您身边具有辅助降血压功能的物质(保健品)

您身边具有辅助降血压功能的物质(保健品) 具有辅助降血压功能的物质 血压(blood pressure，BP)是血液在血管内流动时，对血管壁产生的侧压力。它是推动血液在血管内流动的动力。包括动脉血压、毛细血管压和静脉血压。人们常说的血压是指动脉血压，心室收缩，血液从心室流入动脉，此时血液对动脉的压力最高，称为收缩压(systolic blood pressure，SBP)。心室舒张，动脉血管弹性回缩，血液仍慢慢继续向前流动，但血压下降，此时的压力称为舒张压(diastolic blood pressure，DBP)。正常的血压是血液循环流动的前提，血压在多种因素调节下保持正常，从而提供各组织器官以足够的血量，藉以维持正常的新陈代谢。血压异常(低血压、高血压)会造成严重后果。高血压是目前最常见的血压异常情况。 一、对高血压的认识 高血压(hypertension)是以体循环动脉压增高为主要表现的临床综合征，可伴有心脏、血管、脑和肾脏等器官功能性或器质性改变的全身性疾病，是最常见的心血管疾病。可分为原发性高血压和继发性高血压两大类。在绝大多数患者中，高血压的病因不明，称之为原发性高血压(primary hypertension)，比例占高血压患者的90%,95%以上;血压升高是由于某些疾病的一种临床表现，本身有明确而独立的病因，称为继发性高血压(secondary hypertension)，占总高血压患者的5%,10%左右。 我国目前采用国际上统一的高血压诊断标准，WHO/ISH(世界卫生组织及国际高血压联盟)1999年规定: ? 理想血压:收缩压<120mmHg、舒张压<80mmHg。 ? 正常血压:收缩压<130mmHg、舒张压<85mmHg。 ? 正常高值:收缩压130,139mmHg、舒张压85,89mmHg。 ? 高血压:收缩压?140mmHg和(或)舒张压?90mmHg。 以上标准适用于男女两性任何年龄的成人，对于儿童，目前尚无公认的高血压诊断标准，但通常低于成人高血压诊断的水平。 二、高血压的病因及危害 近年来流行病学调查资料显示，尽管人们对高血的研究和认识都有了很大的提高，手段和治疗方法也取得了很大的进步，但高血压仍是心血管疾病死亡 1 的重要原因之一。 高血压发病的原因很多，现代医学认为主要原因来自遗传和环境两个方面。一般认为高血压是在一定的遗传背景下由于多种后天环境因素作用使正常血压调节机制失代偿所致。人体血压大小主要决定于心排血量及体循环的周围血管阻力，一切影响这两方面的因素均可导致血压异常。人体本身具有调节异常血压的机制，一般分为神经性调节(快)和体液性调节(慢)。血压的快速调节主要通过压力感受器及交感神经活动来实现，而慢性调节则主要通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统及肾脏对体液容量的调节活动来完成。如果这两类血压调节机制失去平衡则会导致高血压的产生。 高血压早期无明显病理学改变，仅表现为心排血量增加和全身小动脉张力的增加。高血压持续及进展即引起全身小动脉病变，小动脉中层平滑肌细胞增殖和纤维化，管壁增厚和管腔狭窄，使外周阻力持续增高，导致重要靶器官心、脑、肾组织缺血，长期高血压及伴随的危险因素可促进动脉粥样硬化的形成，该病变主要累及中、大动脉。最终引起脑、心、肾、视网膜等重要器官结构与功能的损害，导致这些器官功能衰竭，迄今仍是心、脑血管疾病死亡的重要原因之一。 ? 心:由于长期周围血管阻力升高，加重心脏负荷，早期发生代偿性左心室肥厚，随着病情发展心脏继续扩张，最后可能发生心力衰竭及严重心律失常。长期高血压可促使脂质在大、中动脉内膜沉积，引起动脉粥样硬化的形成，尤其是冠状动脉硬化的发展。 ? 脑:长期的血压升高，使脑部小动脉硬化及血栓形成，易于破裂出血或痉挛导致脑血栓的形成。 ? 肾:由于肾脏入球和出球小动脉痉挛、硬化、退变导致肾实质的缺血、缺氧，最终导致肾小球纤维化、萎缩至肾衰竭。 ? 视网膜:血压长期升高使得视网膜小动脉从痉挛到硬化，发生视网膜出血或渗出。 三、高血压的预防和治疗 1992年国际心脏会议提出高血压预防的主要内容是的“健康四大基石”，即“合理膳食、适量运动、戒烟限酒、心理平衡”，其核心就是健康的生活方式，可使高血压的发病率下降55%。 2 ? 合理膳食 合理的膳食很重要，以低脂、低钠、低胆固醇的饮食为主，食盐摄入量的标准为每天少于6克。少吃高脂肪、高盐、高热量的食品，多吃新鲜蔬菜、水果和坚果，从饮食上控制体重的增加。 ? 适量运动 进行适度的体育锻炼，如快走、慢跑、健身操等，以促进热量的消耗。 ? 戒烟限酒 吸烟和过量饮酒均会刺激心率增加和血管收缩，导致血压升高，更重要的是，吸烟是脑卒的重要危险因素。因此，为了降低心血管病的危险因素，吸烟的人应争取戒烟。每日饮少量的酒，能有效地降低高血压病及冠心病的患病率和病死率。适量饮酒能缓解紧张情绪，过量则适得其反。 ? 心理平衡 紧张、急躁和焦虑会使血压升高。劳逸结合，心情放松，保持足够的睡眠，养成良好的生活习惯。 四、具有辅助降血压功能的物质 对于“辅助降血压”功能认定，保健食品检验与评价技术规范(2003版)中保健食品的功能实验是这样认定“辅助降血压”功能的:选择符合条件的原发性高血压患者(收缩压?140mmHg和或舒张压?90mmHg)，受试者在试食观察期间不改变原有抗高血压药物治疗方案的基础上，按推荐剂量和服用方法服用30,45天，血压达到以下标准为有效:舒张压下降?10mmHg或降至正常;收缩压下降?20mmHg或降至正常。按症状轻重(重症3分，中症2分，轻症1分)统计食前后积分值和计算改善率，症状改善1分及1分以上为有效。 研究辅助降血压功能食品目的不是在于单纯降低患者血压, 重点是在于改善高血压症状,促进心、脑、肾、血管病理改变的恢复。现代医学研究证明, 西医降压药和中医降压药各有其优缺点。西药并未解决导致血压升高的病理因素, 一旦停药血压就会很快反弹升高,使患者必须终身服药。中药的降压效果虽不如西药,但能通过其对脏腑机能的调节,改善导致血压升高的病理因素而达到防治血压升高的效果。且中医认为药补不如食补, 具有药食两用的药物更是高血压患者的理想选择。研究表明, 降血压功能食品功效成分主要有黄酮(芦丁等)，皂苷，不饱和脂肪酸，粗多糖，低聚糖类，维生素，钾镁硒等微量元素等。 目前，市场上共有60多种“辅助降血压”功能的保健食品，产品大多与辅助降血脂、改善睡眠、抗氧化、辅助降血糖等功能搭配，大多辅助降血压物质也具 3 有降血脂的功能。从剂型上来看，以中草药为原料的胶囊、茶饮、提取物冲剂最为常见。国家卫生部和国家食品药品监督管理局批准具有辅助降血压功能的部分物质: 杜仲，杜仲叶，罗布麻叶，葛根、决明子、丹参、天麻，绿茶，泽泻，三七，绞股蓝，菊花，大蒜油，海澡酸钾，牛磺酸，山楂，银杏叶，芦丁(提取物)，红花，藏红花，大枣，甘草，海带，蒲公英，夏枯草，玉米胚芽油，硒及富硒食品，维生素E，藜蒿，槐米，昆布，桑白皮，微晶纤维素，蜜环菌菌丝体。 其它具有辅助降血压功能的物质: γ-氨基丁酸(GABA)，茶氨酸，低聚糖类，虎杖，降血压肽，钩藤，荷叶，野菊花，淫羊藿，可可多酚，灵芝，大豆低聚肽，海藻酸低聚糖，酿造醋，牡蛎肉，贝母，无花果，芹菜等等。 杜仲和杜仲叶 (一)主要功效成分介绍 1(组成、结构与性质 杜仲 (拉丁植物名Eucommia ulmoides Oliver)是名贵药材，英文名CORTEX EUCOMMIAE，别名思仙、思仲、木绵、石思仙、扯丝皮、丝连皮、玉丝皮、丝棉皮等。为杜仲科植物的干燥树皮。4,6月剥取，刮去粗皮，堆置“发汗”至内皮呈紫褐色，晒干而成。气微，味稍苦。杜仲入药在我国已有2000多年的历史，祖国医学认为，杜仲味甘、微辛、性温，具有补肝肾、强筋骨、安胎之功效[1][2]。 近年来，许多学者对杜仲的化学成分进行了大量研究，发现杜仲的皮、叶有相似的化学成分和药理作用。杜仲化学成分复杂，目前已确定有活性成分有木脂 [3]素及其苷类化合物，木脂素包括双环氧木质素类(如松脂素单糖甙、松脂素二糖甙或称松脂醇二葡萄糖甙，中脂素、中脂素单糖甙，中脂素二糖甙、丁香素、丁香素单糖甙、丁香素二糖甙);单环氧木质素类(如橄榄素、橄榄素二糖甙)、环木质素类(如橄榄素);新木质素类(如二羟基脱氢二松柏醇、柑桔素B);倍半木质素类(如耳草素二糖甙)等。其中松脂素二糖甙为杜仲皮主要降压成分，丁香素 4 二糖甙有抗癌活性，一些木质素类化合物对CAMP磷酸二酯酶有强的抑制活性， [4]故可成为血管扩张剂;苯丙素类化合物，木脂素的前体，主要有绿原酸(杜仲叶主要功能指标之一)、咖啡酸、二氢咖啡酸、松柏酸、愈创木丙三醇、松柏苷、 [5]丁香苷、间羟基苯丙酸、绿原酸甲酯、香草酸、β-谷甾醇、熊果酸、寇布拉苷;环烯醚萜类;黄酮类化合物(槲皮素、芦丁类物质);儿茶素;氨基酸;微量元素及维生素、杜仲胶、杜仲抗真菌蛋白、挥发性成分(不饱和脂肪酸类)、萜类和甾醇类化合物、单糖和多糖类化合物等等。杜仲有种类繁多的化学成分和广泛的药理药效，临床应用前景极为广阔，在医药领域有巨大潜力。大量动物实验表明，杜仲的皮、叶提取物有降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗衰老作用、利尿、增强免疫力等功效作用。 经广泛研究证明，杜仲提取物中取有降血压功能的活性成分为木脂素类化合物、芦丁和槲皮素等。木脂素类化合物是目前杜仲化学成分中研究最多、结构最清晰、成分最明确的一类化合物，从杜仲中分离出的木脂素类化合物已有27种， [6]其中多数为苷类化合物。结构见表DZ01。其中的松脂醇二葡萄糖苷是最主要 [7]的降压成分。北京中医学院李家实等对杜仲皮和叶分别作了降压实验，结果表明，杜仲叶和皮中的生物碱、桃叶珊瑚甙、氯原酸、糖类均有同程度的降压作用。此外，水溶性硅、钙含量高，都可能参与对心血管功能的调节。 松脂醇二葡萄糖苷，英文名称:Pinoresinol Diglucoside，分 子 式: ，化学分类:Lignans 木C32H42O16，分 子 量:682.67，C A S 号:63902-38-5脂素类 。松脂醇二葡萄糖苷是杜仲提取物中主要的降压成分之一。 图DZ01 松脂醇二葡萄糖苷分子结构式 芦丁，英文名称:Rutin，分子式:C27H30O16，分子量:610.51，CAS NO:153-18-4，浅黄色针状结晶(水)，熔点176?-178?，难溶于冷水，可溶于热水、 5 甲醇、乙醇、吡啶，易溶于碱水。产品来源:芸香叶、烟叶、枣、杏、杜仲、橙皮、番茄、荞麦花等中。