狂犬疫苗研究进展

狂犬疫苗研究进展 生物制药技术新进展论文 题 目 : 狂犬疫苗研究进展 作 者 王磊 完成日期 2012 年 11 月 20 日 学 院 化学工程学院 指导教师 穆畅道 专 业 制 药 工 程 学 号 2012223070127 狂犬疫苗研究进展 。 摘要:狂犬病系病毒性疾病，临床经过凶险，发病者几乎100%死亡, 至今尚无特效药物可以治愈。但狂犬病毒在动物脑组织连续传代后，可获得毒力减弱的固定毒，用固定毒制备的狂犬疫苗，可有效地防治狂犬病。因此, 接种狂犬疫苗就成了人类征服狂犬病的一种重要手段。本文综述了狂犬病毒抗原结构、狂犬疫苗、狂犬疫苗的不良反应、不良反应的处理原则、不良反应的预防，帮助人们更全面了解狂犬疫苗。 关键词:狂犬病，疫苗，预防 1狂犬病毒抗原结构的研究概况 1.1狂犬病毒有五种结构蛋白 (1)包膜糖蛋白(2)核蛋白(3)膜蛋白(4)膜蛋白(5)多聚酶。其中以包膜糖蛋白和核蛋白为主要抗原结构。包膜糖蛋白抗原是嵌在病毒表面的突起, 每个病毒约有突起1072-1451个。包膜糖蛋白抗原具有免疫原性和抗原特异性，它能诱生中和抗体，是制备疫苗的重要抗原成分。核蛋白抗原是狂犬病毒刺激T细胞产生细胞免疫的主要抗原。核蛋白抗原较稳定。 1.2 狂犬病毒可通过鼻分泌物在动物中传播 沈定霞等对我国狂犬病毒北京株和国际株(CVS株)的抗原定位进行比较研究，发现两病毒在小鼠脑内的抗原分布相当广泛，主要分布在嗅球、海马及大小脑中。其中嗅球中狂犬病毒抗原出现最早，数量又多，并可通过嗅神经传播到鼻粘膜，随分泌物向外扩散。认为这对狂犬病毒在动物中的传播，起着重要作用。这是狂犬病毒通过唾液传播学说以来的最新学说。 1.3病毒在中枢神经内移行，不受抗血清和疫苗干预 法国巴斯德研究所Tsiang博士介绍，对大鼠背部感觉神经节体外感染狂犬病毒，证明病毒在神经细胞内移行速度为1mm/h, 且不受细胞外中和抗体的干预, 表明病毒一旦侵入神经轴索和神经细胞，再用疫苗和抗血清防治，均不奏效，提示疫苗和抗血清接种宜早, 细胞免疫值得研究。 ? 2狂犬疫苗研究的若干进展 2.1细胞培养狂犬疫苗 细胞培养狂犬疫苗相继出现包括:人二倍体细胞疫苗(HDCV)、恒河猴二倍体细胞疫苗 (RDRV), 原代胎牛肾细胞疫苗(FBKCV)、原代地鼠肾细胞疫苗(PHKV)、纯化鸭胚细胞疫苗(PDEV)和vero细胞疫苗(PVRV)。由于PDRV、FBKCV、PCECV、PDEV临床应用尚少, 或未投入批量生产, 故从略，仅重点介绍HDCV、PHKV和PVRV。 2.1.1人二倍体细胞狂犬疫苗 自1884年法国巴斯德获得狂犬固定毒而制备疫苗以来，历经近百年，虽方法上略有改进，但本质上仍多沿用脑组织来制备疫苗。实践证明，预防狂犬病疫苗起了主要作用。它的缺点是注射针次过多，局部及全身反应较重，甚至可引起脑及脊髓组织损害的变态反应。其发生率为1/10000-1/3000，甚至可高到1/50。1955年Peek等研制成鸭胚疫苗, 可是疫苗免疫后的抗体滴度较低，而且仍有脑脊髓变态反应, 所不同者是脑脊髓变态反应发生率较低, 估计为1/25000。因此，狂犬疫苗的改进成为迫不及待的问题。七十年代前后研制了人两倍体狂犬病疫苗(HDCV)，注射针次少, 局部反应轻微, 免疫效果良好。现将国外研制该疫苗的概况, 动物试验及人体接种结果作一简要介绍。 2.1.1.1狂犬病毒对人两倍体细胞(HDC)的适应 狂犬病毒是嗜神经细胞的病毒, 要适应到以成纤维细胞为主的HDC上, 有一定的困难。