利胆排石片中大黄素、大黄酚含量测定的不确定评定毕业论文（可编辑）

利胆排石片中大黄素、大黄酚含量测定的不确定评定毕业论文（可编辑） 题目(中文):利胆排石片中大黄素、大黄酚含量测定的不确定评定 (外文):Uncertainty measurement in the content determination of Emodin and Rhubarb phenol in LIdanpaishi tablet 院(系): 药 学 院 毕业设计(论文)原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺:所呈交的毕业设计(论文),是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知,除文中特别加以标注和致谢的地方外,不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果,也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体,均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名: 日 期: 指导教师签名: 日 期: 使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计(论文)的规定,即:按照学校要求提交毕业设计(论文)的印刷本和电子版本;学校有权保存毕业设计(论文)的印刷本和电子版,并提供目录检索与阅览服务;学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文;在不以赢利为目的前提下,学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名: 日 期: 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: 日期:年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名: 日期:年 月 日 导师签名:日期:年 月 日 目 录 1.前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 2.文献综 述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„3 3.实验部 分„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 4.不确定度的评 定„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 5.研究结果及讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 6.结术 语„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 7.致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 8.参考文 献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„5 利胆排石片中大黄素和大黄酚含量测定的不确定度评定 专业:药学 班级:07级药学1班 作者:黄芳 指导老师:吴杰连 摘要:目的:对HPLC法测定利胆排石片中的大黄素和大黄酚的含量的不确定度进行分析,找出影响不确定度的因素。方法:采用HPLC法测定大黄素和大黄酚 的含量,并根据《测量不确定度评定与表示》JFL059?1999中有关规定评估其不 确定度。结果:不确定度评估大黄素为0.002%、大黄酚为0.0015%。结论:严格按 照操作规范,尽可能减少稀释过程影响,可有效降低引入的不确定度,保证测定结 果准确。 