牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应实验中的应用

牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应实验中的应用 牛血清白蛋白的抗血清在免疫学沉淀反应 实验中的应用 医学理论与实践2005年第18卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,Mar2OO5 ?实验研究? 牛血清白蛋白的抗血清在免疫学 沉淀反应实验中的应用 蔡玲斐 杭州师范学院医学院形态中心实验室,浙江省杭州市310012 摘要目的:制备牛血清白蛋白(BSA)抗血清,以探讨获取高效价抗血清的方法.方法:用BSA配制一定的浓 度,免疫家兔,以制备兔抗一BSA血清.利用免疫电泳,双向琼脂扩散试验和测定抗血清的效价.结果: 双向琼脂扩散在BSA0.5g/mL的浓度时,测得抗血清效价为1:32,对流免疫电泳结果显示BSA0.5g/mL与抗 BSA在1:16时形成一条清晰可见的沉淀线.结论:BSA免疫家兔可获取效价较高的抗血清. 关键词牛血清白蛋白(BSA)效价沉淀线免疫 中图分类号:R392.7文献标识码:A文章编号:1001—7585(2005)03—0254—02 ~imtionofAntisertmaofBovineSerumAlbumininlmnmnopredpitatloBR0nExperiment CAJIJno~fei.MedicalSchool,l,l鲁Teachers’College,H,~oucZ~Prov/nce310012 A】BsTObjective:ToprepareantiserumofbovineselMmalbumin(BSA)forobtaininghishfiterantiserum.M eth- ods:8elMillofanti—BsJwaspr印ardbyimmunizingrabbitswithBSA.nlefiterofantiserumwasdet~tedbyiml’llu— noeleetrophoresisanddoubleimmtmodiffusion.Ret~ts:nlefiterofantiserumwas1:32indoubleimmun odiffusionand counterimmunoelectrophoresisshowedaclearprecipitationlineintheratio1:16forBSA:anti—BSA(allat0.5g/na BSA).Conduslon:耵highertiterofantiserumisobtainedbyimmunizingrabbitswithBSA. KEYW0】RDSBovineserumalbumin(BSA),Titer,Precipitationline,Immunity 可溶性抗原(如血清,细菌浸出液,外毒素等)和 相应抗体结合,在适量电解质存在下,经过一定时 间,在二者比例适当时形成肉眼可见的沉淀物.可 分环状沉淀试验,絮状沉淀试验,琼脂扩散试验(单 向琼脂扩散试验,多向琼脂扩散试验),免疫电泳…1. 由于沉淀反应抗原多系胶体溶液,沉淀物主要是由 抗体蛋白所组成,制备可溶性抗体的物质有很多,但 处理的方法繁琐或价格昂贵,并且效价不高.因此, 寻找简单,快速,易操作的方法提供给教学单位实际 应用具有重要的现实意义.在免疫学的教学中,沉 淀反应是必不可少的,而在本科学生中此实验的操 作又必列其中.目前市场上生物制品缺乏某种可溶 性抗原与可溶性抗体的配备供应,且价格昂贵.为 了节约经费,使用方便,提高实验课的教学质量,笔 者采用牛血清白蛋白(BSA)免疫家兔,以获取较高 的BSA的抗血清,现将方法介绍如下. 1材料与方法 1.1BSA抗原的制备牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin,BSA),批号为O204,由杭州华美生物工程公 司提供.实验时以无菌生理盐水配制成20mg/mL 浓度的应用液,4?冰箱保存备用. 1.2进口琼脂粉由杭州华美生物工程公司提供. 1.3弗氏完全佐剂(Frenud)的制备石腊油40mL, 无水羊毛脂10g左右,经15镑20min高压灭菌制成 混悬液,加卡介苗1支(75mg/mL),用前在80~C水浴 中加热1h,将菌杀死. 1.4主要仪器(1)水平离心机,LD5—3A型.北 京医用离心机厂生产制造;(2)37?温箱,HH一400 型,北京医疗器械厂生产;(3)电泳仪.DYY一6B型 稳压稳流电泳仪,北京六一仪器厂制造. 