以含钌黄血盐修饰碳糊电极对侦测葡萄糖生医感测器之灵...

以含钌黄血盐修饰碳糊电极对侦测葡萄糖生医感测器之灵... 以含釕黃血鹽修飾碳糊電極對偵測葡萄糖生醫感測器之靈敏度的研究 廖國翔、林庭立、林浩 南台科技大學化學工程與材料工程系 摘要--葡萄糖生醫感測器為重要之研究主題,葡萄糖和氧氣受葡萄糖氧化酵素催化,將葡萄糖氧化成葡萄糖酸並將氧氣還原成過氧化氫,即利用電極表面於固定之還原電位下釋出電子,將電子傳媒(Mediator)變成還原態,再藉由電子傳媒之還原態釋出電子催化還原過氧化氫成水,而電子傳媒由還原態變成氧化態,利用所得之電流信號之大小,即可計算出過氧化氫的含量,進而推算葡萄糖之濃度。本研究主要利用含釕黃血鹽來修飾碳糊電極,而含釕黃血鹽本身具有強催化性能,與具有導電性能的碳粉製作成碳糊電極可藉以提升過氧化氫之應答電流,在磷酸鹽緩衝溶液中偵測過氧化氫之應答電流,計算過氧化氫之濃度,藉以推算葡萄糖之濃度。在30?下,以含釕黃血鹽修飾碳糊電極[含釕黃血鹽,碳粉=3,7(重量比)] ,操作電位為-200 mV,攪拌速率為600 rpm,以0.05 M 磷酸鹽緩衝溶液,pH,7.4,偵測過氧化氫之應答電流,可得偵測極限 22為0.02 mM HO,線性範圍為 0.02~2.7 mM HO,R為0.9996,靈敏度為661.8 µA/cm,mM 2222 HO。而酵素碳糊電極的偵測極限為 0.02 mM CHO,線性範圍為 0.02~2.56 mM CHO,22612661262 2R值為0.999,靈敏度為4.11 μA/cm?mM CHO。 6126 關鍵字,含釕黃血鹽、碳糊電極、葡萄糖生醫感測器、靈敏度 代商業化以後,即被視為增進生活品質、改善一、前言 工業製程、探討生命科學的重要科技。1962 年 感測器是一種將已知或未知的待測物理 Clark 和 Lyons兩人提出酵素電極的觀念以量或化學量,轉換為可測量的信號的運作組 後為生醫感測器( Biosensor ) 的發展開啟新的件。感測器在1960年代被提出,而在1970年 一頁,而接下來在 1967 年 Updike 和 Hicks 素電極之製作。 嘗試以葡萄糖氧化酵素( Glucose Oxidase ) 固二、實驗部份 定於薄膜中,以溶氧電極為基礎結合酵素之電2.1 儀器 極來分析溶液中的氧消耗量,進而推算樣品中電化學分析儀(CHI 614A, CH Instruments, 的葡萄糖含量,自此開啟了各式以酵素為生物Inc),對分析物活性作循環伏安法[Cyclic 辨識元件之生醫感測器的研究風潮。葡萄糖與Voltammetry(CV)]測定及以Time Base (TB)操 氧氣經酵素催化生成葡萄糖酸及過氧化氫,故作模式偵測過氧化氫及葡萄糖反應之應答電本研究欲利用氧化還原反應所產生之電流以流。圈繞白金絲作為輔助電極,自製 Ag/AgCl 偵測過氧化氫進而檢測葡萄糖含量,其偵測原電極作為參考電極,修飾碳糊電極作工作電極理即利用電極表面於固定之還原或氧化電位成三電極系統。 下釋出電子,將電子傳媒(Mediator)變成還原2.2 藥品 態;再藉由電子傳媒之還原態釋出電子催化還 黃血鹽(Potassium Hexacyanoferrate(II), 原 HO成HO,而電子傳媒將由還原態變成222MERCK ),三氯化釕(Ruthenium Trichloride, 氧化態,利用所得之電流訊號之大小,即可計ACROS),石墨碳粉(Graphite Carbon Powder, 算出過氧化氫的含量,進而推算葡萄糖之濃關東化學株式會社),葡萄糖氧化酵素(Glucose 度,本研究以含釕黃血鹽為電子傳媒來修飾碳Peroxide,Sigma),碳漿(Carbon Paste,景鴻塗糊,先檢測過氧化氫來評估可行性與電極的效料有限公司),葡萄糖,D,+,-Glucose 能,再將葡萄糖氧化酵素固定在電極上,利用Monohydrate, MERCK,,Nafion,Nafion?,電化學的方法來檢測葡萄糖分子,利用NafionFluka,,環己酮(Cyclohexanone,CHO,日610將葡萄糖氧化酵素固定在碳糊電極上,完成酵本小島化學),磷酸二氫鉀(Potassium Dihydrogenphosphate,KHPO,林純藥工業株電極。 