Wiktor等间首先报导了狂犬固定毒可以感染HDC，但若用已接种病毒的培养液或细胞提取液在同种细胞上传代，则滴度逐渐下降, 最多传至4-7代即行消失, 不能继续传代，为探索其原因，他们用萤光抗体测定法，观察到HDC感染狂犬病毒后, 仅极少数细胞被感染。因此，证实用上清液或细胞提取液不可能进行传代。以后他们根据狂犬病毒在细胞内复制繁殖较慢, 尤其是病毒由细胞中释放出来系属于芽生方式，很难顶破细胞膜进入培养液而引起HDC再感染，从而改变了传代方法。 具体做法是将狂犬病毒感染HDC后, 培育3-4 天, 用HDC本身的传代方法进行传代, 由细胞自身的分裂逐步扩大感染, 这样传至6代被感染的细胞明显增多。传代时必须用胰酶分散细胞, 若用乙二胺四乙酸二钠(Versene)则感染细胞不能逐代增多，甚至下降，最后消失。这是因为胰酶能破坏影响狂犬病毒繁殖的干扰素, 还是其他原因, 仍不太清楚。他们还发现随着代次的增长, 细胞浆内的嗜伊红性及多形性包捆体逐渐增多增大，传至20代左右这种包涵体儿乎布及所有细胞而连成片，细胞由此完全裂解而使细胞不能继续传代。若用传至15代左右的上清液或细胞提取液在健康人两倍体细胞上感染传代，则仍然传不下去。只有每代将感染细胞与健康细胞进行馄合传代，才能使病毒在细胞上传下去。一直传至第47代， 再用上清液或细胞提取液，就可在健康细胞上进行传代。这说明病毒在HDC内复制后, 已能自由释出胞外而引起细胞的再感 染，这样狂犬病毒就能完全适应于HDC，为疫苗的制备创造了条件。 2.1.1.2疫苗的制备 Wiktor等用已适应了的狂犬病毒接种于已成片的HDC上, 每毫升加入50μg的DEAE-Dextran ( 它是一个多价阳离子，可能与病毒形成复合物而促使易于吸附于细胞，或者使病毒易于穿透入胞内)，吸附1小时后，移去接种液，用温PBS洗一次, 加入含0.3 %牛白蛋白(BSA)的Eagles液，培育于32-33?三天，用胰酶将感染细胞分散，并按1:6的比例加入未感染的分散细胞，接种入细胞瓶内，营养液为含10 %灭活小牛血清的Eagles液，在35?培育三天而收获。灭活系用β-丙内脂、紫外线与磷酸三丁酷(Tributyl Phosphote)等。多数用β-丙内脂，按最后浓度为0.025 % 加入病毒液内，在4O?放8小时，为安全起见，一般在4?灭活20小时, 接着在37?水解β-丙内脂2小时或加入硫代硫酸钠停止其作用。浓缩提纯系用醋酸锌沉淀，超速离心或超过滤，后者系使用0.02-0.01μ孔径的薄膜，可浓缩40-200倍，病毒量及抗原性均很少损失，因此，大多数文献报导均采用此法浓缩。 2.1.2原代地鼠肾细胞狂犬疫苗 原代地鼠肾细胞狂犬疫苗(PHKV)1971-1977年曾在加拿大和前苏联试用，经6万名被疯动物咬伤者接种，仅2例发生狂犬病，初步证明PHKV高效安全，且无严重神经系统并发症1981年我国开始推广PHKV，当年湖北鄂城市农村发生一起狂狼咬伤31人的恶性事件, 经及时注射PHKV无1人死亡, 获得完全保护效果。1987年湖北沙市等三市(县)又发生3起狂犬集中咬伤97人事件，由于处理及时，对咬伤严重者给予PHKV加量注射，同时配合HRlg,追踪观察1.5年， 也全部免于狂犬病。还有不少类似报道，均对PHKV的免疫效果持肯定态度，认为在安全有效、副作用轻微方面，与HDCV相近。但也存在着褒贬不一的情况，?地鼠来源困难, 疫苗产量低，从长远看难以满足我国需要;?