【doc】小鼠局灶性脑缺血的脑血流动力学和脑损害的评价

【doc】小鼠局灶性脑缺血的脑血流动力学和脑损害的评价 小鼠局灶性脑缺血的脑血流动力学和脑损 害的评价 一 ?436?中华实验外科杂志1999年9月第16卷第3期ChinJExpSurg,Septembe 小鼠局灶性脑缺血的脑血流动力学 和脑损害的评价 毛颖周良辅塑国浸.,^ ? 论着? ,I'7.5/., j6 【摘要】目的建立一种可靠的小鼠脑缺血模型,了解永久性和暂时性阻断血管后的脑病理生理 变化.CD一1小鼠t单侧大脑中动脉线栓阻断,监测脑血流,测量梗塞体积和血脑屏障破坏程度.结 暴小鼠均出现成熟缺血按心区和半暗区.不同缺血/再灌注时间产生不同缺血损害和血脑屏障破坏, 但有时限.结论建立了一种可靠,复翩性强的小鼠局灶性缺血模型血脑屏障破坏在缺血损害中起重 要作用.短时同缺血后的再灌注能减轻缺血性脑损害. 关键词旦盐堕!L,警丑:略脑屏障小鼠与盈;惫毋 Fcerebralhemodymamiesandbrain|njuryMAO IGng,ZHOULdangfu,YANGGuoyuan.DepartmentofNeurosurgery,HuashanHospital,S hanghai MedicalUniversity,Shanghai200040 [Abstract]ObjectiveToestablishareliablefocatcerebralisehemiamodelinmice.andtoasses s thepathophysblogicalchangesafterpermanentandtemporaryfocalcerebralischemiaindetail,Methods CD_1miceunderwentunilateralmiddlecerebra1arteryocclusion(MCAO),Cerebralbloodflow (CBF),braininfarctionandblood— brainbarrier(BBB)disruptionwereevaluatedintheocclusion/ reperfusiongroupwithdifferenttimeintervals.ResultsWell— definedischemiccoreandpenumbraarea appearedineachexperimentalanima1.Differenttimeintervalsofocclusionandreperfusionproduceddif— ferentdegreeofbraininjuryandBBBdisruption,ConclusionAreproducibleandreliablemousemodel forfocalischemiaresearchhadbeenestablished.CBFmonitoringisnecessarytoguaranteeocclusion andreperfusion,BBBdisruptionisinvolvedinthepathogenesisoffocalcerebralischemia, 【Keywords]Blood—brainbarrierIschemiaMiceMiddlecerebralarteryocclusion Reperfusion 本研究旨在建立较理想的能恢复灌流的小鼠局 灶性脑缺血模型,系统研究小鼠脑缺血后的病理生 理状态,结果报道如下. 材料和方法 1.实验分组雄性成年CD一1小鼠(Charles River,USA),体重30~35g.分为3组:pMCAO 组,左侧大脑中动脉(MCA)阻断24小时;tMCAO1 组,左侧MCA阻断1小时,再灌流23小时;实验中 发现该组少数小鼠再灌流后脑血流不能恢复,故另 分为tMCAOl—P组;tMCA02组,左侧MCA阻断 本课题为美国NIHNS一35089(GYY)和NS-33870(ALB)赘盘 责肪项目 作者单位,200040上海医科大学附属华山医院神经外科(毛 颢,周良辅)美国密戢根大学神经外科(橱国源) 2小时,再灌流22小时.1.5异氟醚气体麻醉.使 用反馈控制电热毯,控制体温为(37土1)C.PE一10 管作左侧股动脉插管监测血压和血气 2.脑血流测定激光多普勒血流测定仪 (LDF)(BPM2,Vasamedies)测量局部脑血流.