24 式會社) ,氯化鉀(Potassium Chloride,關東化2.3.3 檢測環境條件 學株式會社)。 以上述共沉法製備之含釕黃血鹽所修飾2.3實驗步驟 之碳糊電極當作工作電極,圈繞白金線做為輔2.3.1 含釕黃血鹽粉體之製備 助電極,Ag/AgCl電極作為參考電極,將此三 配製0.003 M三氯化釕水溶液(a液)及30 電極置入反應槽於30 ? 0.2?,5 mL,pH,mM黃血鹽水溶液(b液),將二種水溶液等體7.4,0.05 M磷酸鹽(PBS)緩衝溶液中,利用電積混合之後可得到含釕黃血鹽懸浮溶液(c化學分析儀之TB 模式來偵測HO之應答電22液),將c液高速離心,其沉澱物以超純水洗流並聯接電腦與列印機分別作數據之處理,儲滌,如此重覆離心洗滌三次,最後將獲得之沉存及繪圖。 澱物置入烘箱以60?烘乾,烘乾後之粉體即為 三、結果與討論 含釕黃血鹽。 3.1 以含釕黃血鹽修飾之碳糊電極與未經修飾2.3.2 工作電極之製備 之碳糊電極之比較 取一長7cm之單芯銅電線,電線內徑為 圖1 是於5 mL 之 0.05 M PBS 中,pH = 0.05cm,切除前後二端各0.5cm之絕緣外層, 7.4, (A) 經含釕黃血鹽及碳粉為3,7修飾之且分別以稀硝酸水及丙酮清洗電線裸露的二 碳糊電極的CV圖,掃描電位範圍為-0.8 , 端並風乾備用。然後將含釕黃血鹽粉體及碳粉 +0.8 V (B) 為未經修飾之碳糊電極的CV圖,與碳漿以適當比例混合,並以環己酮調節黏稠 掃描電位範圍為-0.6 , +0.6 V,掃描速率為度均勻混合後即成碳糊,然後將碳糊均勻塗佈 50 mV/s,掃描20個區段,比較後可知含釕黃在前述之電線一端,在室溫下乾燥後即為碳糊 血鹽確有提升催化還原電流之功效。而偵測電 位選擇在還原電位-200 mV,係考量日後使用測試 於生醫感測器時藉此也可避免溶液中氧氣及以上述之最適條件(含釕黃血鹽與碳粉比其他具有電化學活性之生理物質的干擾。 例 3:7 )來製作電極,電極表面的碳糊乾燥之3.2過氧化氫之偵測極限及線性範圍 後,將配製完成的葡萄糖氧化酵素溶液 3 μL 以含釕黃血鹽與碳粉最適比例(3,7)下之(以 3 mg 葡萄糖氧化酵素溶於 200μL 磷酸碳糊電極置入 5 mL ,pH,7.4 之PBS 溶液鹽緩衝溶液中)均勻塗佈於乾燥的電極表面(含0.1 M KCl)中,通氮除氧20 分鐘在液面充上,待葡萄糖氧化酵素溶液乾燥後再將 1% 滿氮氣,以TB 模式偵測 HO,操作電位為 Nafion 酒精溶液 5μL 均勻塗佈於含有葡萄22 -200mV,每100 秒注入不同量之 100 mM 糖氧化酵素的電極表面,乾燥之後即為酵素碳HO,藉此TB圖測試碳糊電極對偵測過氧化糊電極,以上皆在室溫下進行。在 5 mL,pH 22 氫之偵測極限(如圖2所示)。圖3為偵測過氧= 7.4,0.05 M 之 PBS 中,控制溫度為 30 ? 化氫之線性範圍之TB圖,每次注入15 μL之0.2 ?,以TB模式,在操作電位為 -200 mV,100 mM HO(如圖3所示) 。由圖 2 可以得攪拌速率 600 rpm 下,每100 秒注入不同量22 知當攪拌速率為600 rpm,過氧化氫感測器的HO(如圖4所示)。