抗原性和免疫原性不强，5针免疫后产生的中和抗体水平较低， 保护时间短，需增加剂量和改进免疫程序，才能产生高滴度抗体水平;?对短潜伏期患者无保护作用，对严重咬伤者“免疫失败”病例较多。因此认为，PHKV疗效远不如HDCV。 2.1.3vero细胞狂犬疫苗(PVRV) 2.1.3.1vero细胞狂犬疫苗的突出优点 vero细胞狂犬疫苗(PVRV)是法国Merieux研究所产品。vero细胞具有来源方便，可在微 载体上高密度生长，能大量生产的突出优点。10万次接种表明PVRV对狂犬病接触前(即对健康人的预防接种)的抗体反应，略高于HDCV对接触后(被疯,犬咬伤者)，则略低于HDCV。对106名被疯动物咬伤者, 于0、3、7、14、28、和90天接种PVRV各0.5ml，对其中47名严重咬伤者同时注射HRlg免疫后中和抗体水平与HDCV相似，有效杭体水平可维持1年以上。由于PVRV高效安全，副作用轻微，又易制备，是日前WHO建议推广, 井大量生产的新型狂犬疫苗。 2.1.3.2vero细胞狂犬疫苗制备 (1)发酵罐细胞培养 以146代的Vero细胞接种于生物反应器中进行微载体培养。发酵参数为:温度37?，pH 7. 2，溶氧50%空气饱和度，搅拌速度50 r/min。Vero细胞接种到7L发酵罐中, 培养体积4 L。共培 养了3次( 2003001批、2003002批、2003003批,微载体加量分别为3、4、6 g/L)。每批均采用灌流法进行培养,根据细胞的密度调整灌流量,培养液灌流量为0,100 ml /h。 (2)发酵罐病毒培养 每批细胞培养结束后，更换培养液，加入病毒维持液，接种aG株病毒,病毒感染量(multip licity of infection, MO I)为0. 1，培养体积4 L。发酵参数设定为:温度35?, pH7. 4溶氧20%空气饱和度,搅拌速度50 r/min。采用灌流培养，每天取样检测病毒滴度。培养13d后结束。从病毒培养第5d开始收获病毒液，每批收获病毒液18 L。 (3)转瓶细胞培养 146代的Vero细胞接种于2 L转瓶，加入150 ml细胞培养液,于37 ?培养。 (4)转瓶病毒培养 细胞长成单层后，倾弃培养液。加入150 ml病毒培养液，接种病毒种子，于35 ?培养，5 d后收获病毒液，再加入150 ml病毒培养液继续培养, 3d后收获病毒液，再次加入150 ml培养液，3 d后再收获1次。每个转瓶共收获450ml病毒液。用10个转瓶进行了细胞及病毒培养，结束后共收获4500 ml病毒液，经过合并、灭活等后处理工艺，得到试验苗。 (5)病毒滴定 收获的病毒液，用含2%牛血清的蒸馏水作10倍比稀释，取-4、-5、-6、-7稀释度分别接种6只小鼠，每只脑内接种0. 03 ml,小鼠半数致死量计算方法为Reed2Muench。 2.1基因工程疫苗 基因工程疫苗是狂犬疫苗研究中最活跃的领域， 近年来各国学者都在致力于狂犬病基因 即将狂犬病毒包膜糖蛋白插入到大肠杆菌、酵母菌、痘苗病毒和腺病毒等的工程疫苗的研究， 基因组中表达，以期获得更高效的重组狂犬疫苗，但早期研究，未获满意效果。直到1984年，美国wistar研究所与法国Transgene公司合作研制出狂犬病毒搪蛋白重组痘苗病毒，才打开局面。目前, 这方面的研究主要取得两项进展:一是将狂犬病毒糖蛋白插入弱毒的痘苗病毒基因组中表达成功, 得到狂犬病毒糖蛋白重组痘苗病毒(简称重组病毒)。用此重组病毒免疫动物，如小鼠，豚鼠和家兔，已发现能够诱生高滴度中和抗体，比常规疫苗高出10倍以上。