主要由醇提、萃取、层析、结晶等工序完成。保存于阴凉干燥、避光、避高温。芦丁属维生素类药，有降低毛细血管通透性和脆性的作用，保持及恢复毛细血管的正常弹性。用于防治高血压脑溢血;糖尿病视网膜出血和出血性紫癜等，也用作食品抗氧剂和色素 图DZ02 芦丁分子结构式 槲皮素，英文名:Quercetin，又名栎精，槲皮黄素，分 子 式:C15H10O7 分 子 量:302.24，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水。二水合物为 -97?C成为无水物，熔点314?C(分解)。熔点314?，黄色针状结晶(稀乙醇)，在95 极微溶于水和乙醚，溶于冰醋酸及碱性水溶液显黄色等。几乎不溶于水，乙醇溶液味很苦，可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。 图DZ03 槲皮素分子结构式 6 [6]表DZ01 杜仲中已知27种木脂素化合物结构 7 绿原酸，英文名:Chlorogenic acid;别名:氯原酸,咖啡鞣酸;化学名: (1S,3R,4R,5R)-3-[[3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧]-1,4,5-三羟基环己烷甲酸;CAS NO: 327-97-9;分子式及分子量:C16H18O9=354.30。天然的绿原酸是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acid，1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。 图DZ04 绿原酸的分子结构式 2(生物学和药理学功能 杜仲降血压功效很早就在动物和临床试验成功证实了。美国威斯康星大学 [8]Charles J sih等研究认为杜仲提取物中降血压的有效成分是松脂醇二葡萄糖苷、杜仲绿原酸和桃叶珊瑚甙等。作用机理是由于其直接作用于血管平滑肌，使血管 可以改善高血压症状，减少血管损伤，改善脑、肾等脏器的循环。 扩张。 [9]康存战等用杜仲口服液灌胃自发性高血压大鼠，实验研究证实:杜仲口服液对自发性高血压大鼠有明显的降压作用，且对机体健康无不良影响。黄志新等[10]用杜仲水提液对肾性高血压小鼠灌胃，也证实具有降血压作用，最大耐受量 [7]灌胃，也未见急性毒性反应。李家实等用杜仲水浸提物进行了急性降血压试验，发现杜仲的降压作用与其中含有的绿原酸、桃叶珊瑚苷和糖类等物质有关。李武 [11]明等人通过对45例高血压受试者临床观察发现，复方杜仲片具有较好的降压作用，且能明显改善临床症状，并兼有降低TG、TC、ET、TXA2和升高NO的 [12]作用，无不良反应;张瑛朝等通过对60例高血压受试者的临床研究发现，复方杜仲叶合剂对人体有明显的降压及调节血脂的作用，且对机体健康无不良影响。 3(安全性(毒理) [2]杜仲提取物的安全性:小鼠LD50为17.3?0.52 g/kg(煎剂小鼠腹注)。 8 [2]杜仲叶提取物的安全性: ?大鼠LD50>5.64g/kg(大鼠，经口)。 ?对4周龄大鼠每日饲以5g/kg体重杜仲提取物，经14d后，测体重，用乙醚麻醉后放血致死，解剖，观察胸、腹部并测定其肝、肾、脾脏质量，均无异常发现。 ?曾对成人12名每天给予含杜仲叶提取物6,12g/d×10d的饮料饮用，经临床药理评价，确认无有害作用。 ?杜仲叶常作茶饮，不仅在中国，而且在日本也较普及。 [13]刘月凤等人对杜仲提取物的亚慢性毒理学研究表明，给小鼠以最大剂量18.2g/kg灌胃，7d内动物均无异常反应。小鼠精神状态良好，无死亡发生，给药后的第8天处死动物，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等均无异常发生。刘丽春等[14]对复方杜仲片的毒理学研究表明，复方杜仲片以灌胃给药小鼠药，测得最大耐受量为35.6 g/kg，接近临床剂量的200倍。在观察期间，全部小鼠存活，剖检，肉眼观察主要脏器，未见心、肝、脾、肺、肾等主要脏器组织明显异常。 [15]急性毒理学试验也进一步证实了杜仲提取物为基本无毒物。黄武光等用杜仲叶冲剂静脉注射给药麻醉猫和对小鼠灌胃进行急性毒性实验，结果杜仲叶冲剂能使麻醉猫血压平缓而较持久地明显降低:对小鼠空腹最大耐受量灌胃，未见急性毒性反应。因此认为杜仲叶冲剂具有明显降压作用，且无明显急性毒性反应。 [16]隋海霞等 运用急性毒性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验对杜仲进行了较系统的安全性评价。结果:杜仲的LD50为160.0g,kg; 对CHO和CHL细胞的Ic50均为109(38 mg,ml，并且在该剂量之下为阴性结果。认为杜仲属无毒物，在较高剂量下对CHO和CHL细胞均表现出一定的毒性，该实验条件下无 [17] 细胞染色体畸变的遗传毒性。张国红等研究杜仲康茶对大鼠性功能的影响及其对小鼠的急性毒性作用，以最大剂量给小鼠灌胃后观察7d，全部动物存活(未观察到急性毒性的发生。 (二)功效成分的检测方法 1. 松脂醇二葡萄糖苷的检测方法 目前，用于杜仲及提取物中松脂醇二葡萄糖苷的检测方法有薄层色谱法、反 9 相高效液相色谱法和液质联用法。 其中以反相高效液相色谱法报道最多。样品经提取后，在反相色谱柱上与杂 [18]质分离，紫外检测定量。伍庆,张明时,王兴宁等采用高效液相色谱法同时测定杜仲药材中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的含量，采用Diamonsil C18柱(5μm,250mm×4.6 mm),以乙腈-水-0.4%磷酸水溶液(15:85:0.5)为流动相,检测波长227nm。 样品中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的加样回收率分别为95%,98%,96%,103%;绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的线性范围分别为0.298,2.98μg，γ=0.999和0.872,8.72μg，γ=0.9998。 [19]王月茹,谢伟,王西芳等采用高效液相色谱法测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量，使用ODS-C18柱(5μm,4.6mm×250mm)为分析柱，流动相为:乙腈-0.1%磷酸(15:85)，检测波长为227nm，流速为1.0mL/min，柱温:30?。松脂醇二葡萄糖苷在1.086,5.430μg范围内线性关系良好(γ= 0.9999)，该方法的回收率为100.75%，RSD为2.03%(n=6)。 [20]姜新义等以正交方法确定样品制备的最佳条件，采用HPLC法测定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量。于45?下采用超声提取20 min，并用改良的色谱条件进行杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量测定，所得结果与采用现行中国药典法(2005年版一部)测得的松脂醇二葡萄糖苷含量接近，含量测定中所采用的流动相为乙腈-水(15:85).获得了对称性良好的色谱峰和理想的分离度。所建方法样品 含量测定结果准确可靠、分离效果好、稳定性好,可以快速处理过程简便、迅速, 并准确测定多批样品。 [21]张倩茹等建立杜仲及相应制剂中松脂醇二葡萄糖苷(PDG)的含量测定方法，方法也采用高效液相色谱法测定，色谱条件中色谱柱采用Agilent Eclipse XDB-C18 150×4.6mm,5μm)，流动相:甲醇-水(26:74)，流速:1.0mL/min，检测波长:230nm，柱温为25?，进样量:10μL，PDG在0.05080,0.5080 mg/mL范围内呈良好线性(γ=0.9999)。方法简便、快速、准确性高、重复性好，适用于杜仲及其相关制剂中PDG的含量测定。 [22]罗旭彪等采用液相色谱-质谱仪检测杜仲中松脂醇二葡萄糖苷。流动相0.1%甲酸水溶液和甲醇体系，梯度洗脱，质谱条件采用负离子扫描，定量离子为m/z 519，待测物在0.03,0.45μg范围内呈良好线性(r=0.9920)。方法定性准确、 10 重复性好。方法已经成功地分析了杜仲的皮、叶、提取物、天麻杜仲胶囊和杜仲茶中9种活性成分。 2. 绿原酸、芦丁和槲皮素功效成分的检测方法 目前氯原酸的分离与测定方法较多，主要有:高效液相色谱法、反相高效色谱法、紫外可见分光光度法、纸层析,紫外分光光度法、薄层扫描法、毛细管电泳法。 [23]吴红等采用紫外分光光度法及薄层色谱扫描法分别测定。纸层析紫外分光光度法(剪洗法)测得杜仲叶中氯原酸含量为1.949%，变异系数(CV)1.34%，回收率100.44%。薄层色谱扫描法测得含量为1.886%，变异系数1.72%，回收率 [24]101.27%。马柏林等利用氯原酸的配位效应进行显色的有关参数，建立了测定氯原酸的可见分光光度法。方法具有仪器简单、灵敏度高、选择性好、快速准确、容易普及等优点。用于样品中氯原酸测定的标准偏差为1.0%,3.1%，标准加入回收率为100.8%,102.4%。 [25]张泽楷等采用高效液相色谱法(HPLC)同时测定杜仲降压片中绿原酸、芦丁含量。色谱条件:Spherisorb BDS-C柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，以甲醇-0.1%18 磷酸水溶液梯度洗脱，流速1 ml/min，检测波长350 nm，样品中绿原酸、芦丁加样回收率分别为99%、98%。 [26]董娟娥等建立了利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)同时测定杜仲雄花及其产品中京尼平苷酸和绿原酸的方法。所用的色谱柱为Shim-pack VP-ODS(150 mm×4.6 mm,5μm)，流动相为甲醇-水-乙酸(体积比为24?75?1)，检测波长为240nm。在该色谱条件下绿原酸的含量在0.075,1.200 g/L范围内线性关系良好，相关系数0.9990。 [27]王柏强等建立测定杜仲缓释滴丸中绿原酸含量的高效液相色谱(HPLC)法。以迪马C柱(250mm×4.6 mm，5μm)为色谱柱，乙腈-0.4%磷酸溶液(13?87)18 为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为327nm。