关键词:利胆排石片;大黄素;大黄酚;高效液相色谱;测量不确定度 应为题目 Abstract: objective: Uncertainty measurement in the content determination of Emodin and Rhubarbphenol in LIdanpaishi tablet by HPLC, find out the influential factors of uncertainty. Methods: to determinate the content of emodin and rhubarb phenol by using reveed-phase HPLC, according to relevant provisions in "the assessment and expression of uncertainty in measurement" JFL059-1999 and evaluate the uncertainty. Results: the uncertainty evaluation of emodin is 0.002%, rhubarb phenolic is 0.0015%. Conclusion: operate Strictly according to the standard so as to reduce the effection of dilution process, which can reduce effectively the introduced uncertainty and guarantee the accuracy of measurement results Keywords: LI DAN PAI SHI PIAN, Emodin, Rhubarb phenol, HPLC, Measurement uncertainty 一.前言 利胆排石片收载于《中华人民共和国药典》中.处方由大黄、金钱草等10 味中药材组成,具有清热利湿,利胆排石等功效,临床上用于湿热蕴毒、腑气不通 所致的胁痛、胆胀,症见胁肋胀痛、发热、尿黄、大便不通;胆囊炎、胆石症见上述证候者[1]。处方中大黄的主要有效成分是葸醌衍生物。具有破气除胀。消积导滞。和胃利胆等药效[2]。本文建立了同时测定利胆排石片中大黄索和大黄酚2种蒽醌类化合物含量测定的HPLC法,为利胆排石片的质量控制提供参考依据,建立HPLC测定法的不确定度评定方式. 2.综述 大黄素Emodin是一种羟基蒽醌类的衍生物,主要来源于蓼科植物掌叶大黄根茎,是中药大黄的主要有效单体,其化学名称为1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌1,3,8一trihydroxy-6-methyl-anthraquinone,其是分布最广泛的一种蒽醌类物质,从许多霉菌、地衣、高等植物及昆虫中均有发现[3],广泛存在于大黄的根茎、鼠李的树皮和根皮、决明的种子中。 大黄酚chrysophan01是蓼科Polygonaceae植物大黄体内的次生代谢物质,属游离蒽醌类化合物[4]。为大黄的有效成分之一,其化学名为l,8一二羟基-3甲基蒽醌1,8-dihydroxy-3methyl anthraquinone,主要来源于蓼科植物掌叶大黄根,巴天酸模根, 齿果酸模根,叶望洒南嫩根,种子,百合科植物黄金萱根,根茎。 测量不确定度是表征合理赋予测量的分散性与测量结果相关联的参数[5]。测量结果的可靠性很大程度取决于其不确定度的大小,不确定度越小,说明测量水平越高,测量结果使用价值越大。 本文根据(测量不确定度评定与表示)(JJF1059-1999)有关规定,对利胆排石片中用HPLC法测定大黄素和大黄酚含量的测量不确定度进行了分析,以期找出影响不确定度的因素,对不确定度进行评估。 2.1大黄素 2.1.1 大黄素的结构及性质 1.1.1结构 大黄素是由八个醋酸单位生物合成而来的[3],结果见下图 1.1.2物理性质 橙色针状晶体,熔点256~257?;不溶于水,能溶于乙醇,稍溶于乙醚、氯仿、苯,溶于苛性碱水溶液、碳酸钠溶液或氨溶液中并显樱红色。 2.1.2药理作用 1.2.1抑制胰酶作用 大黄素能抑制胰酶的分泌,对与急性胰腺炎发病直接有关的5种胰酶胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶、胰糜蛋白酶、胰激肽释放酶和胰脂肪酶具有明显的抑制作用[6] 1.2.2抗氧化及清除氧自由基的作用 大黄素还具有清除氧自由基的作用。大黄素对大鼠的脑匀浆脂质过氧化引起的极弱化学发光均有猝灭作用,构效关系提示大黄素邻位和中位羟基取代是该类物质抗氧化所必需的[7]。 1.2.3肝保护作用 展玉涛等[8]给大鼠皮下注射质量分数为40%CCl4制备肝纤维化模型,并以小、中和大剂量大黄 素治疗,通过放射免疫法测定大鼠血清透明质酸,结果显示大黄素组血清透明质酸明显低于模型组,认为大黄素能降低肝纤维化大鼠血清透明质酸[8] 。大黄素能减轻CCl4对肝细胞的损伤,对大鼠肝纤维化有治疗作用[9,10] 。 1.2.4对循环系统的作用 大黄素对多种血管有舒张作用,能抑制5-羟色胺对血管的收缩作用,协同乙 酰胆碱的舒张作用,其舒张作用与自由基或氢过氧化及cGMP增加有关。