免疫后28天, 用狂犬病毒标准株(CVS)，以及其他株，对上述动物作脑内、肌肉内以及胃内致死量攻击，结果不仅可使它们免于狂犬病，并显示对不同毒株有交叉保护作用。动物试验初步证明，用重组病毒制备狂犬疫苗前景可观。二是把狂犬病毒糖蛋白插入狗腺病毒基因组中表达成功。得到狂犬病毒糖蛋白重组腺病毒，并可制成口服疫苗而倍受青睐。但以上两种重组病毒均处于动物试验阶段，还由于担心痘苗病毒会酿成天花流行，暂时未付诸临床应用。目前，我国将狂犬病毒糖蛋自插入弱毒的北京株痘苗病毒，取得重组病毒v- RG422株，在激发高滴度抗体和免疫动 物方面, 均取得与国外报告近似的结果。 2.3神经组织疫苗(NTV) 神经组织疫苗(NTV)经不断改进，疗效提高，副作用减少。用成年动物脑组织制备NTV， 已反复证明副作用大，现在生产的NTV多用哺乳动物脑组织，可减少以上缺点，此外，灭活疫苗一般认为优于活疫苗，1967 ~ 1971 年，美国比较了数批活疫苗与灭活疫苗在420只犬身上的效果。免疫后3年用强毒株攻击，结果所有接种灭活疫苗的都得到保护，而接种活疫苗的有10 % 死亡。但1987年以来，我国生产的活疫苗和犬用口服活疫苗免疫原性和安全性均良好。口服活疫苗l次4毫开，放入粥内给犬吃，免疫时间可持续15个月，现场免疫!9196只犬。两年内，无一发病，而对照组7584只未免疫犬中则有31只发病。说明我国生产的犬用日服活仪自免疫欢果甚佳。现在我国汉个别地方继续使用羊脑灭活狂犬疫苗免疫效果较PHKV略差。 3狂犬疫苗的不良反应 3.1一般反应 狂犬疫苗接种后的一般反应，主要是轻度的过敏反应，患者一般可以耐受，不影响免疫过程及结果。不同的疫苗，其一般反应的发生率和临床表现也有区别。 3.1.1Semple羊脑疫苗 Semple羊脑疫苗Semple羊脑疫苗属NTV接种3天后出现一般反应，随接种次数增加，不良反应亦增多。注射第5一8针反应明显，注射第10针左右反应可达高峰。主要表现为注射局部红肿、疼痛、硬结、麻痹，约有5%左右的接种者可有淋巴结肿大。全身反应多在接种后1~7天出现，可有全身不适、微热、头昏、食欲减退、四肢麻木、肌肉酸痛，少数人可有视力障碍、尊麻疹或血管性水肿等症状。 3.1.2地鼠肾细胞培养疫苗 LL3组织培养疫苗接种地鼠肾细胞培养疫苗后的局部和全身反应均较轻微。主要表现为局部红肿、疼痛、硬结，极少数人可有淋巴结肿大。全身反应主要表现为发热、头昏、头痛、全身不适、四肢麻木，少数人可有皮疹。反应有随接种针次增加而减少的趋势。 3.1.2 LLZ鸭胚疫苗 LLZ鸭胚疫苗(DEV)局部反应常见，大多数有注射部位疼痛、红斑和硬结，13%注射部位有痉痒，三分之一的接种者通常在注射5一8针后出现全身症状，如发痒、不适和肌痛。国内尚未生产这种疫苗。 3.2严重不良反应 狂犬疫苗的严重不良反应包括:过敏性休克、重症尊麻疹和脱髓鞘性神经系统并发症等。其 中以脱髓鞘性神经系统并发症和重症尊麻疹较常见。 3.2.1过敏性休克 狂犬疫苗接种后的过敏性休克发生率不高，国内文献报告较少，发生呈闪电样过程，多数患者在接种后5min内即可发生，少数患者于0.5h后出现，也有患者在接种几次后发生过敏性休克。主要表现为皮肤苍白、紫组，四肢发凉、脉搏细弱，心跳快而无力，血压急剧下降，甚至测不到，严重者可发生心跳骤停。除循环系统的休克表现外，患者常有其他系统症状。如呼吸系统可表现为胸闷、喉头堵塞感，继而呼吸困难、紫组、濒死感，双肺可闻及哮鸣音及湿性哆音、严重者可咳出粉红色泡沫痰，甚至窒息。