绿原酸在1.3,130.0 μg/mL范围内与峰面积值线性关系良好，γ=0.9999(n=6)。该方法操作简便,结果 准确可 [28]靠。孙娟娟等比较具有降压作用的5个科属代表性植物中芦丁和槲皮素含量差异。建立一种反相高效液相色谱法同时测定中药材(连翘、杜仲、槐花、金银花、雪莲花)中芦丁和槲皮素的含量，2种黄酮化合物线性范围为10,5000ng， 11 平均加样回收率均在97%,102%，精密度和重复性RSD均小于5%，定量限(S/N=10)低于5.0 ng。 [29]何新荣等建立采用高效毛细管电泳测定杜仲中有效成分绿原酸(CA)含量的方法。方法采用毛细管区带电泳(CZE)，以内标法测定。运行电解质为含80 mmol/L硼砂缓冲液-100 mmol/L氢氧化钠(20:1,pH=9.32),工作电压30 kV，柱温25 ?，检测波长为340nm，内标物为盐酸小檗碱。绿原酸在0.006,0.574 mg/mL的浓度范围内线性良好。 [30]余济海等建立反相高效液相色谱法同时测定了杜仲叶中2种黄酮类成分—芦丁和槲皮素的含量。色谱柱为Nova-Pak C(3.9mm×300 mm,4μm)，流动相18 为甲醇-0.5%磷酸溶液(50:50)，流速0.6mL/min，检测波长为356 nm，芦丁和槲皮素的线性范围分别为0.246,4.92μg(γ=0.9999)和0.0846,1.692μg(γ=0.9999)，平均回收率(n=5)分别99.8%和102.1%。方法准确、快速、重现性好，适用于同 [31]时测定杜仲叶中黄酮类成分的含量。伍庆等建立同时测定杜仲叶中芦丁、槲皮素、山萘酚的高效液相色谱法。采用Spherisorb BDS C柱(5μm ,250mm×4.6 18 mm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长350nm。芦丁、槲皮素、山萘酚的线性范围分别为0.579μg,5.79μg，γ=0.9999;0.12μg,1.20μg，γ=0.9998;0.109μg,1.09μg，γ=0.9999。 [32]陈望爱等建立了分析比较杜仲和杜仲叶中挥发油和黄酮类的化学成分。对于挥发性成分,采用毛细管气相色谱-质谱(GC-MS)技术和化学计量学的方法对各个色谱峰定性,并用色谱峰面积归一法定量;对于黄酮类成分,采用高效液相色谱-二极管阵列(HPLC-DAD)分析技术并结合标准曲线法给芦丁、槲皮素和山柰酚定量。 [33]王明艳等利用分子自组装技术制备了4-(3-吡啶基)-2-巯基咪唑(PMI)修饰金电极. 采用一阶微分线性扫描伏安法同时测定芦丁和槲皮素的含量, 发现两氧化峰相差200 mV左右. 在优化条件下, 在共存溶液中当芦丁及槲皮素分别在5.0,100.0 μmol/L和10.0,150.0 μmol/L浓度范围内, 其氧化峰电流与浓度有良好的线性关系, 检出限分别为1.0 μmol/L和2.0 μmol/L。 [34]林淼等采用毛细管电泳/电化学检测法(CE/ED)同时分离测定了杜仲叶、杜仲皮及市售杜仲保健品中芦丁、抗坏血酸、金丝桃甙、绿原酸、槲皮素等多种生 12 物活性成分的含量,考察了运行缓冲液酸度和浓度、分离电压、氧化电位和进样时间等实验参数对分离、检测的影响.在最优化条件下，以300 μm碳圆盘电极为检测电极，检测电位为+950 mV(vs，SCE)，50 mmol/L硼砂的运行缓冲液(pH 9.0)中，各组分在20 min内可基本实现基线分离.各组分浓度与峰电流在3个数量级 -5-5范围内呈良好线性，检出限(S/N=3)在3.3×10,9.6×10 g/L范围。 [35]龚明贵等用分光光度法测定杜仲花粉黄酮含量的方法。方法以芦丁作为对照品，采用NaNO-A1(NO)-NaOH体系显色，R=0.9952，在波长510 nm下检233 [36]3+测总黄酮含量为3.29%。张敏等根据黄酮类化合物能与Al形成稳定的荧光络合物，建立一种测定杜仲叶总黄酮的新方法.用60%乙醇加热回流提取杜仲叶有效成分，以芦丁为标样，选择激发波长λ=436nm，发射波长λ=483nm，采用exem -9荧光分光光度法测定杜仲叶中总黄酮含量，方法检出限为1.27×10mol/L，线性 -8-5范围在1.64×10,3.63×10mol/L之间，线性回归方程:y=17.923x+1.398，相关系数γ=0.9989，平均回收率99.8%-104.2%，相对标准差(RSD)0.84%。 (三)检测方法实例 [16] 方法一 保健食品中松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸含量的测定 1、方法提要 建立同时测定杜仲药材中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷含量的高效液相色谱法。方法采用Diamonsil C柱( 5μm , 250 mm × 4. 6 mm ), 以乙腈- 水- 0. 4%磷酸18 水溶液( 15+85+ 0.5)为流动相, 检测波长227 nm。样品中绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的加样回收率分别为95%,98% , 96%,103%，绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的线性范围分别为0.298μg ~ 2.98μg，γ= 0. 9999和0. 872μg ~ 8. 72μg, γ= 0. 9998。 2、试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 2.1乙腈:色谱纯。 2.2甲醇。 2.3 磷酸。 2.4 绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷标准品:中国药品检验所。 13 2.4.1标准品储备液 分别准确称取2.4对照品适量, 用60%甲醇溶解后置于25 mL的容量瓶, 并稀释至刻度, 配置成含绿原酸1. 49 mg/mL, 松脂醇二葡萄糖苷4. 35 mg/mL的对照品储备溶液。 2.4.2标准品溶液应用液 分别准确吸取对照品储备溶液1.00mL 置于10 mL的容量瓶中, 用60%甲醇溶解并稀释至刻度, 配置成含绿原酸0. 149 mg/mL, 松脂醇二葡萄糖苷0. 435 mg/mL的标准品应用溶液。临用现配。 3、仪器及条件 3.1回流装置。 3.2 水浴锅。 3.3高效液相色谱仪:带紫外检测器或二级管阵列检测器。 3.4 色谱条件 色谱柱Diamonsil C18柱( 5μm , 250 mm × 4. 6 mm ), 流动相为乙腈- 水- 0. 4%磷酸水溶液( 15+85+ 0.5), 检测波长227 nm。 、测定步骤 4 4.1 样品处理 供试品溶液精密称取杜仲药材粉末(过60目筛) 2 g，于100 mL锥形瓶中, 加入25 mL 60%甲醇溶液, 称定重量, 在水浴上回流提取1 h, 冷却后用60%甲醇补足重量。过0. 45μm的滤膜供HPLC分析。 4.2 标准曲线 分别准确吸取标准应用液(2.4.2)绿原酸0. 149 mg/mL, 松脂醇二葡萄糖苷0. 435 mg/mL，进样2μL，5μL，10μL，15μL，20μL，按3.4色谱条件进行分析，外标法定量。 4.3 标准品和样品色谱进样量均为10μL，测定峰面积，用外标法计算含量。 5、测定低限、回收率、精密度 5.1 线性关系 绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的回归方程分别为:Y= 267175X + 1288.1, γ= 0. 9999, Y = 188306X + 280.73, γ= 0. 9998。绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷分别在0.298μg~ 2. 98μg，0. 872μg~ 8. 72μg间呈良好的线性关系。 5.2回收率和样品提取液的稳定性实验 精密称取已测含量的杜仲药材粉末6份, 每份2 g, 按样品含绿原酸及松脂醇 14 二葡萄糖苷的80%, 100%, 120%精密加入绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷对照品储备溶液, 按4.1方法处理样品。测得绿原酸及松脂醇二葡萄糖苷的回收率分别为95% ~ 98%, 96% ~ 103%;精密度RSD分别为0. 8% ~ 1. 7%, 1. 5% ~ 2. 7%, n= 3。 样品溶液稳定性实验 取同一供试品溶液, 分别在0，2，4，6，8，10，12 h测定, 绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷含量的RSD分别为1. 7%，2. 2% ，n = 7 。表明供试品溶液在12 h内稳定。 5.3精密度 对同一份杜仲样品平定5次, 绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD 分别为:0. 23%，1. 5%，n = 5。同时称取同一份杜仲样品5份, 按4.1方法进行样品前处理, 在3.4色谱条件下分别测定, 绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的RSD分别为:0. 76%，0. 69%，n= 5。 6、谱图 图DZ05 杜仲提取物中绿原酸和松脂醇二葡萄苷色谱图 7、方法讨论 7.1 提取溶剂的选择 绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷属于芳香族化合物, 易溶于水及强极的溶剂中, 本文选择甲醇- 水、乙醇- 水和水3种溶剂作为提取溶剂, 结果表明, 以60%的甲醇作为提取溶剂时, 绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷提取较完全。 7.2 提取方法的选择 本实验考虑了超声、回流、索氏提取3 种提取方法, 发现回流提取效率明显高于其他两种提取方法; 实验中通过比较了提取温度、提取时间对提取率的影 15 响。结果以回流法提取、提取温度80?，提取时间1h提取效果最佳。 