大黄素还可抑制血小板聚集,改善微循环,降低血液粘度[11]。 1.2.5抗癌作用 大黄素能增强抗癌药物5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和氨甲蝶呤对人肝癌BEL-7402细胞的细胞毒作用,并能部分逆转人乳腺癌细胞MCF-7/Adr:对阿霉素的抗药性[12] 。 2.2大黄酚 2.1物理性质 六方形或单斜形结晶乙醇或苯,熔点196?, 升华。几乎不溶于水, 略微溶于冷醇,易溶于沸乙醇, 溶于苯、氯仿、乙醚、冰醋酸及丙酮等,极微溶于石油醚。橙黄色片状体,熔点198?。 2.2药理作用 作为大黄的有效成分之一的大黄酚,其药理作用的文献报道却很少,仅限于传统的抗菌、泻下、止血等方面。大黄酚具有抗菌、缩短血液凝固时间、兴奋神经、麻痹肌肉、止咳、利尿、抗癌作用,特别是近年来研究表明,大黄酚能延缓衰老,能清除氧自由基,增强抗氧化能力和改善学习记忆障碍等作用[13]。但是大黄酚具有味苦、难溶于水、理化性质不稳定,遇光易氧化,对胃有一定的刺激性等不利因素。 2.3 大黄素、大黄酚的含量测定方法研究进展 测定方法有极谱法、紫外分光光度法、纸层析一分光光度法、薄层层析一分光光度法、比色法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、纸色谱法、荧光法等[14]。 3.1 高效液相色谱法 赵仁邦利用高效液相色谱法准确测定了何首乌中大 黄酸、大黄素、大黄素甲醚的含量[15]。其采用了70%甲醇超声提取浓缩后,用氯仿萃取分离出游离和结合 型的蒽醌,得到定量用试液。在439nm检测波长下,以甲醇:异丙醇:水80:10:lO磷酸调节pH为3.0为流动相,C18为固定相,采用HPLC法测定各种成分的含量。经过实验证明,该方法较传统的比色法等精密度更高,结果更准确可靠,产品的回收率高。. 3.2 分光光度法 孙小梅等[16]对大黄素的分光光度测定及其应用进行了研究。结果证明了光度法成相容易,分相迅速,操作简便,盐用量低,无毒性并且能得到高纯度的产品---大黄素,实际应用前景广阔。实验还发现,大黄素在NaOH溶液中的平衡是可逆的,溶液中pH的变化,导致共轭环上一OH的离解。当NaOH过量时,大黄素结构中蒽醌上3个羟基完全质子化,加上共轭环上有甲基的推电子作用,共轭体系内电子云流动增加。电子跃迁所需能量降低,吸收光谱红移,而且最大吸收波长稳定在530nm。当提高酸度,一0一得质子,溶液又恢复至黄色,反应前后,大黄素结构未发生变化。根据这一原理建立了一种光度分析大黄素的新方法--Tween80一NH42S04液一固萃取体系。 3.3 高效薄层光密度法 库尔班江[17]在硅胶高效薄层色谱板上利用高效薄层光密度法测定了牛黄解毒丸中大黄素的含量。其经过硅胶薄层层析在展开剂甲苯一乙酸乙酯一甲酸15:2:1下,可以使大黄素斑点清晰完整,与其他成分的斑点分辨显著,并且在甲醇一氯仿1:1混合溶剂中得到游离的大黄素。结果证明该方法具有简便、快速,重现性好,回收率高, 高效薄层色板板间误差小,精密度高,测定结果准确可靠的优点。 3.4 反相高效液相色谱法 张丹等[18]利用反相高效液相色谱法测定了大 黄药材中游离及结合型蒽醌类衍生物的含量。其采用的色谱条件为:色谱柱Hypersil C18柱250mm*4.6mmi.d.,10μm,流动相为甲醇一乙腈一水3:5:2,磷酸调pH2.8,流速为1.0ml/min,柱温为25?,检测波长为225nm。经过实验证明此种方法简便、快速、准确,可以用于大黄药材及 其制剂的质量评定。但是对于其他的药材是否适用,还需要进一步验证。 2.4.不确定度分析 4.1 不确定度来源 在实际工作中,结果的不确定度有许多来源,如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和仪器不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定,以及随机变化。 刘永利等[20]对复方丹参片中HPLC法测定丹参酮含量的测量不确定度进行了分析,影响不确定度的因素主要为样品不均匀性,并提出在分析测定时应加以严格控制,可以采取合理的取样方式、将样品研细过筛来控制。 饶毅等[21]对HPLC法测定大豆异黄酮的不确定度评定中指出不确定的主要影响因素是稀释过程中带来的不确定度,可以采用较大容器来配制溶液来控制。 陈建琴[22]对HPLC法测定苯巴比妥东莨菪碱片含量的测量不确定度评价中指出测量结果的不确定度主要来源于仪器进样重复性,因此在实验中应严格规范操作,控制好对测定有最大影响的不确定度分量。 