神经系统可表现为意识障碍、四肢麻木、抽搐、失语、瘫痪、大小便失禁，甚至昏迷。皮肤常见表现有尊麻疹、痉痒等。有些患者可因胃肠道平滑肌痉挛及肠尊麻疹的形成，患者常有恶心、呕吐、腹泻，甚至发生剧烈腹绞痛。成赐福等。 3.2.2脱髓鞘性神经系统并发症 狂犬病神经组织疫苗接种后的异常反应主要表现为神经系统并发症。常见的神经系统并发症有脊髓炎、脑脊髓炎、脑膜脑炎和外周神经炎四型。 3.2.2.1发病机理 发病机理目前一般认为这是一种变态反应性疾病。我国生产的羊脑疫苗中含有少量脑组织，即每支疫苗约有0.19的脑组织，其中含有髓磷脂、髓鞘碱性蛋白等致敏原物质，注射后使机体受抗原刺激发生第W型的变态反应，这时体内的T淋巴细胞被致敏，后者与再次进入体内的相应抗原接触，致敏的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，并释放出淋巴毒素、转移因子、白细胞游走抑制因子等多种物质。这些物质破坏抗原，含有抗原的细胞及其邻近反应部位的实质细胞，引起变态反应脑脊髓炎或变态反应神经炎。 3.2.2.2临床表现 潜伏期多发于接种疫苗后6一15天，超过30天的很少。可呈急性或亚急性发病，病情一般在数天至1一2周达高峰，6S%的患者可有前驱症状，如头痛、发热、全身不适和酸痛、感觉过敏，注射部位红肿疼痛及感觉异常，表情淡漠，感情易于激动，逐渐出现神经系统症状，有些患者没有前驱症状。感觉障碍最先出现皮肤感觉过敏或疼痛，常以一侧或双侧下肢开始。患者主诉足部或下肢疼痛、麻木，继而出现运动障碍，痛觉逐渐消失，腹壁反射及提攀反射亦常见消失。麻痹和瘫痪先出现于下肢，一侧或双侧可同时出现，开始时患者感觉肢体麻木或运动无力，进而发生瘫痪，能波及躯干或上肢，严重时出现呼吸、吞咽困难，此时如不及时抢救，能危及患者生命。四肢外周神经炎或面神经炎可伴随发生，亦可单独出现。有些患者仅表现为单纯的面神经炎症状，发病后数天能出现完全尿储留和便秘。脑膜脑炎症状:有的患者于发病后出现剧烈头痛、高热、呕吐、颈硬、克氏征或巴氏征阳性。其他症状可见视力模糊、复视、瞳孔散大、对光反射迟钝等，个别患者出现语言障碍。由于交感神经系统兴奋，常大汗淋漓，因而患者可 以出现较为严重的脱水症状。 4不良反应的处理原则 4.1一般反应的处理原则 出现一般反应时，经用抗炎、退热药即可控制，不应中断疫苗注射。局部用热敷处理。对过敏者用抗组胺药治疗。皮质类固醇及免疫抑制剂可干扰疫苗主动免疫的产生，并使发生狂犬病的可能性增加，因此接种期间忌用上述药物。 4.2严重反应的处理原则 4.2.1严重反应的早期判断 仔细观察症状和体征对早期诊断帮助很大。如接种后迅速发病，在数分钟内出现胸闷、气促、呼吸困难、紫组、窒息、面色苍白，冷汗，烦躁不安，血压急剧下降，即可作出诊断。 4.2.2疫苗停止接种的指征 接种疫苗后，出现过敏性休克的患者应立即停止使用。对过敏性体质者急性发作期不应注射，对本疫苗高度过敏者应禁用。对高热、哮喘、尊麻疹、妊娠期患者应慎用。 4.2.3严重过敏反应的处理原则 在疫苗接种过程中发生严重过敏反应时应立即停药，使患者平卧，保暖给氧。分秒必争，就地抢救，密切观察血压、脉搏、呼吸及尿量变化。立即皮下注射肾上腺素0.5一Ilng(小儿酌减)，症状如不缓解，可每20一30min皮下或静脉注射肾上腺素0.5mg，直至脱离危险。 5不良反应的预防 5.1注射疫苗的注意事项 Semple疫苗产生抗体较慢，于注射第一针后3周才出现。