体外培养的兔虹膜色素上皮细胞吞噬功能及细胞连接的观察

体外培养的兔虹膜色素上皮细胞吞噬功能及细胞连接的观察 体外培养的兔虹膜色素上皮细胞吞噬功能 及细胞连接的观察 体外培养的兔虹膜色素上皮细胞吞噬功能 及细胞连接的观察 ObservationofPhagocytosisandCellJunction ofRabbitIPEinVitro 王兆艳惠延年: 解放军总院眼科,北京100852 1第四军医大学西京医院眼科,西安710032 ZhaoyanWang..YannianHui: 'Departmemof脚hthabvm~ogy,JeneralHo@italofPeopte'sLiberationArm).Belting100852China DepartmentofOphthatmotog)~TheFourthMilitaryMedicalL'ni~ersityn710032Chimt 视 目的 用. 方法 接. 观察{车外培养的虹膜色素上皮(irispigmentepithelimnIPE)细胞是否具有吞噬功能及屏障怍 将鸡红细胞悬液加人体外培养的IPE细胞内计算其吞噬数量,电镜下观察IPE细胞间连 结果:体外培养状态下,IPE细胞对鸡红细胞的吞噬率为54%,视网膜色素上皮(retinalpigment epitheliumRPE)细胞为88%(P<00I);IPE同RPE一样具有紧密连接结构. 结论:兔IPE在体外培养状态下,具有吞噬功能及屏障作用.眼科2001;17:I91—193. 美键词:吞噬功能细胞连接虹膜色素上皮 Purpose:Tostudythephagocytosisandcelljunctionsofirispigmentepifiaelium(IPE)in vitro. MethodsChickenmdbloodcellswereaddedtoculturemediumof1PE,thenumbersof IPEphagoeytingchickredbloodcellswerecounted;celljunctionswereobservedwith transmissionelectronn~el-oseope. Resu~s:Thephagocytoticratesof1PEandretinalpigmentepithelium(RPE)were 5.4%and8.8%respectively;therewereva~oustightunctionsin1PE Conclusion:IPEpossessdphagoeytosisandbarrierfunctionsinvitroEyeScience 2tm{17:l9{,l93. Keywords:phagocytosis.celljunction,irispigmentepithelium(IPE) 网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium. RPE)具有重要的生理功能,如吞噬脱落的光 感受器外节.参与形成血一视网膜外屏障等这些都 对视网膜发挥功能起着重要作用.与RPE有着同一 胚胎起源的虹膜色素上皮细胞(irispigment epitbelium,IPE),目前对其研究甚少.只知其参与光 调节瞳孔大小,形成血一房水屏障等.笔者旨 吸收, 在研究IPE是否同RPE一样,具有吞噬功能及屏障 作用.为下一步进行1PE替代RPE移植到视网膜神 经上皮打下基础. 材料与方法 一 ,1PE,RPE细胞吞噬功能检测 l9l !一蔓17孝孽期一一 1兔IPE,RPE细胞的分离:选出生1月杂色家 兔,雄雌兼用,第四军医大学动物研究中心提供.耳 缘静脉注射空气5ml处死后,即刻摘出眼球,将眼 球分成眼前部和后部.将眼前部角膜,晶状体,玻璃 体去陈,仔细从根部分离虹膜,将虹膜后表面向上置 于培养皿内.