胡震[23]等采用HPLC-DAD方法同时测定了重要栀子中栀子苷,藏红花素及绿原酸三种主要成分的含量,并对测定结果进行不确定度评定,指出样品的均匀性,分析方法的精密度和准确性对测试结果影响最大。因此提出在样品浓度校 正要稳定,在检测限内进行检测。 范能全,彭兰[24]对HPLC法测定青霉素V钾片含量的不确定评价中对各个不确定度分量进行量化,提出了该法的合成不确定度评估结果,指出称样量是测定结果的最主要影响因素。 4.2 不确定度的分量[19] 不确定度可分为不确定度、合成不确定度、扩展不确定度。其中标准不确定度是指以标准差表示的测量不确定度。合成标准不确定度是指当测量结果是由若干个其他量的值求得时,按其他各量的方差或(和)协方差算得的标准不确定度。扩展不确定度是指确定测量结果区间的量,合理赋予被测量之值分布的大部分可望含于此区间。 4.3 不确定度的评定方法[19] 不确定度的评定方法可分为A类评定方法和B类评定方法。 4.4 测量不确定度评定程序[19] 建立评定模型(测量数学模型),标准不确定度的A类评定,标准不确定度的B类评定,合成标准不确定度的确定,扩展不确定度的确定,报告不确定度。测量不确定度的评估过程如下: 第一步:规定被测量,第二步:识别不确定度的来源,第三步:不确定度分量的量化,第四步:计算合成不确定度 三 3、实验部分 3.1主要仪器与试剂 实验仪器:液相色谱仪:安捷伦高效液相色谱系统,填料:Sinochrom ODS-BP4.6×200nm,5um, CP225D型电子天平德国Sartorius公司,分度值为0.01mg。大黄素、大黄酚对照品(批号分别为518-82-1、481-74-3,中国药品生物制品检定所) 利胆排石片供试品:河南广宇博科生物制药有限公司 批号:国药准字Z41021088 甲醇为色谱纯,水为超纯水,磷酸,三氯甲烷 其他试剂均为分析纯。 3.2 方法与结果 3.2.1 色谱条件以及确定 刘意[25] HPLC法同时测定利胆排石片中4种蒽醌类成分的含量,其中以色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BP柱4.6mm×200mm,5μm,流动相为甲醇:0.1%磷酸溶液80:20,v/v,流速为1.0mL?min-1,检测波长为254nm,柱温为室温。进样量为10μl。精密度实验大黄素RSD1.3%, 大黄酚RSD1.1%,重现性试验大黄素RSD1.2%,大黄酚RSD0.6,回收率平均率大黄素RSD1.3%, 大黄酚RSD100.4%,大黄酚RSD100.0%,该法操作简便易行,快速、灵敏。 刘善新[26] HPLC法测定复方大黄利胆片中大黄素、大黄酚的含量,其中以:LichmspherCl8柱4.6mm*150mm5μm为色谱柱,流动相:甲醇:0.1%磷酸溶液85:15,流速:1 mL?min-1,检测波长254 nm,柱温30?。理论塔板数按大黄素峰计算不低于3 000。在0.0412~0.2060 μg范围内线性关系良好,平均回收率为97.17%.RSD为1.03%,大黄酚在O.08176~0.4088 μg范围内线性关系良好,平均回收率为97.37%,RSD为1.28%。该方法简便、准确、重复性好,可作为该制剂含量测定方法。 3.2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备:分别精密称取大黄素对照品2.22mg和大黄酚对 照品1.95mg置10 mL量瓶中,加三氯甲烷1mL,振摇使溶解,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得大黄素对照品储备液和大黄酚对照品储备液。分别取大黄素、大黄酚对照品储备液各1 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成混合对照品储备液,大黄素和大黄酚的浓度分别为22.2μg?ml-1、19.5μg?ml-1 。 2.2.2供试品溶液的制备:取本品粉末适量,精密称定为0.1536g,置25mL量瓶中,精密加入甲醇25mL,超声30min,放冷,再用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过。精密量取续滤液5mL,置蒸发皿中,挥去溶剂,加8%的盐酸溶液10mL,超声处理5min,再加三氯甲烷10mL,置分液漏斗中。用少量三氯甲烷洗涤容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷层,酸液再用三氯甲烷提取2次.每次10mL.合并三氯甲烷液,减压回收溶剂至干。