1.5免疫动物的方法及途径 1.5.1试验动物:家兔(12只),无免疫接种史,体重 2.0,2.5kg,雌雄并用,由杭州师范学院医学院动物 室提供.采用皮下多点免疫法,牛血清白蛋白浓度 为40mg/兔. 1.5.2福氏完全佐剂抗原的制备_2J:取羊毛脂,石 腊油为1:4,1:6混合后高压灭菌,与等体积的 20mg/mL牛血清白蛋白混合,并按lmL加0.25, lmg卡介苗加入研钵中共同研磨使之成为油包水的 乳液. 1.5.3免疫方法l_3j:首次取福氏完全佐剂抗原液 2mL/只兔,四足趾注射,约每点O.5mL,5d后,取同剂 量不完全佐剂(不加卡介苗)抗原液作脊部,颈部皮 下,腹股沟等处皮下多点注射.2周后于双侧后肢肿 医学理论与实践2005年第18卷第3期JMedTheor&PracVo1.18,No.3,M8r2005 大的腋窝淋巴结内各注入hnLBSA抗原制剂,第3, 5,7周按上述方法再次在兔的背部皮内注射抗原 2mL,末次注射2周后,白兔耳静脉采血测试效价,若 效价不够高,可用不加佐剂的抗原(瑚L)通过耳 静脉以加强免疫,1周内注射3次,分别为0.1mL, 0.3mL,0.5mL,1周后再次采血测试效价.在收获免 疫血清前,应测定抗体效价,若效价在1:16以上即可 达到要求,应及时采血,否则抗体将会下降. 1.6双相琼脂扩散法[]在每块干净的玻片上铺 5mL1.5%琼脂(生理盐水配制,内含1:1000叠氮 钠),约1.5mm厚,凝固后打孔(直径3mm),孔间距 10mm,中心孔加10抗原0.5g%(BSA),周围孔内 每孔加10ptL抗血清(作系列稀释1:2,1:4,1:8, 1:16,1:32,1:64),将玻片置于湿盒内,36~C扩散 24h.结果:在抗血清效价为1:32出现一条完全融 合的沉淀线. 1.7单向琼脂扩散法[]取一块干净的玻璃片,将 已融化并在56~C水浴中保温的3%琼脂(用0.Olrnol pH7.41磷酸盐缓冲液配制)中加入BSA抗血清,二 者等量混合,此时抗血清的浓度为1:80,琼脂浓度 为1.5%.充分混匀后取6mL铺在玻璃片上(图1), 待凝固后打孔(直径3mm),孔间距为1.21.5cm, 挑出孔内琼脂.将0.5g%BSA用PBS作系列稀释 (1:2,1:4,1:8,1:16)加人孔中,每孔约10止,将玻片 置于湿盒内,36?扩散24h,测出各孔沉淀环直径. 以各种稀释度抗原的沉淀环为纵坐标,相应孔 中BSA含量为横坐标,绘制标准曲线(图2),沉淀圈 直径与抗原浓度成比例关系,从而可以定量测出抗 原含量. 2O l5 l0 5 0 图1单向琼脂扩散试验 200400800 BSA含量pg/I) 图2单向琼脂扩散法标准曲线 1.8对流免疫电泳【J将1%琼脂糖(用pH8.6, 0.05mol/LTris一巴比妥缓冲液配制)5mL铺于干净 的玻片上(厚约1.5mm),待凝固后,用打孔器成 对打孔,孔径3mm,孔间距3mm,排距8mm,在 孔中分别加入0.5g%BSA抗原和BSA抗血清(作 系列稀释1:2,1:4,1:8,1:16,1:32),在电场中 电泳30min(5v/cm),观察结果. 2结果 双向琼脂扩散法BsA抗血清效价在1:32出现 清晰的白色沉淀线.对流免疫电泳在1:16出现清 晰的沉淀线.单向琼脂扩散沉淀圈直径与抗原浓度 成比例关系,从而可以定量测出抗原含量. 3注意事项 (1)电泳时电流不宜过大,以免蛋白质变性.(2) 抗原,抗体的电极方向不能放反.(3)抗原,抗体 相对浓度要适当,抗原太浓或太稀都不易出现沉淀 线.(4)电泳所需时间与孔间距离有关,距离越 大,电泳时间越长. 4讨论 BSA抗血清作为一种免疫学试剂,应用于免疫 学沉淀反应中具有特异性强,纯度好,效价高,成 本低,操作简便等优点,达到实验的要求.在实验 时加样应加满d,:fL但不能溢出,扩散时间要适当, 时间过短,沉淀线不能出现;时间过长,会使已形 成的沉淀线解离或散开.抗血清易被细菌污染,所 以使用的各种器材,用具要彻底清洗和消毒.为了 保持抗血清效价,所收集的抗血清必须进行小量分 装及置低温(一20?)冰箱保存备用.结果证明, BSA用于免疫学沉淀反应试验可取得较高的抗血清 效价,并且自制的抗血清不需要耗费太多的材料, 可为学生节约实验经费,实验效果又好,还可以保 证学生的安全. 参考文献 l余贺,谢少文,杨桂贞,许以平,编着.临床免疫技术.上海: 上海科学技术出版社,1982.23. 2蔡玲斐,袁红,史丽云.两种淋球菌抗血清制备及效价的观察. 杭州医学高等专科学校学报,1998.2:31—32. 3朱立平,陈学清,主编.免疫学常用实验方法.北京:人民军 医出版社,2000.76—81. 收稿日期20o4—09—09 (编辑太行)