7.3 检测波长的选择 绿原酸和松脂醇二葡萄糖苷的对照品溶液的紫外分析表明, 绿原酸在220 nm, 246 nm, 232nm, 松脂醇二葡萄糖苷在227 nm, 280 nm, 288nm 有较强吸收, 对各波长进行比较, 发现在227nm 处两组分都具有较好的灵敏度, 应此选择227nm 为检测波长。 [28]方法二 保健食品中芦丁和槲皮素含量的测定 1、方法提要 建立反相高效液相色谱法同时测定了杜仲叶中2种黄酮类成分—芦丁和槲皮素的含量。色谱柱为Nova-Pak C18 (3.9mm×300mm，4μm)，流动相为甲醇-0.5,磷酸溶液(50:50)，流速0.6mL,min，检测波长为356 nm。芦丁和槲皮素的线性范围分别为0.246 g,4.92 g ( 相关系数0.9999)和0.0846 g,1.692 g(相关系数0.9999)，平均回收率(n=5)分别99.8,和102.1,。方法准确、快速、重现性好，适用于同时测定杜仲叶中黄酮类成分的含量。 2、试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 2.1甲醇:色谱纯。 2.2磷酸。 2.3乙醇。 2.4芦丁和槲皮索对照品:中国药品生物制品鉴定所。 2.5 对照品溶液。准确称取芦丁对照品6.15mg，槲皮素对照品2.16mg，用浓度70,甲醇溶液溶解后定容于25mL容量瓶中，配制成含芦丁0.2460mg/mL和含槲皮素0.0864mg/mL的对照品混合溶液，用0.45μm滤膜过滤。 3、仪器及条件 3.1 高效液相色谱仪:带紫外检测器或二级管阵列检测器。 3.2 超声波提取仪。 16 3.3 旋涡混匀器。 3.4 样品粉碎机。 3.5 样品筛:40目。 3.6 色谱条件流动相:甲醇-0.5,磷酸(50:50)，流速0.6mL/min，进样体积l0μL，检测波长326 nm，柱温25?，外标法定量。 4、测定步骤 4.1 提取 样品粉碎后过40目筛，准确称取约5.0 g，置具塞三角烧瓶中，加入70,乙醇旋涡2min后超声提取2 h，提取液过滤，滤渣洗涤2次，合并滤液于50mL容量瓶中，乙醇定容至刻度，0.45μm滤膜过滤，供液相色谱测定。 4.2 测定 将4.1样品提取液按(3.6)所述色谱条件进样测定，同时分别准确吸取对照 μL、5.0μL、10μL、l5μL、20μL 进样分析，以进样量为横坐标，品混合溶液1.0 峰面积为纵坐标作标准曲线。 5、测定低限、回收率、精密度 5.1 线性范围 以对照品的进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性拟合，芦丁和槲 54皮素的回归方程分别为:Y=2.01×10-1.92×10(γ=0.9999)，Y =2.32×10 5410-1.10×10(γ=0.9999)。芦丁在0.246μg,4.92μg，槲皮素在0.0846μg,1.692μg范围内线性关系良好。 5.2回收率 精密称定已知芦丁和槲皮素含量的杜仲叶5份，每份约5.0g，加入适量对照品混合溶液，按4.1所述方法制备样品溶液，测定加样样品中两组分含量，芦丁和槲皮素的平均加样回收率分别为99.8,、102.1,。 5.3精密度 5.3.1对照品测量的精密度。取对照品混合溶液重复进样5次，进样量10μL， ,。 以峰面积外标法定量，芦丁、槲皮素峰面积RSD分别为0.3,和0.6 5.3.2 样品测量的精密度。取杜仲叶供试样品重复进样5次，进样量10μL， 17 以峰面积外标法定量，芦丁、槲皮素RSD分别为0.5,和0.7,。 5.3.3样品测量的稳定性。取样品提取液放置2 h、4 h、6 h、8 h后，进样进样分析，测得芦丁、槲皮素峰面积RSD为1.1,和0.5,，说明样品在测定时间内稳定。 6、谱图 . 图DZ06 HPLC测定杜仲中芦丁和槲皮素色谱图 、方法讨论 7 7.1采用超声提取，以不同浓度的乙醇为提取剂，考察了2种黄酮类成分的提取效果。结果表明，用浓度70,乙醇提取时芦丁和槲皮素得率最高。 7.2检测波长的选择取芦丁和槲皮素对照品混合溶液进样，使用PAD检测器进行三维扫描，提取190,600 nm波长范围内2组分的紫外光谱，流动相中芦丁最大吸收波长分别为204.5 nm、256.3 nm和357.4nm，槲皮素最大吸收波长分别为203.4 nm、255.2 nm和367.9 nm。提取各波长下色谱进行比较，选择356 nm作为检测波长基线平稳，干扰小，峰形好。 (四)参考文献 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京,化学工业出版社,2005. 2 凌关庭. 保健食品原料手册(第二版). 化学工业出版社, 2006 3 尉芹，马希汉等(杜仲化学成分研究(西北林学院学报，1995，10(4):88,93 4 杜红岩. 杜仲活性成分与药理研究的新进展. 经济林研究2003，21(2):58—61 5 成军,白焱晶,赵玉英等.杜仲叶苯丙素类成分的研究[J].中国中药杂志,2002,27(1):38 6 管淑玉 苏薇薇. 杜仲化学成分与药理研究进展.中药材，2003，26(2):124,129 7 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罗布麻，又名:红麻、野麻、茶叶花。多年生草本，高1,2米，全株含有乳汁。茎直立，无毛。叶对生，椭圆形或长圆状披针形，长2,5厘米，宽0.5,1.5厘米，基部圆形或楔形，先端钝。其主要生长于沙漠盐碱地、河岸、山沟、山坡的砂质地。世界上约有14种，我国有3种，即罗布麻红麻、中花罗布麻白麻和大花罗布麻白麻。盛产于新疆、青海、甘肃、宁夏、辽宁、吉林等地区。罗布麻有极强的耐旱性、耐盐性、耐寒和酷暑。罗布麻的根和叶有药用价值，祖国医学记载:清凉泻火，强心利尿，降血压。治心脏病，高血压，神经衰弱，肾炎 [1][2]浮肿。 (一)主要功效成分介绍 罗布麻是生长在盐碱、沙荒地区的一种多年生宿根草本植物。茎皮纤维可为纺织、造纸等工业的原料;花芳香，是良好的蜜源植物;其根提取物有强心作用，罗布麻叶有降高血压、治疗气管炎的功效。随着人们保健意识的增强,罗布麻保健作用的研究不断深入。罗布麻叶是卫生部和国家食品药品监督管理局批准可用于保健食品的物品名单中具有辅助降压功能物质。市售保健功能饮品“罗布麻茶”、“罗布麻袋泡茶”和含罗布麻提取物的胶囊等。 1(组成、结构与性质 现代医学对罗布麻叶进入了深入的研究，罗布麻叶中主要化学成分有黄酮类、儿茶素、鞣质，酸类，脂肪酸醇酯，醇类，甾体类，糖类，烷类，氨基酸类， 20 矿物质元素等。2005版中国药典收录了罗布麻叶，记载其功效为平肝安神，清热利水。用于肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少,高血压，神经衰弱，肾炎浮肿治[1]疗。 罗布麻叶中总黄酮类化合物是其主要成分和保健功能成分，含量在0.20%,1.14%，主要包括槲皮素、金丝桃苷、异槲皮苷、三叶豆苷、紫云英苷、异槲皮 [3]苷-6-0-乙酰基、三叶豆苷-6-0-乙酰基。经研究证实，罗布麻提取物有降压作用、降血脂、增强免疫、抗氧化、抗衰老、清热利尿、平肝安神等功效。其中的槲皮素(quercetin，中国药典主要指标之一)、异槲皮苷(isoquercitrin)、金丝桃苷(hyperin)、芦丁(rutin)是罗布麻降血压、降脂、抗氧化的主要活性物质。其它还有绿原酸(Chlorogenic acid)、香树精(amyrin)、异秦皮定(isofraxidin)等 槲皮素，英文名:Quercetin，又名栎精，槲皮黄素，分 子 式:CHO 分 15107子 量:302.24，溶于冰醋酸，碱性水溶液呈黄色，几乎不溶于水。二水合物为黄色针状结晶(稀乙醇)，在95-97?C成为无水物，熔点314?C(分解)。熔点314?，极微溶于水和乙醚，溶于冰醋酸及碱性水溶液显黄色等。几乎不溶于水，乙醇溶液味很苦，可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用。用于治疗慢性支气管炎。对冠心病及高血压患者也有辅助治疗作用。 异槲皮苷和金丝桃苷，与槲皮素有同样的结构，只是在槲皮素的结构中多了一个糖苷。异槲皮苷和金丝桃苷具有相同的苷元，仅在糖基部分有一个羟基的构型不同，前者是半乳糖苷，后者是葡萄糖苷，其余部分完全相同，所以它们有 [4]相似的极性。 图LBMY01 金丝桃苷(1)、异槲皮苷(2)和槲皮素(3)的化学结构 21 罗布麻叶中的绿原酸具有抗菌、消炎、解毒、利胆、降压和升高白细胞及显著增加胃肠蠕动和促进胃液分泌等药理作用。绿原酸(Chlorogenic acid)，别名:氯原酸,咖啡鞣酸;化学名: (1S,3R,4R,5R)-3-[[3-(3,4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧]-1,4,5-三羟基环己烷甲酸;CAS NO: 327-97-9;分子式及分子量:CHO=354.30。 16189 2(生物学功能 罗布麻及罗布麻提取物的主要生理功能有:降血压、降血脂、增强免疫、抗氧化、抗衰老、利尿等功能。完成这些生理功能的主要来自于提取物中的黄酮类活性物质、绿原酸、氨基酸、多糖类物质和微量元素的作用。 与降血压西药相比，罗布麻叶降压效果虽迟缓，但降压后较为稳固，不会出现西药停药后血压立即反弹的现象，因而被公认为目前最好的中草药降压产品之一。临床研究也表明罗布麻降压作用疗效确切，作用温和，双向调节作用，尤其在改善眩晕，心悸等方面效果好。罗布麻提取物中具有降压功效的成分—黄酮类化合物，早期的研究认为是这类物质有此作用，后来人们发现并非所有的黄酮类化合物都有降压作用，其中的槲皮素、异槲皮苷才是罗布麻降血压的主要活性物[5][6]质。美国威斯康星大学Charles J Sih等研究发现植物体内的绿原酸也是降血压的有效成分。经多年临床试验证实的，绿原酸有明显的降压作用，而且疗效平稳，无毒、无副作用。 [7]虞颖映等人小鼠试验也证实罗布麻茶对有高血压症状的大鼠有显著而持续的降血压作用，不同剂量罗布麻茶能抑制食物性高脂血症大鼠模型血清TC、TG、 [8]LDL-C的升高及血清HDL-C的降低。何念善等人用罗布麻复合茶对原发性高血压病56例临床观察，连续给药8周，同时以牛黄降压丸治疗组为对照，结果显示治疗组降压疗效为87.5%,优于对照组的73.1%,组间比较差异有显著性(P<0.05)，连续的监控显示罗布麻复合茶能持续有效的降低血压而不影响其心率，能增强食欲并对胃肠无刺激作用，说明罗布麻能持续有效降压且副作用小。 [9]Kagawa T 等发现罗布麻叶提取物对自发性高血压大鼠有明显的降压作用，对稳定的血压无影响，并且在给予剂量之间呈明显的剂量正相关，其降压作用不是依赖于对交感神经系统。研究者发现罗布麻叶不降低正常血压，对于血压偏低者还能起到升压的调节作用。这些特点是其他所有降压药物不能比拟的。罗布麻叶 22 的降压原理目前的试验认为，降压作用与组织胺有关，可能是有效成分引起某些 [10][5]组织释放组织胺或直接作用于组织胺受体，使血管扩张，血压降低。有研究表明罗布麻叶提取物可引起血管松弛,改善肾功能,对自发性高血压, NaCl导致的盐性高血压和肾性高血压大鼠均有明显降压作用，同时发现可明显降低肾型高血 ++ 压大鼠的舒张压，增加尿量和K 、Na的排出，减少血尿氮(BUN)水平，可能 [11] 是通过改善肾功能的作用来降低血压。 3(安全性(毒理) [2]小鼠的LD为10.6 g/kg(煎剂小鼠腹注)，或黄酮苷398 mg/kg。 50 罗布麻的根、茎、叶和花入药已有千年历史,其部分药理作用很早就被人们发现并用于临床，证明可靠的食用安全性，据《本草纲目》记载,罗布麻有平心悸、止眩晕、消痰止咳、强心利尿之功能。其根含治疗心脏病的强心甙，具强心、减慢心率、利尿、镇静的效用，用于治疗慢性充血性心力衰竭、心率过速、浮肿、高血压等。其叶以清热利尿、平肝、安神，用于高血压、头晕、心悸、失眠症。1977 年正式录入《中华人民共和国药典》。 现代的动物实验和临床试验都已证明罗布麻的饮用安全性。虞颖映、王海明[12]用小鼠对市售罗布麻茶的饮用安全进行了食品安全性毒理学评价。小鼠经口急性毒性实验、遗传毒性实验、传统致畸实验。结果表明罗布麻茶提取物对雌雄大、小白鼠的急性经口LD50均大于10.0 g/kg;微核试验、精子畸形试验和致畸试验结果表明罗布麻茶无致突变、致畸作用;30 d短期喂养试验结果表明受试物对实验动物大鼠的生长情况、血液学和生化指标、主要脏体比及组织器官均无潜在毒性影响。 罗布麻茶在人体摄入量100倍范围内对实验动物的各项毒理学指标均未产生毒理作用，因此从食品安全性毒理学试验证实了罗布麻可作为安全的天然植物茶。 (二)功效成分的检测方法 1. 罗布麻中槲皮素、异槲皮苷和金丝桃苷的检测方法 罗布麻提取物中降血压活性成分有异槲皮苷、金丝桃苷、芦丁和槲皮素几类黄酮类物质，检测的目标物不同，因此前处理也有所不同。一是测定提取物中总黄酮(以芦丁为对照品)的含量来衡量样品中是否含有降压活性成分，常采用分光光度法比色法;二是随着分析检测技术的进步，利用现代色谱分离技术，将提 23 取物中异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素、芦丁进行色谱分离后，紫外或PDA检测;三是采用将提取物中异槲皮苷、金丝桃苷等黄酮类物质水解为槲皮素后，再测定水解产物中的槲皮素。常有检测方法有分光光度法、纸层析法、薄层层析法、反相高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、毛细管区带电泳-电化学检测法、液质联用仪等。 [13]范维刚等以芦丁为对照品，NaNO-AlCl-NaOH体系为显色剂分光光度法23 测定罗布麻叶内的黄酮类物质。建立了芦丁浓度-吸光度关系的回归方程为A=0.145+7.9464C,r=0.9993.平均回收率为97.67%,相对标准偏差为0.52%。刘东平[14]等以金丝桃苷作为对照品采用三种不同的显色剂建立的测定方法测定罗布麻叶中总黄酮含量。结果以金丝桃苷为对照品紫外分光光度法测定的结果最高(4.21%),以金丝桃苷为对照品三氯化铝显色法测定的结果次之(3.81%),而以金丝桃苷作为对照品亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法测定的结果最低(3.31%)。因此，他觉得以金丝桃苷为对照品，在酸性(加入醋酸一醋酸钠缓冲液)条件下加入三氯化铝显色法后的测定方法为罗布麻叶总黄酮含量测定的适用方法。第一种直接紫外检测的方法，杂质干扰太大，结果偏高，方法不可取。该文献认为总黄酮测定的经典主法以芦丁为对照品比色测定，但新疆的罗布麻中芦丁含量很低， [15] 因此他推荐用罗布麻中含量较高的金丝桃苷来作对照品。范维刚，解成喜等以芦丁为对照品，NaNO-A1C1-NaOH体系为显色剂分光光度法测定罗布麻叶内23 的黄酮类物质。相关系数0.9993,平均回收率为97.67% (相对标准偏差为0.52 %。 [16]黄湘兰、曾凡采用薄层层析法测定罗布麻叶水浸膏中总黄酮和槲皮，也取 [17]得了比较满意的结果。刘景国，刘文亮等也采用薄层色谱法测鉴别罗布麻的 [18]活性成分。范维刚以采用反相高效液相色谱法测定了罗布麻叶中槲皮素和山萘酚。色谱柱为Nova-pak C(150mm×4.6 mm i.d.)，流动相为甲醇+1,乙酸梯度18 洗脱，流速为0.6 mL/min，检测波长为360nm。槲皮素在0.0137,0.136μg、山萘酚在0.0053,0.0265μg范围内呈良好的线性关系，相关系数分别为0.9998和0.9980。槲皮素的回收率为99.6,，RSD为0.97,;山萘酚的回收率为98.2, ， [19]RSD为2.0,。韩利文等建立罗布麻叶中有效成分金丝桃苷的HPLC含量测定方法,并且对不同种属和产地的罗布麻叶进行比较。采用Shim-Pack VP-ODS色谱柱，乙腈-四氢呋喃-0.1%醋酸(15.5?5.5?79)为流动相，流速10 mL/min，检测 24 波长为360 nm，柱温为30 ?，进样量20μL，结果 金丝桃苷线性范围0.01,0.2 [4]mg/mL (γ=0.9999)。郁韵秋等采用HPLC法同时测定罗布麻浸膏粉中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量。样品以甲醇溶解后，过滤进色谱分析。色谱柱为YMC-Pack C(250mm×4.6mm)，流动相为乙腈-甲醇(10:1)和0.4,磷酸，梯度18 洗脱;二极管阵列检测器:检测波长360nm;分别以金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品为外标，用标准曲线法进行定量(在0.25,10μg,mL的范围内，金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的浓度与吸收峰面积之间线性关系良好，相关系数分别为γ=0.9994、γ=0.9995、γ=0.9996，回收率在85.57,-99.96,之间(RSD小于4.45,)( 生物酶解的技术也应用到罗布麻活性成分提取和检测中，所得到的产物和产 [20]物量也比经典方法水解技术多。张语迟等采用酶解的技术对样品进行前处理后，用高效液相色谱法和电喷雾质谱联用技术并结合核磁共振和紫外光谱技术对复合酶提取的罗布麻叶成分进行了分析，结果表明复合酶可显著提高罗布麻叶的提取效率，提取物中白麻苷、芦丁、金丝桃苷、广寄生苷、乙酰化异槲皮素、乙酰化金丝桃苷、山奈酚-3-0-葡萄糖苷、山奈酚-3-0-半乳糖苷、槲皮素、山奈酚和贯叶金丝桃素含量明显增多，并得到了常规提取方法中不能得到的槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸、广寄生甘等化合物。同时张语迟也用电喷雾液质联用仪测 [21]定了罗布红麻和罗布白麻的16种主要成分。 (三)检测方法实例 方法一 保健食品中罗布麻总黄酮含量的测定(分光光度比色法)[22] (方法来源《保健食品检验与技术规范》2003版) 1试剂 1.1聚酰胺粉 1.2芦丁标准溶液; 称取5.0?芦丁，加甲醇溶解并定容至100ml，即得50ug/ml。 1.3乙醇:分析纯。 1.4甲醇:分析纯。 2分析步骤 25 2.1试样处理:称取一定量的试样，加乙醇定容至25ml，摇匀后，超声提取20分钟，放置，吸取上清液1.0ml，于蒸发皿中，加1g聚酰胺粉吸附，于水浴中挥去乙醇，然后转入层析柱。先用20ml苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25ml。此液于波长360nm测定吸收值。同时以芦丁为标准品，测定表标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮的含量。 2.2芦丁标准曲线: 吸取芦丁标准溶液:0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10ml比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。求回归方程，计算试样中总黄酮的含量。 3计算和结果表示 A，V2，100 X= V1，M，1000 式中: X---试样中总黄酮的含量，?/100g A---由标准曲线算得被测液中黄酮量，ug; M---试样质量，g; V1---测定用试样体积，ml; V2---试样定容总体积，ml。 计算结果保留二位有效数字。 [4]方法二 罗布麻提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量测定 1、方法提要 采用HPLC法同时测定含罗布麻提取物中金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素的含量。样品以甲醇溶解后，过滤进色谱分析。色谱柱为ODS-C18 (250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-甲醇(10:1)和0(4,磷酸，梯度洗脱;二极管阵列检测器:检测波长360nm;分别以金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素对照品为外标，用标准曲线法进行定量( 2、试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 2.1乙腈:色谱纯。 26 2.2甲醇:色谱纯。 2.3 磷酸。 2.4 金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素标准品。 