残渣加三氯甲烷1mL使溶解,转移至10mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得供试品溶液。 3.2.3线性关系考察 精密吸取对照品1.0μL,2.5μL,5.0μL,7.5μL,10.0μL,12.5μl分别进样,得不同体积对应的峰面积。以体积V为横坐标,峰面积A为纵坐标。用Excel做图,得大黄素回归曲线方程为:A93.418V-5.5528,R1,大黄酚回归曲线方程为:A70.732V-2.6695,R1。 3.2.4精密度试验 取同一浓度对照品溶液,在上述色谱条件下。重复进样6次,计算大黄素和大黄酚的色谱峰面积的RSD分别为1.57%和1.90%,结果表明,仪器精密度良好。 3.2.5 供试品含量测定 用进样针取供试品溶液10μL,测得其大黄素的峰面积为17.9代入回归曲线方程中,得到其相应的体积为0.25μL,相当于在10μl进样量里有对照品溶 液0.25μL,换算成质量为0.032mg,大黄素在利胆排石片中的含量为0.021?。测得大黄酚的峰面积为14.4代入回归曲线方程中,得到其相应的体积为0.24μL,相当于在10μl进样量里有对照品溶液0.24μL,换算成质量为0.020mg,大黄素在利胆排石片中的含量为0.016?。 图1 大黄素标准曲线 图2 大黄酚标准曲线 表1 大黄素、大黄酚混合对照品线性考察取的体积与峰面积情况 序号 1 2 3 4 5 6 X体积(μl) 1 2.5 5 7.5 10 12.5 Y峰面积(A) 大黄素 89.4 228.4 460.5 692.9 926.9 1165.7 大黄酚 68.5 173.9 351.2 527.6 703.9 881.7 表2 精密度考察项混合对照品大黄素、大黄酚测定峰面积情况 序号 1 2 3 4 5 6 Y峰面积(A) 大黄素 925.6 921.6 924.7 925.2 924.3 926.7 大黄酚 705.8 706.6 707.9 707.8 706.1 702.2 图3 大黄素、大黄酚混合对照品HPLC图 图4 供试品HPLC图 3.2.6 重复性试验 取同一厂家的样,按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液,在上述色谱 条件下,进样分析,计算大黄素和大黄酚含量的RSD分别为0.69%和0.43%。结果表明,方法重复性良好。结果见表3 表3 供试品中大黄素、大黄酚含量测定峰面积情况 序号 1 2 3 4 5 6 Y峰面积(A) 大黄素 15.9 16.4 16.6 15.5 17.4 17.3 大黄酚 14.2 14.8 14.7 14.3 14.1 13.7 3.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于0、2、4、6和8h,在上述色谱条件下,进样分析,计算大黄素和大黄酚色谱峰面积的RSD分别为0.27%、0.19%。结果表明,样品溶液在8h内稳定。结果见表4 表4供试品稳定性实验中大黄素、大黄酚含量测定峰面积情况 序号 0 2 4 6 8 Y峰面积(A) 大黄素 17.6 17.3 17.9 17.4 17.1 大黄酚 14.4 14.7 14.9 14.5 14.8 3.2.8加样回收率实验取已知含量的供试品粉末6份,每份O.075g.精密称定,分别加入低、中、高3个浓度的混合对照品储备液,按“2.2.2”项下方法操作.制备供试品溶液,每个浓度2份,进样分析。大黄素、大黄酚的平均回收率分别为100.4%RSD0.4%,100.0%RSD0.9%.结果见表5。 表5 加样回收率试验结果 取样量 /g 样品含量/μg 加入量 /μg 测得量 /μg 回收率 平均回收率/% RSD /% 大黄素 0.07201 42.87 90.90 133.9 100.1 100.4 0.4 0.07101 42.27 90.90 133.5 100.4 0.07562 45.01 181.8 134.9 100.6 0.07509 44.70 181.8 225.5 99.7 0.07263 43.23 272.7 316.6 100.6 0.07209 42.91 272.7 317.9 100.8 大黄酚 0.07201 135.8 33.60 169.5 100.3 100.0 0.9 0.07101 133.9 33.60 167.9 101.0 0.07562 142.6 67.20 210.1 100.4 0.07538 142.2 67.20 209.8 100.7 0.07238 136.5 100.8 235.9 98.6 0.07209 136.0 100.8 235.6 98.9 四 4、不确定度的评定 依据《测量不确定度评定与表示》(JJF1059-1999)进行不确定度评定。 