用BSS液冲洗,然后用浓度为0.25% 胰蛋酶和200U/ml胶原酶及0.01%EDTA的混合 消化液消化1.5,2.0h,再在解剖显微镜下用虹膜 恢复器轻轻将IPE自基质分离,使IPE飘落,继续消 化20rain后,将细胞收集到含有血清的DMEM液 中,终止消化,1000r/min离心10min,弃上清,再用 DMEM液洗涤IPE细胞2次,然后将细胞混悬于 15%NCS的DMEM中,接种于培养瓶中,置37?, 5%CO孵箱中培养,3d后倒置显微镜下观察,更换 培养液,以后每日观察细胞生长状态,2,3d换液 至细胞近融合状态.眼后节则置于眼托上,弃去玻 璃体及视网膜感觉部,BSS液漂洗后,以终浓度为 0.25%胰蛋白酶,100U/ml透明质酸酶,0.01% EDTA混合消化液消化3Omin,用吸管轻轻反复吹 打,使RPE细胞漂落,将RPE收集,离心等同IPE. 2.鸡红细胞悬液的制备:鸡红细胞从年幼的正 常生长状态的鸡获得.在无菌条件下从翼静脉抽取 鸡血2ml,加入肝素100U,平衡盐液洗涤,500r/ min离心5min,弃去上清,BSS继续冲洗后,500r/ min再离心5min,晟后弃去上清,用DMEM液将鸡 红细胞制成悬液,血球计数板法计数后,即刻使用. 3.IPE,RPE吞噬鸡红细胞试验:取第3次传代 的IPE,RPE细胞,以1×10/ml的密度将lOml细 胞悬液接种于预先置有18mm盖玻片的直径为9O mm的玻璃培养皿中,在未置玻片的玻璃培养皿中 亦加入1Oml细胞悬液.培养24h后,重新加入 10%NCS的DMEM的培养液1Oml及鸡红细胞悬 液,终浓度为5×1O/ml,在37?,5%CO:孵箱继续 培养48h,取出盖玻片,PBS冲洗,冰丙酮固定后常 规HE染色.选择细胞密度适中的区域观察IPE, RPE吞噬鸡红细胞情况在l0×10显微镜下进行 细胞计数,共数1000个细胞,计算出吞噬鸡红细胞 的IPE,RPE数量并照像. 吞噬率(%)=吞噬鸡红细胞的IPE或RPE数 ?总IPE或RPE数×100% 未放玻片的培养皿内的培养液弃去后,PBS冲 洗3遍,每次2rain,再用0.125'?/,胰蛋白酶消化,收 集细胞,1500r/rain离心15min,2%戊二醛固定, 192 EyeScience2001;Voll7No4 PBS冲洗,1%四氧化锇后固定.丙酮递次脱水.浸透 包埋,制作电镜切片,观察并照像. 二,体外培养状态下IPE,RPE细胞连接的观 察: 在培养皿中预先加入聚苯乙烯盖玻片,接种第 三次传代的IPE,RPE细胞,细胞密度为1x10'/ml, 放入CO孵箱培养,3d更换培养液.待细胞充分融 合后,取出盖玻片,PBS漂洗3次,每次2rain,再用 4?预冷的3%戊二醛固定30rain,PBS冲洗,1%四 氧化锇后固定,丙酮递次脱水.浸透,进行原位包埋, 制备超薄切片,染色,观察并照像. 结果 兔IPE,RPE吞噬鸡红细胞的观察:光镜F,IPE 及RPE细胞呈长梭形或多角形,部分细胞内含有胞 质为红色,胞核为蓝色的圆形或卵圆形的鸡红细胞 (图1),IPE吞噬率为5.4%,RPE为8.8%,IPE吞 噬率低于RPE约41%(P<0.O1).这表明IPE及 RPE细胞在体外培养状态下均具有吞噬功能.但 RPE吞噬功能强于IPE,电镜下,由于IPE细胞吞噬 鸡红细胞数目不多,未见到吞噬鸡红细胞现象.但 在吞噬组内,IPE细胞内溶酶体,核糖体与滑面内质 网增多兔IPE,RPE体外培养时的细胞连接状态: 透射电镜下,可以发现RPE及IPE细胞呈现定的 极性,附着面可以发现半桥粒样结构,上表面可以发 现微绒毛,IPE细胞问及RPE细胞问均可以发现桥 粒连接,粘着斑,粘着小带,用EDTA消化后的IPE 细胞之间,几乎看不见找不到上述连接结构,细胞多 图1第3次传代的兔IPE吞噬鸡红细胞情况1PE细 胞呈长梭形,部分细胞内含有胞质为红色,胞棱为蓝色的圜 型或椭圆形鸡红细胞{箭头).HE×400 f兆艳等 旱松散,单个状态IPE及RPE在体外培养状态束 发现细胞连接有明显区别(图21 体外培养的免虹膜色素上皮细胞吾噬功能及细胞连接的观察 图2第3发传代的免IPE细胞体外培养状志下细胞连 接情况细胞间可见桥粒I箭头1.