选择 颅骨上三点测定(小鼠颅骨菲薄,颅骨外所测局部 CBF值与开颅所测值差异无显着性).A,矢状缝左 侧3.5mm,冠状缝后1mm处,为缺血中心区;B,矢 状缝右侧对应点,为缺血对照区;C,矢状缝左侧1 mm,冠状缝后1mm处,为缺血半暗区(图1A)测 量时间点为缺血后5分钟,6O分钟和24小时.再灌 注小鼠另加再灌注后5分钟和6O分钟时间点.血流 变化用缺血后cBF/缺血前基值()示. 3.插线模型(图1B)颈部正中切口,手术显 微镜下暴露左侧颈总动脉(CCA)和颈外动脉 , , \ 中华宴验外科杂志1999年9月第16卷第5期 ChinJExpSurg,September1999,Vo1.16.No.5 (ECA).电凝并剪断颈外动脉分支枕动脉和颈内动 脉(ICA)颅外段分支翼腭突动脉.于CCA分叉处切 断ECA,自断口送入末端呈球型5-0单股尼龙线, 直视下将线头转入ICA,向上至遏阻力为止,线头末 端至CCA分叉处距离为(11.O士0.5)mm.再灌注 小鼠在插线后1小时或2小时后,将尼龙线自ECA 断口徐徐拔出,实现再灌流. 圉1小鼠局灶性脑缺血模型制作示意图 注:(1)小鼠颅骨筒图,示脑血流监测部位 A;拔心区'B;对照区Ict映血半暗区}':Bregma点. (2)小鼠瞄血管解剖囤 4.脑梗塞体积测定缺血后24小时,将小鼠 麻醉,断头,取脑,于脑切片器中距额极1,3,5,7 mm处冠状切开大脑,将脑片浸入37?的2四氮 唑红(TTC)溶液中孵育3O分钟,取出置于1O甲 醛液中固定,拍照.采用计算机图像分析系统 (NIH1.61)处理摄影图像,计算梗塞面积和梗塞体 积.水肿对梗塞体积的影响采用Swanson等的方 法进行纠正. 5.血脑屏障(BBB)破坏区的免疫染色插线 后24小时,将小鼠断头,取脑,干冰速冻.10m厚 冠状脑片,Carnoy液中固定.10%正常羊血清用于 封闭非特异性反应.切片在1:400的兔抗小鼠白蛋 白抗体(Cappe1)中孵育.常规ABC法处理,3-3r_di— aminobenzidinetetr丑hydr0chl0ride(DAB)作为过 氧化物酶底物显色.采用计算机图像分析系统 (NIH1.61)计算6个冠状面(Bregma1.34,0.86, 0.38,一0.10,一0.58和一1.06)上白蛋白染色面 积. 6.统计学分析以ANOVA和经Bonferroni 校正的studentt检验判断pMCAO和tMCAO组 间的CBF,梗塞体积和BBB破坏的差异.数值以均 )表示. 数士标准误(i士 结果 1.脑血流改变pMCAO和tMCAO组插线 后5分钟缺血中心区的CBF降至缺血前的l4, 19,缺血半暗区的CBF降至缺血前的43, 82,各组间差异无显着性再灌注5分钟时,tM— CAO1组缺血中心区的CBF恢复至(75士13),并 在再灌注后1小时仍维持在(64士5).但有小鼠插 线拔出后,无再灌流征象,CBF低至(19士1)(5分 钟),再灌流1小时后仍只有(22士4),与tM— CAO1组CBF差异有显着性,分为tMCAO1一P组. tMCAO2组,再灌流后5分钟,1小时时,CBF分别 为(5】士6)和(46士8).tMCAO1组再灌流5分 钟的CBF明显高于tMCAO2组(P<0.05). 2.梗塞面积和体积tMCAO1组(16只)每个 切面的梗塞面积均明显小于pMCAO组(16只)和 tMcAO2组(16其).但是相同阻断时间,没有再灌 流征象的tMCAO1一P组(4只)的梗塞面积明显大 于tMCAO1组(P<0.05).tMCAO1一P组,pM— CAO组和tMCAO2组问梗塞面积差异无显着性. tMCAO1组的梗塞体积小于pMCAO组和tM— CAO2组(P<0.05);也明显小于tMCAO1一P组 (P<0.05). 3.BBB破坏程度测定tMCAO1组的白蛋白 免疫染色面积小于pMCAO组和tMCAO2组(每组 8只小鼠).但pMCAO组和tMCAO2组间BBB破 坏程度差异无显着性. 讨论 我们的小鼠插线MCAO模型改良于Naga— sawa和Longa的大鼠插线法局灶性脑缺血模型.插 线时不阻断同侧颈内动脉,拔线后可通过同侧血流 实现直接再灌流,与临床病理状态更接近.本研究中 LDF血流监测和梗塞体积计算证明此改良模型能 造成恒定的血流下降,拔线后能形成明显再灌流. H0ssmann[:认为,缺血核心区神经元因氧供低,无 论采用何种保护都无法存活.