2.4.1标准品储备液 分别准确称取2.4对照品适量, 用甲醇超声溶解后定容于10 mL的容量瓶, 并稀释至刻度，制得的金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素储备液分别约为1.00 mg,mL。 2.4.2标准品溶液应用液 分别准确吸取对照品储备溶液0.1mL 置于10 mL的容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度，以此类推，逐级稀释，临用现配。 3、仪器及条件 3.1回流装置。 3.2 水浴锅。 3.3高效液相色谱仪:带紫外检测器或二级管阵列检测器。 (250mm×4.6mm,5μm)，柱温:35? ，3.4 色谱条件 色谱柱: ODS-C18， 流动相:A-0.4,磷酸，B-乙腈/甲醇(10:1)，流速1 mL/min，梯度洗脱:0,15 min，B由16,线性改变到23,;15-28 min，B由23,线性改变到35.4,;至28 min停止洗脱，回到初始比例平衡7 min后进行下一个样品分析，检测波长为360nm。 4、测定步骤 4.1 样品处理 精密称取样品0.2000g或相当，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后超声30 min处理，再定容到100 mL(过0. 45μm的滤膜后供HPLC分析。 4.2 标准曲线 分别准确吸取标准应用液(2.4.2)配成约为0.2μg/mL,5.0μg/mL的标准系列，按3.4色谱条件进行分析，外标法定量。 4.3 标准品和样品进样量均为20μL，测定峰面积，用外标法计算含量。 5、方法学指标 5.1 线性范围 分别制作3种物质的线性范围，在0.2μg/mL,5.0μg/mL范围内均成线性关系，以对照品的峰面积对相应的浓度进行线性回归，得回归方程分别是:金丝桃苷Y=26.48x,1.16(γ=0.9994)，异槲皮苷Y=22.48x,0.48(γ=0.9995)，槲皮素 27 Y=28.31x,0.68(γ=0.9996)。 5.2 回收率与精密度 同一样品溶液中，分别加入0.5ng三种对照品后混匀，平行6份，按照已建立的色谱条件测定，计算回收率。金丝桃苷的平均回收率90.94% (RSD=4.45%)、异槲皮苷的平均回收率99.96% (RSD=3.21%)、槲皮素的平均回收率85.57% (RSD=0.88%)。 6、谱图 图LBMY02 标准溶液(a)和罗布麻样品提取液(b)的色谱图 (1(金丝桃苷，2(异槲皮苷，3(槲皮素) 7、方法讨论 7.1 波长的选择 在200-400nm范围内对金丝桃苷、异槲皮苷和槲皮素进行紫外吸收扫描，金丝桃苷最大吸波长分别是254和356 nm，异槲皮苷最大吸波长是254和346 nn3，槲皮素最大吸波长是254和368 nm，兼顾3种物质的最大吸收，选择360 nm为检测波长( 图LBMY03 金丝桃苷(a)，异槲皮苷(b)和槲皮素(C)的紫外吸收扫描图 7.2 流动相选择 在相同的梯度洗脱程序下考察了3种不同的流动相体系，分别是?A,乙腈 28 ,甲醇(10:1)，B,0.4% 磷酸，?A,乙腈,甲醇(10:1)，B,0.2,三氟乙酸，?A,乙腈，B,水(结果显示，其分离度分别达到1.64，1.62和1.58，均能达到基线分离(考虑到?的分离度最好，所以本文最终选择其作为流动相条件。 (四)参考文献 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京,化学工业出版社,2005. 2 凌关庭. 保健食品原料手册(第二版). 化学工业出版社, 2006 3 严秀珍(白麻和红麻化学成分的测定(中成药研究，1987(12):27—29 4 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Separation and synthesis of pinoresinol diglucoside moides olive J Am Chem Soc 1976,98(17):5412 7 虞颖映，邵健忠，王海明. 罗布麻茶对心血管系统的生物学效应研究. 同济大学学报(医 学版),2006,27(4):40,44 8 何念善.罗布麻复合茶治疗原发性高血压病56例临床观察[J].四川中医,2004,22(7) Kagawa T，Nakazawa Y，et a1(Studies on Antihy-pertensive effect of luobuma (Apocynum 9 venetum L() leaf Extract(2)(Natural Medicines，2004，58(6):299,302 10 吴向起，杨新波，杨解人等. 罗布麻提取物药理活性的研究进展.解放军药学学报，2009,25 (5):435,439 11 Kim D，Yokozawa T，Hattori M， Kadota S， Namba T. 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L.)的干燥成熟种子。秋季采收成熟果实，晒干后入药。决明略呈菱方形或短圆柱形，两端平行倾斜，长3,7mm，宽2,4mm，表面绿棕色或暗棕色，平滑有光泽;小决明呈短圆柱形，较小，长3,5mm，宽2,3mm，表面棱线两侧各有一宽广的浅黄棕色带。本品粉末为黄棕色，气微，味微苦。决明主产于江苏、安徽、四川等地;小决明主产于广西、广东、云南等地，以野生或半野生为主，产量较小。中国卫生部2002年录入为可食用又可药用的两用原 [1][2]料 。 决明子，别名草决明，马蹄决明。味甘、苦、咸、微寒。主要功效:清热 [1]明目，润肠通便。主要功效成分有蒽醌、吡酮类、多糖、氨基酸和微量元素等。其药理作用:降血压作用、降血脂作用、增强免疫功能、对cAMP磷酸二酯酶 [3]具有抑制作用、泻下作用、抗菌作用等。 (一)主要功效成分介绍 大、小决明子的种子中均含有蒽醌类化合物、吡咯酮类化合物、脂肪酸类、氨基酸和无机元素。其主要功效成分为蒽醌类化合物成分，含量约占1.1,, [4]1.2%。游离蒽醌含量约为0.03,，结合蒽醌含量约为1.23,。蒽醌苷元中主要 [5]含有大黄酚(0(28,)，生决明中含量较炒决明高。目前，大多数学者认为，蒽醌糖苷是决明子发挥作用的主要成分。 1(组成、结构与性质 随着现代分析技术的快速发展，特别是红外光谱、核磁共振和质谱联用技术的出现并应用到未知物结构的解析，决明子中蒽醌类化学成分及其分子结构也 [6] [7] [8][9][10]被一一探明。目前，已知的决明子蒽醌类化合物主要有28种，分别为大黄素(Emodin)、大黄酚(Chrysophand)、大黄酸(Rhein)、大黄素甲醚(Physeion)、芦荟大黄素(Ale-emodin)、去氧大黄酚(Chrysarobin)、大黄酚-9-蒽酮(Chrysophanic acid-9-anthrone)、钝叶素(Obtusifolin)、钝叶决明素(Obtusin)、甲基钝叶决明素 30 (Chryso-obtusin)、橙钝叶决明素(Aurantio-obtusin)、奎司丁(Questin)、葡萄糖钝叶素(Gluco-obtusin)、葡萄糖钝叶决明素(Gluco-obtusin)、葡萄糖橙钝叶决明素(Gluco-aurantio-obttrsin)、1-去甲基橙钝叶决明(1-desmethvlaurantio-obtusin)、1-去甲基钝叶决明素(1-desmethvlobtusin)、1-去甲甲基钝叶决明素(1-desmethylehryso-obtusin)、大黄酚-10-10’ -二蒽酮(Chrysophanol-10-10’ bianthrone)、灰绿曲霉多羟基蒽酮8-O-D萄糖-吡喃糖甙(Eehinul polydrieanthrone-8-O-D-glucopyrmloside)、有翅决明素1-O-β-D-吡喃葡萄糖甙(Alaternin-1-O-β-D-glucpyranoside)、大黄素-6-葡糖甙(Emodin-6-gluoside)、大黄素蒽酮(Emodin anthrone)、甲基钝叶决明素-2-O-β-D-吡哺葡糖甙(Chryso-obtusin-2-O-β-D-glucopyranoside)、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖甙(Chyscion-8-O-β-D-glueopyranoside)、1,3-二羟基-6-甲氧基-7-甲基蒽醌(1,3-dihydmxy-6-methoxy-7-methyl anthraquinone)、1-羟基-3,7-二甲醛基蒽醌(1-hydroxy-3,7-diformyl anthraquinone)、大黄酚-1-β-龙胆二糖甙(Chrysopahol-1-β-geniohioside)。 蒽醌是三环类有机化合物，分子结果式见图JMZ01，是蒽醌类衍生物的母体;蒽醌类化合物的结构式如图JMZ02。 图JMZ01 蒽醌分子结构式 31 图JMZ01 蒽醌类化合物分子结构 蒽醌 蒽酚 蒽酮 图JMZ03 蒽醌、蒽酚与蒽酮转化示意图 蒽醌类化合物包括蒽醌衍生物、蒽酚衍生物、蒽酮类衍生物。在一定条件下，这三类物质是可以相互转化的，蒽醌在酸性环境中被还原，可生成蒽酚及其互变异构体—蒽酮。植物体内的蒽醌类化合物可呈游离形式或糖苷形式。蒽醌苷中的糖多为葡萄糖，部分为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等。蒽酚(或蒽酮)的羟基衍生物常以游离状态或结合状态与相应的羟基蒽醌共存于植物中。蒽酚(或蒽酮)衍生物一般存在于新鲜植物中。新鲜决明子经两年以上贮存则检测不到蒽酚。如果蒽酚衍生物的中位羟基与糖缩合成苷，则性质比较稳定，只有经过水解除去糖才能易于被氧化转变成蒽醌衍生物。 2(生物学功能 现代药理研究表明，决明子具有降血脂、降血压、抑菌、明目、增强免疫、利尿、抗氧化、抗衰老、抑制血小板凝集、缓泻和润肠通便功能等活性，其中主要成分,蒽醌类化合物，对高血压、高血脂等心血管疾病均有较好疗效，但长期服用对人体有害。 决明子提取物对动物均有一定的降压作用，乙醇提取物对试验用自发遗传性高血压大鼠血压有明显降低作用，给药后收缩压、舒张压明显降低(P<0.01)，而且对呼吸、心率无影响。其脂溶性部分在10 mg/kg时呈明显降压作用(p<0.05) [11][12]作用的幅度和时间均比利血平更为显著。周然等对17例高血压病患者服用决明子茶(用开水浸泡决明子当茶饮)，2-3袋/d，45d为1疗程。