醋酸双氧铀+枸橼酸钳染 色×5O0O 免IPE,RPE吞噬功能的研究:鉴于RPE细胞移 植存在的诸多问题,Wiedemann等…于1997年提出 由于IPE和RPE均由视杯外层演变而来,可用自体 IPE细胞替代RPE细胞移植到视网膜神经上皮下, 解决RPE移植中存在的免疫排斥反应及材料来 源问题已有文献指出:体外培养的猪和LongEvan 鼠的IPE都能吞噬消化自体杆细胞外节盘膜12.;移 植的IPE细胞能延缓皇家外科学会(RoyalCollegeof Surgeons.RCS)鼠光感受器细胞的变性,胞浆内有来 自光感受器细胞外节的吞噬体"f.本研究发现:IPE 在体外同RPE一样,具有吞噬鸡红细胞的能力,而 且在吞噬鸡红细胞后细胞内高尔基体,溶酶体增多, 这IPE同RPE一样,具有较活跃的代谢功能. 目前对RPE吞噬机理有较多的研究,认为其中包括 三个环节:受体与配体相辩认;产生跨膜信号参与第 二信使分子释放;大量酶系统激活共同作用带动细 胞框架成分和其它成分参与粒子摄人和消化t,目 前对IPE的吞噬机理尚无任何研究在本实验中, IPE细胞的吞噬功能低于RPE细胞,这是否与IPE 细胞表面受体数日,跨膜信号,酶系统激活情况,细 胞框架成分抑或出生后IPE功能分化方同RPE 细胞存在着差异有关,Jl】fJ有待继续研究: IPE与RPE体外培养状态下细胞连接情况:眼 内环境相对稳定是因为存在着血一眼屏障,RPE细 胞问的连接是构成视网膜』并障的重要组成部分, Rezai等"发现:体外培养的鼠IPE细胞间自桥粒连 接,可阻挡蛋白的滤过我J的实验也证实:IPE细 胞在体外培养状态下具有同体内相似的细咆连接结 构,细胞间具有丰富的桥粒,粘着小带,粘着斑一我 们在相同的条件下对兔IPE及RPE的细胞连接作 了比较,发现IPE保留r许多体内状态下的特征. 如:桥粒,闭锁小带,粘着小带,粘着斑等等而且同 RPE没有区别.这些细胞连接结构在加八EDTA后, 基本消失,这表明,二者细胞连接结构的存在同体内 一 样,依赖于ca'.二者结构的相似,也使IPE有可 能代替RPE,移植至视网膜下腔,形成新的血一视 网膜屏障. 2 4 参考文献 GourasP.A1exanderLWiedemmmPetal:Comparisonof tightJunctionpermeabilityf0ralbumininirispigment epitheliummidretinalpigmentepitheliuminvitroGrae~ ArchClinExpOphthalmol1997;235c1】:48 RezaiALappasA.Farrokh—arL.atal:Irispigment epithe|ialceuBoflngv种bdem~vtslratephag呲c activityExpEyeRes1997;65(1}:23 Scht-aermeyerU.KociokNRescueefft~,lsof1PF. trmlsp[antsinRCSrats:shorttermresuhs.1nvesl OphthalmolVisSci1999:40I71:I545. ErshovAV,StroevaOG:RetisalpigmentepitheliumofHeW bornratsiscapab~ofphagocytosisofrodsegmentsin vitr~.ExpEyeRes1989;49f3):459 RizzolaLT.kiZQ:Diffiasibleretinalfactorsstimulatethe barrierpropertirsofjunctionalcomplexesintheretinal pigmentepithelium.CellSci1993;109{21:859 193