而半暗区神经元 可因缺血后病理因子作用,氧供进一步下降而死亡, 也可因各种治疗恢复氧供而存活.本小鼠模型优点 ?438塑!至!旦璺6卷第5期ChinJExpSurg,September1999,V01.16,N..5 在于存在与缺血核心区分界清楚的半暗区,此区脑 血流在MCA阻断后降至基值的50左右,便于脑 缺血的病理生理状态和治疗方法的研究. 本研究中小鼠线拴造成局灶缺血和再灌流的成 功率维持在85,95,失败原因主要有:麻醉意 外,蛛网膜下腔出血和血管内血栓形成LDF监测 发现拔线后仍呈低灌流状态的小鼠梗塞体积明显大 于灌流恢复的小鼠故实验中必须进行脑血流监测, 确保在血管阻断完全或恢复血流时研究缺血和再灌 注的病理机制. 我们比较pMCAO组和tMCAO组间梗塞体积 和血脑屏障破坏面积,结果发现,MCA阻断1小时 的tMCAO1组梗塞体积较其他两组明显缩小,但阻 断2小时造成的缺血损害与永久性阻断组之间没有 明显差别,说明短时间血管阻断后,恢复血流能挽救 缺血脑组织.在此小鼠模型上,恢复血流,挽救濒死 神经元的时限为1,2小时. 我们采用免疫组化染色法建立了小鼠的BBB 破坏的半定量方法,发现tMCAO1组免疫染色面积 明显小于tMCAO2组和pMCAO组,BBB破坏的 程度与梗塞体积相匹配,说明BBB破坏引起的血管 源性水肿在缺血损害中起重要作用但目前尚不能 确定BBB破坏是缺血损害的原因或结果. 参考文献 1SwansonRA,MortonMT,Tsao—WuG,eta1.As…mhutt— edmethodrmeasuringbraininfarctvolume[seecomments]J CerebBloodFlowMetab,1990,10:290298. 2HossmannKA.Viabilitythresholdsandthepenumbra0ffocal ischemi~AnnNeurol,1994,36:557567 (收稿}1998—08—21修回;1998.i0—10) B超在闭合性跟腱损伤中的诊断和治疗作用 刘小云梁楠楠顾洁夫罗维富唐学勤 1996年7月~1999年3月,我们采 用B超对跟腱闭台性损伤进行诊断和 指导治疗.取得了较满意效果,现报道如 下. 一 ,对象与方法 患者l3例,其中男l2例,女1例, 年龄18,6l岁,平均37.3岁,均为闭合 性损伤,运动性损伤9例,锐器损伤l 倒,钝物击伤2倒.病理性损伤l例.患 者俯卧位,足自然悬垂于检查床边缘,双 小腿外露,采用美国产DIAsoNIcs彩 色B超,选用额率为10MHZ探头,对跟 腱进行纵向和横向扫查,扫查时探头与 跟腱表面的皮肤之间放置承囊,以提供 充分的接触面和最佳的焦距区,扫查时 作者单位;430071武汉.湖北医科大学 附屠第二医院(刘小云,粱持楠,顾洁夫,罗维 亩);胡北省仙甘5市中医院(唐学勤) 被动屈伸踝关节,并进行捏和挤压三头 肌以动态观察跟腱损伤处的运动情况, 同时进行健侧对比. 二,结果 车组13例.行非手术治疗3倒(2 倒为急性不全断裂,l倒为病理性不全 断裂),11倒进行手术治疗,其中8倒为 完全性断裂(急性损伤5倒,陈旧性损伤 2例.病理性损伤l倒),3倒为不完全性 断裂(急性损伤2例.陈旧性损伤1例), 手术所见与超声检查结果全部相符合, 其超声声像表现:完全断裂显示跟腱细 线样的较强回声不连续.断端出现不均 质的低回声区或无回声区,不完全断裂 显示跟腱部分连续性中断捏小腿三头 肌和被动背仲踝关节时,可见断端低回 声和无回声区增宽.跖屈躁关节和挤压 小腿三头肌时.断端有合拢趋势,但急性 跟腱断裂超过横断面一半以上时.断端 ? 论着摘要? 始终留有低回声或无回声间隙.胨旧性 损伤其断端始终留有不均质低回声间 隙.. 三,讨论 我们观察发现.跟腱断裂一半以上 和跟腱陈旧性损伤中尽管授度跖屈躁关? 节,尽量挤压小腿三头肌,两断端也不能 完全合拢,术中对照观察发现,急性损伤 是由于近侧断端挛缩包裹成团所致,而 陈旧性损伤还与损伤处的血肿机化物填 塞于断端有关因此,对于非手术方法不 能完全合拢者手术治疗为佳.同时B超 扼提供跟腱损伤的程序和部位,有利于 术前手术的选择和制定.对于不完 全断裂可进行非手术治疗者.可在B超 指导下,让两断端充分对接合拢后进行 有效的外固定,有利于损伤处的修复. (收稿:1999—02—10)