采用数学模型不确定度//0>.///. ,其中mi为对照品的质量,As为样品的峰面 积,Vs为样品稀释体积,Ai为对照品的峰面积,Vi为对照品的稀释体积,Ms为样品 的称样量。 4.1 不确定度分量的分析 被测样品的不确定度包括对照品峰面积的不确定度、对照品溶液的不确定度、样品峰面积的不确定度、样品溶液不确定度这4个方面。其中对照品溶液的不确定度包括标准物质纯度的不确定度uPi、称量天平带入的不确定度u(Mi)和配制对照品的不确定度u(Vi)3个方面,样品溶液的不确定度包括称量天平带入的不确定度uMi、配制对照品的不确定度u(Vi)2个方面。 4.1 .1对照品质量的相对不确定度 对照品质量的相对不确定度u(Mi)主要有3个来源,包括: (1)对照品纯度的不确定度uPi:大黄素、大黄酚对照品用HPLC法测定时配制时未给出限度标识,所以此项影响因素可以不做考虑 (2)称量天平示值带入的不确定度uMi1:电子天平经检定为1级,天平称量允差为0.1mg,则标准扩展不确定度U0.1mg(k2),按正态分布换算成标准偏差为0.1/20.05mg 3称量由天平重复性带入的不确定度u(Mi2),根据天平的检定书重现性标准偏差为0.05mg。 从而得出合成标准不确定度u(Mi) [u2Mi1+ u2(Mi2)]1/20.052+0.0521/20.071mg, 相对标准不确定度中大黄素为u(Mi)/Mi0.071/2.223.20%。大黄酚为u(Mi)/Mi0.071/1.953.64% 1.2配制对照品用玻璃器皿带入的相对不确定度 配制大黄素、大黄酚对照品时由玻璃器皿带入的相对不确定度u(Vi):Vi Vi1. Vi2/ Vi3,主要由移液管和量瓶引起。 1.2.1配制大黄素对照品用玻璃器皿带入的相对不确定度u(Vi) (1)10mL量瓶u(Vi1)来源主要有三种:?校准u(Vi11):根据国家计量检 定规程规定,A级10.0ml单标线移液管示值允差0.1ml,认为服从矩形分布,取包 含因子k31/2,则u(Vi11)0.1/31/20.058 mL;?重复性u(Vi12):重复测定10次 得出u(Vi12)0.0078ml,?温度:由于本实验温度与校准温度相同,此项因素可以 不做考虑。所以u(Vi1)的值为u(Vi1)[u2(Vi11)+ u2(Vi12)]1/20.0582+0.007821/20.059mL。 (2)1mL移液管u(Vi2)主要来源有三种:?校准u(Vi21):A级1ml单标线 移液管示值允差为0.007mL,取k31/2, u(Vi21)0.007/ 31/20.004mL ;?重复性 u(Vi22):通过10次测定得出u(Vi22)0.0060ml;?温度:由于本实验温度与校准 温度相同,此项因素可以不做考虑。所以u(Vi1)的值为u(Vi1)[u2(Vi21)+ u2(Vi22)]1/20.0042+0.006021/20.007mL。 因此大黄素对照品合成标准相对不确定度为 u(Vi)/Vi [u(Vi1)/ Vi1]2+ [u(Vi2)/ Vi2]2 1/2 0.059/102+0.007/121/20.70% 1.2.2配制大黄酚对照品用玻璃器皿带入的相对不确定度u(Vi) (1)10mL量瓶u(Vi1)来源主要有三种:?校准u(Vi11):根据国家计量检 定规程规定,A级10.0ml单标线移液管示值允差0.1ml,认为服从矩形分布,取包 含因子k31/2,则u(Vi11)0.1/31/20.058 mL;?重复性u(Vi12):重复测定10次 得出u(Vi12)0.0095ml,?温度:由于本实验温度与校准温度相同,此项因素可以 不做考虑。所以u(Vi1)的值为u(Vi1)[u2(Vi11)+ u2(Vi22)]1/20.0582+0.009521/20.059mL。 (2)1mL移液管u(Vi2)主要来源有三种:?校准u(Vi21):A级1ml单标线移液管示值允差为0.007mL,取k31/2, u(Vi21)0.007/ 31/20.004mL ;?重复性u(Vi22):通过10次测定得出u(Vi22)0.0045ml;?温度:由于本实验温度与校准温度相同,此项因素可以不做考虑。所以u(Vi2)的值为u(Vi1)[u2(Vi21)+ u2(Vi22)]1/20.0042+0.004521/20.006mL。 