因此，被患有狂犬的动物咬伤后，须尽早注射，使免疫产生在发病之前。若在咬伤后10日开始注射者，多不能防止发病。狂犬疫苗在注射后7一8天，注射处可出现红肿、硬结、局部淋巴节肿大，因此应不断调换注射部位。注射期间不能饮用酒、浓茶、咖啡。 5.2严重不良反应的预防 注射前应询问有无狂犬疫苗和其它生物免疫过敏史，若有则应先作皮试。阳性者采用少量多次注射方法可减轻或避免不良反应的发生。其方法是:抽取0.lml狂犬疫苗注射液，不作稀释直接在上臂掌侧皮内注射，观察15~20min，若皮丘增大，周围有红晕者将1支分成4次注射，第1次至第3次各注射0.4ml，第4次注射0.8ml，每次间隔15min，无反应后第4天用同样方法注射第次剂量。第1针后第8天以同样方法分4次注射第3次剂量。若前3次均未出现异常反应，第4剂(第 1针后14天)，第5剂(第1针后30天)，可一次注射完毕。 参考文献 [1] 孙明波，张丽旌，廖国阳，等.Vero、CHO和杂交瘤细胞在生物反应器中的生长和代谢[ J ].中国生物制品学杂志，2001，14(4):213- 216. [2] 孙明波，李国良，李卫东，等.应用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒[ J ].第三军医大学学报，2003，25(8): 740 -741. [3] SUREAUP. Contribution to rabies prevention[ J ]. Vaccine，1992，10 (13) : 896 – 899. [4] 张永振，肖东楼，孙玉辉，等.中国1984,2002年狂犬病流行情况及防制对策[ J ].中华流行病学杂志，2003，24 ( 10 ) : 883 -886. [5] 杨洁，和京果，张铁钢，等. 北京市891例狂犬疫苗接种后抗体水平分析[ J ].中国卫生检验杂志，2008，18(12):2711. [6] 贺熊，孙美苹. 北京市预防接种工作技术[ M ].北京:北京科学技术出版社，2007:125~129. [7] 黄春晓，吴国桢，龚红明，等.382例暴露者接种狂犬病纯化疫苗后抗体检测结果分析[ J ].广西预防医学，2003，9(6):341~342. [8] 许建宏. 两种狂犬疫苗免疫效果评价[ J ].华南预防医学，2004，30(1):48. [9] 顾建军，唐茂功.免疫失败狂犬病26例分析[ J ].临床医学，2005，25 ( 2 ):101- 104. [10] 许雷，李春平.连云港市50例狂犬病流行病学分析[ J ].江苏预防医学， 2005，16( 1 ): 167- 169. [11] 李坤风，吴小玲.高州市1990~ 2003年狂犬病流行病学分析[ J ]. 中国热带医学，2006，6( 1 ) : 947- 948. [12] 杨书宏，岳燕萍. 2755例动物咬伤人群狂犬疫苗免疫效果观察[ J ].公共卫生与预防医学，2005，16 ( 4) : 11- 13. [13] 张永振，俞永新. 防制狂犬病需长期坚持综合防制的策略[ J ].疾病监测，2005, 20( 5 ): 225- 226. [14]胡昌良.地鼠肾组织坛养人用任犬疫苗的免疫效果在狂犬集中咬伤入群中的观察[ J ].中国人兽共患病杂志1959，6 (5 ) :42. [15]李雪翔等.地鼠肾细胞狂犬病疫苗联合抗狂犬病血清对接触后处理的效果观察。中国人兽共患病杂志，1989,6(5):18.