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血红蛋白凝胶过滤层析

2017-09-28 4 侵权/举报
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血红蛋白凝胶过滤层析

摘要:本实验利用凝胶过滤的特点~先向层析柱中加入FeSO 溶液~4形成一个还原带~然后加入血红蛋白样品,血红蛋白与高铁氰化钾的混合液,。由于血红蛋白分子量大~在凝胶床中流速快~当其流经还原带时~褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移~与缓冲液溶解的O结合~形成鲜红色的氧合血2

红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物~呈黄色带远远地落在后边。这样~就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。 关键词:凝胶柱~抗凝血~磷酸缓冲溶液

凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法~又称分子筛层析或排阻层析。目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类~即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。它们都是不溶于水的高聚物~内部有很微细的多孔网状结构。以Sephadex为例~它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物~网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大~则交联度越大~凝胶的网眼越小。Sephadex有很强的亲水性~在水或缓冲液中能吸水膨胀。交联度越大~网眼越小~吸水量也越少。本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离~通过层析柱可以形象的看见分离的过程。

1、实验材料及试验方法

1.1实验仪器:烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、

PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸 1.2实验试剂

,1,磷酸缓冲液,PH 7.0,:称取NaHPO?2H2O 2.172g~NaHPO?2H2O 24241.076g~溶于蒸馏水中~定容至1000mL。


,2,NaHPO,EDTA,Na溶液:称取2.69g EDTA,Na~242 23.56gNaHPO?2H2O~加蒸馏水溶解并定容至100mL。 24

,3,40m mol/L FeSO 溶液:称取FeSO?7H2O 1.11g 溶于100mL水44

中,用时现配,。

,4,Sephadex G,25~或G-75

,5,固体铁氰化钾〔KFe,CN,〕 36

,6,抗凝血,哺乳动物血样~以1:6的比例加入2.5%柠檬酸钠~置于4?冰箱中保存,。

1.3实验方法

,1,凝胶溶胀,该步骤有老师在实验前准备,

,2,装柱:将层析柱垂直固定~旋紧柱下端的螺旋夹~在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀~然后边搅拌边倒入层析柱中~同时开启螺旋夹~控制一定流速。最好连续装完凝胶~若分次装入~需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶~以免出现界面影响分离效果。装柱后形成的凝胶床至少长30cm~使胶床表面保持2-3cm液层。

注意:整个操作过程中凝胶必须处于溶液中~不得暴露于空气~否则将出现气泡和断层~应当重新装住。

,3,平衡:继续用磷酸缓冲液洗脱~调整缓冲液流速~平衡20-30分钟。

,4,样品制备:

?取1ml鸡的抗凝血放入小烧杯中~加5ml pH7.0 的磷酸缓冲液~再加入27.5mg KFe(CN) 固体~用玻棒搅动使其溶解~即得褐色的36

高铁血红蛋白溶液。

?吸取 1ml FeSO 溶液和 1ml EDTA-Na-NaHPO 溶液~于小烧杯中424

混匀。,注意:还原剂混合液要新鲜配制~尽可能缩短其与空气接触的时间,。


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