因此大黄酚对照品合成标准不确定度为 u(Vi)/Vi [u(Vi1)/ Vi1]2+ [u(Vi2)/ Vi2]2 1/2 0.059/102+0.006/121/20.84% 1.3混合对照品测得的峰面积的相对不确定度u(Ai) 1混合对照品6次进样重复测得大黄素量的标准不确定度按贝塞尔公式计算s[ /n-1]1/21.72,则相对不确定度u(Ai)s/A1.72/934.680.19% 。 2混合对照品6次进样重复测得大黄酚量的标准不确定度按贝塞尔公式计算s[ /n-1]1/22.08,则相对不确定度u(Ai)s/A2.08/706.070.29% 。 1.4 供试品质量的不确定度u(Ms) 供试品质量的不确定度u(Ms)来源有2个:?一个是电子天平称量示值的不确定度uMs1):天平称量允差为0.1mg,则标准扩展不确定度U0.1mg(k3),按正态分布换算成标准偏差为u(Ms1)0.1/30.033mg;?另一个是电子天平称量重复性的不确定度u(Ms2):根据天平检定书重复性标准偏差为 0.05mg,u(Ms2)0.05mg。 因此合成不确定度为u(Ms)[u2(Ms1)+ u2(Ms2)]1/20.0332+0.00521/20.060mg,相对不确定度u(Ms)/ Ms0.060/153.60.04%。 1.5 配制供试品用玻璃器皿带入的相对不确定度U(Vs) (1)10mL量瓶U(Vs1)来源主要有三种:?校准U(Vs11):根据国家计量检 定规程规定,A级10.0ml单标线移液管示值允差0.1ml,认为服从矩形分布,取包 含因子k31/2,则u(Vs11)0.1/31/20.058 mL;?重复性U(Vs12):重复测定10次 得出U(Vs12)0.0078ml,?温度:由于本实验温度与校准温度相同,此项因素可以 不做考虑。所以u(Vs1)的值为u(Vs1)[u2(Vs11)+ u2(Vs12)]1/20.0582+0.007821/20.059mL。 (2)25mL量瓶u(Vs2)主要来源有三种:?校准u(Vs21):A级25ml单标线 移液管示值允差为0.030mL,取k31/2, u(Vs21)0.030/ 31/20.017mL ;?重复性 u(Vs22):通过10次测定得出u(Vs22)0.021ml;?温度:由于本实验温度与校准温 度相同,此项因素可以不做考虑。所以u(Vi1)的值为u(Vs1)[u2(Vs21)+ u2(Vs22)]1/20.0172+0.02121/20.027mL。 (3)5mL移液管u(Vs3)主要来源有三种:?校准:A级5ml单标线移液管示 值允差为0.015mL,取k31/2, u(Vs31)0.015/ 31/20.009mL ;?重复性:通过10次测定得出u(Vs32)0.0013ml;?温度:由于本实验温度与校准温度相同,此项因 素可以不做考虑。所以u(Vs3)的值为u(Vs3)[u2(Vs31)+ u2(Vs32)]1/20.0092+0.001321/20.009mL。 (4)10mL移液管u(Vs4)主要来源有三种:?校准:A级1ml单标线移液管 示值允差为0.100mL,取k31/2, u(Vs41)0.100/ 31/20.058mL ;?重复性:通过 10次测定得出u(Vs42)0.032ml;?温度:由于本实验温度与校准温度相同,此项 因素可以不做考虑。所以u(Vs4)的值为u(Vs4)[u2(Vs41)+ u2(Vs42)]1/20.0582+0.03221/20.066 mL。 (5)1mL移液管u(Vs5)主要来源有三种:?校准u(Vs51):A级1ml单标线 移液管示值允差为0.007mL,取k31/2, u(Vs51)0.007/ 31/20.004mL ;?重复性 u(Vs52):通过10次测定得出u(Vs52)0.0045ml;?温度:由于本实验温度与校准 温度相同,此项因素可以不做考虑。所以u(Vs5)的值为u(Vi1)[u2(Vs51)+ u2(Vs52)]1/20.0042+0.004521/20.006mL。 因此供试品的合成相对标准不确定度为u(Vs)/Vs [u(Vs1)/ Vs1]2+ [u(Vs2)/ Vs2]2+ [u(Vs3)/ Vs3]2+ [u(Vs4)/ Vs4]2 + [u(Vs5)/ Vs5]2 1/2 0.059/102+0.027/252+0.009/52+0.066/102+0.006/121/20.01% 4.7 供试品测得的峰面积的相对不确定度 供试品测得的峰面积的相对不确定度u(As):供试品6次重复测定结果的 标准不确定度按贝塞尔公式计算 S大黄素[/n-1]1/20.75,因此相对不确定度u(As)s/A 0.75/16.524.55% 。 