结果发现收缩压和舒张压有明显的降低，根据对高血压治疗的疗效标准判断，显效6例，有效6 [13]例，无效5例。崔斌等人对决明子茶剂治疗原发性高血压26例临床观察，降压效果明显。 32 3(安全性(毒理) 决明子提取物经小鼠LD50为36.35?2.38 g/kg(为水煎剂小鼠腹注)。乙醇提取液小鼠90d亚慢性毒性试验的最小毒副作用剂量为5.0g/kg，折合人体为3g/d。毒理学试验表明本品不宜长期服用[2]。 [14][15]周宇红等, 高芃等用决明子乙醇提取物对健康Wistar大鼠喂饲13周，解剖观察脏器变化，喂饲决明子各组均出现肾脏肿大，色泽灰黑，肠系膜淋巴结肿大，呈灰白椭圆形结节状突起，结肠肿胀，浆膜充血，肾小管上皮细胞内可见棕褐色颗粒样物质沉积，黑色素染色阳性，动物睾丸曲细精管萎缩，无生精细胞等变化，而对照组无上述病理改变。认为决明子长期服用，可引起肾、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、睾丸等靶器官病理改变，提示决明子不宜长期大量服用。 (二)功效成分的检测方法 1. 决明子类保健品中总蒽醌类化合物的检测方法 醌类化合物(quinonoids)是指分子内具有不饱和环二酮结构(醌式结构)或容易转变成这样结构的天然有机化合物。天然的醌类成分多为有色结晶，且随着母核上酚羟基等助色团增多，可显黄、橙、棕红色以至紫红色;蒽醌类化合物中茜草素型颜色(红?紫)较大黄素型(橙?黄)深。蒽醌类化合物多有荧光，并且在不同的pH条件下所呈的荧光不同。蒽醌类化合物的检测方法也是根据其特性建立，如紫外、示差、荧光检测器检测。 游离醌类极性较小，一般溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂，不溶或难溶于水;与糖结合成苷后极性显著增大，易溶于甲醇、乙醇中，溶于热水，但在冷水中溶解度较小，几乎不溶于乙醚、苯、氯仿等极性较小的有机溶剂中。因此，蒽醌的提取常用氯仿、乙醚、乙醇、甲醇来提取。 根据蒽醌类化合物的理化特性，建立了一系列定性和定量的检测方法。其中定性方法包括薄层色谱法，质谱法(MS)、氢谱法(HNMR)、碳谱法(CNMR)、核磁共振(DEPT)的联用，红外光谱法、可见光谱法、紫外光谱法等。定量方法包括分光光度法、流动注射-化学发光法、荧光分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描法、毛细管电泳法(CE)和色谱-质谱联用法等。 决明子中蒽醌类化合物的提取方式有水浸提、索氏提取法、超声提取法、水煎法和微波萃取法(MAE)。普遍认为微波萃取法(MAE)是提取蒽醌类化合物最 33 [16]有效的提取方法。靳丹虹等通过微波辅助提取法与索氏提取法、超声提取法的比较研究和优化,确定提取决明子中蒽醌类化合物的最佳工艺，采用HPLC测定决明子提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚5种蒽醌类化合物的含量。结果显示微波辅助提取法效率最高，在乙醇浓度为80%，料液比为1?50，升温速率8?/min,于100?提取15 min时5种蒽醌类化合物的平均 [17]回收率为97.0%,RSD均小于1.8%。冯年平等通过对决明子微波萃取法(MAE)与常用提取方法(索氏提取法、超声提取法、水煎法)的比较研究。采用分光光度法测定决明子提取液中总蒽醌的含量，采用显微照相仪对表面结构及横切面状况进行观察.结果:MAE的提取率最高,是超声提取法的16倍,是索氏提取法的3倍,是水煎法的1.1倍,且MAE仅5min就已超过超声1h的提取率,15min已达到最高值。认为微波萃取法(MAE)是最有效的提取方法。粉碎前对样品进行适当干燥可 [18]提高总太黄酚的溶出量。李晓明，王跃生等对超微粉碎前后决明子进行大黄酚溶出量的对比研究。结果表明:在相同提取时间的条件下水煎煮决明子药材，大黄酚的提取率只有7(6, ，而经不同条件超微粉碎后的各组决明子的提取率分别提高到69.7, 、57.1, 、32.4,;5min水浸泡下，决明于微粉中总太黄酚含量与药材水煎煮90min的含量相当。 早期的蒽醌检测方法用比色法测定了决明子中的游离及结合蒽醌。基十蒽 [19]醌类物质的Bomtrager显色反应与醋酸镁显色反应，R(Paris等(1958年)建立 [20]了比色法测定蒽含量的方法。王慕邹等先用氯仿提取游离的蒽醒衍生物，然后经硫酸水解结合蒽醒后再次用氯仿提取，用5%NaOH-2%氨水混合碱液显色，以1,8-二羟基蒽酯为对照品，在490 nm下测定蒽醌(游离与结合型)含量。1986 [21]年王慕邹等又改进了方法，认为0(5,醋酸镁甲醇反应比色法(测定波长最大至513 ngn)比Bomtrager(5,NaOH-2,NH4OH )反应比色法(测定波长500,518 [22]nm)稳定时间长，反应更灵敏，杂质干扰少，最大吸收峰波长稳定。姚桂根等也采用醋酸镁-甲醇作为显色剂，认为显色物质更加稳定，该方法比碱液法显色 [23]后更加稳定。杨黎燕等提出了三氯化钛一分光光度法测定决明子中总蒽醌含量的新方法。该法是基于在强酸性介质中，亚钛盐可还原蒽醌类化合物，从而使紫色的亚钛盐转变为黄色的钛盐，该物质在349nm处有最大吸收。该法的线性 [24]范围为6,40μg,mL，r=0.9996，回收率为96,,98,。张小梅等采用聚酰 34 胺吸附纯化样品，醋酸镁显色，紫外分光光度法测定。在4.6,18.4 μg/ml浓度范围内对照品1,8-二羟基蒽醌的吸收度与浓度线性关系良好，相关系数r=0.9998.平均回收率为101.0%,RSD=2.48%(n=9)。 [25]蒽醌类化合物一般都有荧光性质。因此，杨黎燕，郎惠云将提取后的总蒽醌溶解在丙酮溶液中，利用蒽醌有较强的荧光性质，测定其荧光强度，据此建立了中药中蒽醌的荧光测定新方法，其荧光强度与蒽醌含量在0.4,50g/mL范围 -内呈良好的线性关系。基于同理他们建立了在碱性条件下，蒽醌对C1O-Luminol化学发光体系的显著抑制作用。结合反向流动注射技术，提出了蒽醌的流动注射(化学发光分析新方法。蒽醌的质量浓度在0.5,100g/mL范围内与化学发光的抑制强度呈良好的线性关系。检出限为0.05μg/mL，RSD=1.6, ，采样频率为 [26][27]150次/h，回收率为105,,107.5,。贾宝秀等利用蒽醌在碱性溶液中形成一种红色物质，该物质对化学发光体系有显著的抑制作用，且抑制的程度与蒽醌浓度呈线性关系，测得线性范围为0.00863,10.00μg/ml，检出限为2.59 ng/ml，相对标准偏差(RSD)为2.4%. 随着高效液相色谱技术的不断发展，陆续出现了用HPLC法、反相HPLC法测定决明子中蒽醌类化合物的报道。利用色谱柱良好的分离效果，高灵敏度的检测器，检测蒽醌单一化学成分。药典2005版中决明子有效成分测定采 [1]用高效液相色谱-紫外检测 方法， 以C18为分析柱，甲醇-0.1%磷酸溶液(85:15)为流动相，检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。方法采用大黄酚为对照品，决明子按干燥品计算，含大黄酚(C15H10O4)不得 [28]少于0.080%。于超等建立用反相HPLC法测定决明子中蒽醌类化合物含量的方法。方法使用symmetry(r)C18色谱柱(5 um,3.9mm×250 mm)，甲醇-0.1%磷酸溶液(90?10)为流动相,检测波长为440 nm，流速为0.8 mL/min，柱温25 ?，范围内5种蒽醌类成分均呈现良好的线性关系(r,0.9984)，精密度可靠(RSD,1.8)。 [29] 王宾豪等采用高效液相色谱法测定决明子中5种蒽醌类成分的含量。具体方法条件:色谱柱:Shim-pack CLC-ODS C18柱，流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液梯 [30]度洗脱，流速:1mLl/min，检测波长440 nm。张毅等采用HPLC测定不同产地决明子中7种蒽醌类成分的含量。以Inensil ODS-3为色谱柱，乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度流速0.8 mL/min，检测波长278 nm，7种蒽醌类化学成分的 35 [16]回收率均在95%,105%。靳丹虹等通过微波辅助提取法与索氏提取法、超声提取法的比较研究和优化，采用HPLC测定决明子提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚5种蒽醌类化合物的含量，结果显示微波辅助提取法效率最高,在乙醇浓度为80%，料液比为1?50，升温速率8?/min，于100?提取15 min时5种蒽醌类化合物的平均回收率为97.0%，RSD均小于1.8%。 (三)检测方法实例 [1] 方法一 决明子中大黄酚化合物含量的测定 1、方法提要 样品用甲醇回流提取，提取物用盐酸水解，再用三氯甲烷提取，挥干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯溶解后上液相色谱测定。 2、试剂及对照品 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 2.1乙腈:色谱纯。 2.2甲醇。 2.3 磷酸。 2.4 大黄酚对照品:中国药品检验所。 2.5标准品储备液 大黄酚对照品适量，加无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)制成每1ml含20μg的溶液，即得。 3、仪器及条件 3.1回流装置。 3.2 水浴锅。 3.3高效液相色谱仪:带紫外检测器或二级管阵列检测器。 3.4 色谱条件 色谱柱 C18柱( 5μm , 250 mm × 4. 6 mm ), 流动相以甲醇-0.1%磷酸溶液(85:15)，检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。 4、测定步骤 36 4.1 样品处理 取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，置水浴上加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，蒸干，加10%盐酸溶液30ml，置水浴中加热水解1小时，立即冷却，用三氯甲烷摇摇提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，过0. 