s ,W J M S C s )对 炎症损伤因子的耐受性差异, 为探讨干细胞用于炎性损伤细胞的修复提供依据; 建立体外 H A E C s 炎症损伤的模型, 以模拟体外炎症损伤 的胎膜早破; 用直接混合共培养和T r a ns w e l l 共培养的方法探讨W J M S C s 对炎症损伤的H A E C s 的修复作用。 1. 1. 1. 1. 1 1 1 1 胎 膜 早 破 的 研 究 进 展 1.1.1 1.1.1 1.1.1 1.1.1 胎 膜的解剖、生理特点 胎膜主要由羊膜和绒毛膜以及两者相连的细胞外基质 E xt r a c e l l ul a r m a t r i x, E C M 所 组成。在妊娠 14 周末,羊膜与绒毛膜的胚外中胚层相连并封闭胚外体腔。妊娠晚期羊膜 与绒毛膜轻轻贴附, 可以分开。 胎膜外层为绒毛膜, 起源于中胚层。 绒毛膜因在发育过程 中 缺 乏 营 养 逐 渐 退 化 萎 缩 成 为 平 滑 绒 毛 膜 。 细 胞 外 基 质 ( E C M ) 由 包 埋 在 多 聚 糖 凝 胶 中 , 的纤维蛋白组成 是胎膜的骨架架构, 可以对其他的细胞有促进增殖、 分化、 迁移、 粘附、 基因表达调控的作用。 胎膜的抗张能力依赖于 E C M 的胶原类型,主要提供抗张力的是 疏松的?和?型胶原, 以及少部分?、?和?型胶原。胶原的含量随妊娠进展而变化, 孕 [ 1 1 ] 20 周 时 突 然 增 加 , 持 续 到 39 周 时 又 突 然 降 低 。 胎 膜 内 层 为 羊 膜 , 羊 膜 是 具 有 一 定 弹 性 [ 1 2 ] 的半透明薄膜 ,正常羊膜厚约 0.02- 0.05m m ,无血管、神经及淋巴。根据 B our ne 研究 , H A E C s 羊 膜 自 内 向 外 由 、 基 底 膜 、 致 密 层 、 纤 维 母 细 胞 层 和 海 绵 层 组 成 , 上 皮 层 来 源 于 外胚层,为羊膜上皮。 胎膜的愈合能力差, 典型的创伤愈合包括炎性渗出、 形成血凝块并机化、 肉芽组织的 增生和瘢痕的形成。 羊膜中无血管和神经, 无法进行瘢痕愈合。 虽然破口处羊膜会通过滑 动、 收缩对小的医源性破口可以近乎封闭,子宫肌层与子宫蜕膜层可形成瘢痕进行功能 ,
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