s大黄酚[/n-1]1/20.40,因此相对不确定度u(As)s/A 0.40/14.32.83% 。 4.8合成不确定度 大黄素合成不确定度[u2(Mi)+u2Vi+ u2Ai+ u2Ms+ u2As+ u2Vs]1/2 3.2%2+0.7%2+0.19%2+0.04%2+0.01%2+4.55%1/20.056 大黄酚合成不确定度[u2(Mi)+u2Vi+ u2Ai+ u2Ms+ u2As+ u2Vs]1/2 3.64%2+0.84%2+0.29%2+0.04%2+0.01%2+2.83%1/20.047 4.9 扩展不确定度 扩展不确定度:取包含因子k2,则利胆排石片中大黄素扩展不确定度为 UrS0.021%*0.056*20.002%,大黄酚扩展不确定度为 UrS0.016%*0.047*20.0015% 。 4.10 测量不确定报告 质量分数测定的结果可表示为大黄素含量(0.021+0.002)%,大黄酚含量(0.016+0.002)% 5、实验结果讨论 五 研究结果及讨论 由于被测样品为片剂,主成分测定过程中受辅料和杂质的影响,且其样品非均匀性引入的不确定度可忽略,样品测定前进行了120?烘干处理,用电子天平称量后,放入容量瓶中加入适量甲醇在超生设备中超声30min,但仍然有部分物质未被溶解,后面又做了一次同样的试验,还是有部分物质不溶解,最后过滤了才可以进样。方铁铮[6]做了这方面的试验,比较了回流提取法、索式提取法、超声提取法对芦丁的提取效率,索式提取较好,但试验条件有限只进行了超声提取方法法操作。本测定方法采用混合对照品比较法,由于配制的样品与对照品的质量浓度相近,其峰面积响应中可能的非线性引入的不确定度可忽略。环境温度、环境湿度的随机变化对质量、峰面积会带来影响,其不确定度纳入称量重复性、进样重复性中,因样品和对照品几乎为同时操作,故环境温度湿度的系统影响而可忽略。 由于本实验中使用的天平和量瓶的精密度较高,不确定度均参考检定和实验的数据,未采用最大允差,且称量接近、操作简单,不包括人为过失误差,故不确定度较小。由于HPLC仪本身对测定结果的影响因素很多,难以一一评估。又因为在实际测定中,HPLC仪误差引起的不确定度已体现在色谱峰面积的测量结果中, 所以对HPLC仪的体积流量、流量精度和进样精密度等各因素的不确定度分量不作另行细化讨论。实验未进行回收率的不确定度评定,并以回收率对检测结果进行修正,因为回收率测得值的离散度是包含在测量结果离散度内的,且用回收率修正结果,不仅会重复评定,而且会脱离实分析评估不确定度时,应尽量考虑到产生不确定度的所有来源,因为合成不确定度的数值几乎完全取决于重要的不确定度分量。根据上述评定可得,HPLC按外标法测定含量时,增加测定次数、选用较大的定容体积、增加对照品取样量均可以减少各步骤的不确定度分量,从而提高测定结果的准确性和可信度。 对照品溶液的配置和供试品处理最后一步处理过程中,发现大黄素和大黄酚2种蒽醌类化合物在纯甲醇中溶解度差。所以先用少量三氯甲烷将其溶解,再用甲醇定容,这样大黄素和大黄酚都获得了较好的溶解度。又不会损伤色谱柱。 六 结束语 参照不确定度测量方法的文献和不确定度来制定研究HPLC法测定利胆排石片中大黄素和大黄酚含量不确定度的试验,主要用在高效液相色谱法测其含量,再用不确定度分析方法对测量得到的各项数据进行处理,最终得出不确定度的值域。不确定度的评定对于合理判定定量测定结果分散性有重要意义。HPLC按外标法测定含量时,增加测定次数、选用较大定容体积,增加对照品取样量均可以减少各步骤的不确定分量,可以提高药品检验结果的准确性和可性度。 随着医药行业的不断发展,人民生活水平的不断提高,健康得到保障。药品检测结果是判定药品是否合格的依据。测量药品的不确定度队药品的标准有指导意义。随着科技的发展,应拓展的不同领域而HPLC法只是一种较为准确的方 法。要树立科学认真的态度,认真切实保障人民用药安全。 七.致谢 通过对利胆排石片中大黄素和大黄酚含量测定以及对其不确定度进行分析,学会了采用高效液相色谱法来测量物质的含量,实验要求有客观严谨的求真务实态度,在对结果的分析采用的是不确定度的分析方法,这种分析方法是在课堂里没有领会到的全新方法,做过实验之后让我有更加认真严谨的态度面对生活和工作。 我能顺利完成此论文,感谢吴杰连老师对我做论文的大力帮助和指导!并感谢周庆颂老师对我试验的指导!以及感谢学院的领导和各位老师的关怀和教育!并致以崇高的敬意! 参考文献 [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社。2005:473. 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