45μm的滤膜供HPLC分析。 4.2 标准曲线 分别准确吸取标准应用液(2.5)配成一定比例标准系列，按3.4色谱条件进行分析，外标法定量。 4.3 测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 5、 结果判定 本品按干燥品计算，含大黄酚(C15H10O4)不得少于0.080%。 16]方法二 微波辅助提取-HPLC测定决明子中的5种蒽醌类化合物[ 1、方法提要 通过微波辅助提取法提取决明子蒽醌类化合物，采用HPLC测定提取液中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚5种葸醌类化合物的含量。结果显示微波辅助提取法效率高，在乙醇浓度为80,，料液比为1:50，升温速率8?,min，于100?提取15 min时5种蒽醌类化合物的平均回收率为97.0,，RSD均小于1.8,。试验同时对微波辅助提取法和传统的提取方法,索氏提取法、超声提取法进行了提取效率比较研究和优化，微波辅助提取法在提取时间和提取效率有明显优势。 2、试剂及对照品 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 2.1甲醇:色谱纯。 37 2.2 乙醇。 2.3 磷酸。 2.4 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚标准品:中国药品生物制品检定所。 2.5标准品储备液 准确称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚标准品适量，用甲醇配成含芦荟大黄素94.00 mg/L、大黄酸57.00 mg/L、大黄素102.00 mg/L、大黄酚107.00 mg/L、大黄素甲醚95.00 mg/L的标准储备溶液，置于,20?冰箱保存。 2.6 标准应用液 准确吸取(2.5)标准储备液，用甲醇逐级稀释成所需浓度，临用现配。 3、仪器及条件 3.1 超声波清洗器 3.2 索氏提取器或回流装置。 3.3 微波样品处理系统:带聚四氟乙烯样品提取罐。 3.4 水浴锅。 3.5 样品筛:孔径为380μm。 3.6 高效液相色谱仪:Agilent 1200，带UV紫外检测器或PDA二级管阵列检测器。 3.7 色谱条件 色谱柱 :Lichrosphe C18柱( 5μm , 250 mm × 4. 6 mm ); 流动相:甲醇,0.1%磷酸溶液(V/V，80:20);检测波长为254nm;流速1.0mL/min。 4、测定步骤 4.1 样品处理 (1) 微波辅助提取法:将决明子粉碎过380μm筛，精确称取0.3 g置于提取罐内罐中，加入15 mL乙醇提取液，盖上压力盖、密封、放入微波样品处理系统中升温速率8?/min，至100?进行提取。提取完毕后将提取内罐中的提取液全部转移并用少量提取剂清洗内罐，合并清洗液和提取液，过滤、挥干后用甲醇溶液溶解并将其转移到10 mL容量瓶中并定容至刻度。 (2)超声提取法(提取方法对比):将决明子粉碎过380μm筛，精确称取0.3 g 38 置于30mL锥形瓶中，以15mL 80,的乙醇为提取剂，放入超声波仪器中进行提取30min。提取液经过滤、挥干后用甲醇溶液将其转移到10 mL容量瓶中并定容至刻度。 (3) 索氏提取法(提取方法对比):将决明子粉碎过380μm筛，精确称取1.2 g置于索氏提取器中，以60mL、80,的乙醇水溶液为提取剂进行提取。提取液经过滤、挥干后用甲醇溶液将其转移到10 mL容量瓶中并定容至刻度。 4.2 标准曲线 分别准确吸取标准应用液(2.5)配成一定比例混合标准系列，按(3.7)色谱条件进行分析，外标法定量。 4.3 测定 标准品溶液与样品提取液各进样20μL，样品加标保留时间定性，峰面积外标法定量。 5、方法学指标 5.1 线性范围 取适量标准储备液，用甲醇逐级稀释一系列标准，以峰面积为纵坐标，浓度(mg/L)为横坐标绘制工作曲，计算相关系数和线性范围。结果如表JMZ01所示。 表JMZ01 5种蒽醌类化合物线性回归及线性范围 5.2 精密度及稳定性试验 吸取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚分别进样6次。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的精密度(RSD)分别为:0.63,，0.35,，0.60,，0.57,和0(67,。 分别于0h，2h，4h，6h，8h，10h，12 h吸取上述样品溶液在3.7色谱条件下20μL ，其峰面积的RSD均小于1.76,，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。 39 5.3 加样回收率试验 精密称取样品0.3 g，加入一定量5种蒽醌类化合物标准品，按照上述微波辅助提取法进行提取并采用上述(3.7)色谱条件进行测定，测定结果显示5种蒽醌类化合物的回收率分别为:芦荟大黄素98.3,、大黄酸96.2,、大黄素95.5,、大黄酚97.2,、大黄素甲醚97.4,，5种蒽醌类化合物的平均回收率为97.0,，回收率高。 6、谱图 图 JMZ04 决明子5种蒽醌类化合物标准和样品色谱图 7、方法讨论 7.1 微波辅助提取法溶剂浓度的影响 根据蒽醌的理化性质，能很好的溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，本文选择毒性小的乙醇作为提取溶剂。提取溶剂溶剂的浓度是影响提取效率的重要因素。微波提取时，在升温速度为8?,min，设定温度为100?，提取时间为5 min的条件下，考察了乙醇浓度分别为20,，40,，60,，80,及100,条件下对决明子5种蒽醌化合物提取效率的影响.结果如图JMZ05所示，随着乙醇浓度的增加，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素的提取率明显增加，当乙醇浓度达到100,时，芦荟大黄素的提取率有所下降。乙醇浓度的增加，降低了溶剂的极性，这可能是造成芦荟大黄素的提取效率有所下降的原因。由图JMZ05可知，在5种蒽醌类化合物中芦荟大黄素，大黄酚和大黄酸含量较高。当乙醇的浓 40 度达到80,时，5种蒽醌类化合物提取率总和较高，其中芦荟大黄素的提取率最高，故选定提取剂乙醇的最佳浓度80,。 图JMZ05 乙醇浓度的影响 图JMZ06 提取时间的影响 7.2 微波辅助提取法提取时间的影响 考察了提取时间对5种蒽醌化合物提取率的影响。结果如图JMZ06所示，随着时间的增加，大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的提取率有所升高但幅度不大。时间对芦荟大黄素的提取效率影响较大，其变化规律与提取剂浓度对提取率的影响相似。随着时间的增加，芦荟大黄素的提取效率逐渐增加，10,15 min时提取效率趋于平行且最高。当提取到达20 min时，芦荟大黄素的提取效率有所下降，这可能是由于长时间提取破坏了芦荟大黄素的结构。最终选定15 min为最佳提取时间，此时5种蒽醌类化合物总的提取率亦最高。 7.3 提取方法比较 试验对三种提取方法:?微波辅助提取法、?索氏提取法和?超声提取法进行提取效率比较。按4.1中的提取方法，结果如表JMZ02所示，3种提取方法的提取效果有明显差别。微波提取法仅用10 min就已超过超声提取2 h、索氏提取2 h的提取率。这可能是由于微波加热原理-分子内水分子剧烈振动产生大量热，使决明子的有效成分得以较快的溶出从而节省了提取的时间，提高了提取效率。实验结果表明，微波提取法具有高效、节能、省时和易于操作等优点。因此，本文采用了微波提取法提取样品中蒽醌类化合物。 41 表JMZ02 三种提取方式的提取效率比较 8、结论 通过对决明子中蒽醌化合物的提取方法、提取溶剂浓度、提取时间等方面的试验，确定最佳检测条件为:微波辅助提取样品中蒽醌类化合物，在乙醇浓度为80,，料液比为l:50，微波升温速率为8?,min，并于100?提取l5min。实验结果的表明，采用微波方法-液相色谱法测定决明子中蒽醌类化合物的是可行的，且较其他方法提取率有所提高，大大缩短了提取时间，节省试剂。 (四)参考文献 1. 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京,化学工业出版社,2005. 2. 凌关庭. 保健食品原料手册(第二版). 化学工业出版社, 2006 3. 钟先锋等. 决明子有效成分的提取. 南昌大学学报(理科版), 2004, 28(1):96,98. 4. 陆慧英(分光光度法测定决明子中的蒽醌类成分[J](苏州医学院学报，1999, 19(5): 503, 511. 5. 冯晓冰(决明子药材中大黄酚含量的反向HPLC法测定[J](分析测试学报, 1999, 18(4): 80. 6. 陈秋东,徐志南等. 中药决明子中蒽醌类活性成分的生化研究进展.中药 材,2002,25(6):442,445. 7. 梅全喜，毕焕新. 现代中药药理手册. 中国中医药出版社, 1998. 8. 焦素芳，韩海东. 决明子的化学成分与药理作用. 临床合理用药,2010,3(14):81,83. 9. 贾振宝,丁霄霖. 决明子中蒽醌类成分研究.中药材,2006,29(1):28,29. 10. 贾振宝等. 决明子中蒽醌类化学成分的研究.林产化学与工业，2009，29(3):100,102. 11. 刘菊秀，苗戊，狄俊英，等(决明子降压作用的实验研究[J](天津中医，1990，6(5): 37,38 12. 周然，侯振民(决明子茶临床疗效观察[J](山西中医，1992，8(6):12,13. 13. 崔斌(决明子茶剂治疗原发性高血压26例[J](中国民间疗法，1999，7(10):45. 14. 周宇红，汪会玲等. 决明子亚慢性毒性病理实验. 毒理学杂志,2000,19(3):265,266. 15. 高芃等. 决明子乙醇提取物的亚慢性毒性研究.中国食品卫生杂志.2004,16(5):410,415 42 16. 靳丹虹,梁芳慧，李敬筠等. 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