酵素碳糊電之 100 mM C6126 偵測極限為 0.02 mM HO,由圖 3 可以得知極之偵測極限測試結果表示於圖 4 ,碳糊電22 當攪拌速率為600 rpm,過氧化氫感測器之線極的線性範圍測試示於圖 5。由圖 4 可以得 2性範圍為 0.02 ~ 2.7 mM HO,其 R 值為 知酵素碳糊電極的偵測極限為 0.02 mM 22 20.9996,靈敏度為661.8 μA/cm-mM HO。 CHO,由圖 5 可以得知酵素碳糊電極之線226126 23.3以 Nafion 固定葡萄糖氧化酵素於碳糊電性範圍為 0.02 ~ 2.56 mM CHO ,其 R 值6126 2極上偵測葡萄糖之偵測極限與線性範圍為 0.999,靈敏度為4.11 μA/cm?mM CHO。 6126 of Glucose Oxidase/Polypyrrole Biosensor by 四、 結論 Galvanostatic Method in Various pH Aqueous Solutions,” Biosensors and 由實驗結果顯示在碳糊電極的製作中加Bioelectronics, 19, 141(2003). 入含釕黃血鹽修飾後,應答電流有明顯的增 加。而含釕黃血鹽與碳粉摻混的最適比例為 3,7,且對過氧化氫偵測極限為 0.02 mM 2HO,線性範圍為 0.02 ~ 2.7 mM HO,R 值2222 2為 0.9996,靈敏度為661.8 μA/cm?mM HO。酵素碳糊電極的偵測極限為0.02 mM 22 圖1、(A)經含釕黃血鹽修飾之碳糊電極(B) CHO,線性範圍為0.02~2.56 mM CHO,61266126 未經修飾之碳糊電極的 CV 圖 22R值為0.999,靈敏度為4.11 μA/cm?mM Fig 1. CV graphs for (A) carbon paste electrode modified with ruthenium hexacyanoferrate (B) CHO。 6126unmodified carbon paste electrode 五、參考文獻 [1] Clark, L. C., and C. Lyons, “Electrode System for Continuous Monitoring in Cardiovascular Surgery, ” Ann NY Acad Sc, 102, 29 (1962). [2] Updike, S. J., and G. P. Hicks, “The Enzyme Electrode,” Nature, 214, 986(1967). [3] Cataldi, Tommaso R.I., Giuseppe E. De. Benedetto, “On the Ability of Ruthenium to Stabilize Polynuclear Hexacyanometallate Film Electrodes,” Journal of Electroanalytical Chemistry, 458, 149 (1998). [4] Uang, Y.-M., and T.-C. Chou T, “Fabrication 圖2、(A)含釕黃血鹽與碳粉掺混比例為3:7之 為500 rpm (C)未經修飾的碳糊電極,攪拌速率 碳糊電極,攪拌速率為600 rpm (B)含釕黃血鹽 為600 rpm之偵測過氧化氫濃度之線性範圍的 與碳粉掺混比例為3:7之碳糊電極,攪拌速率 的 TB 圖 為500 rpm (C)未經修飾的碳糊電極,攪拌速率 Fig 3. The linear range of TB graphs for O for (A) carbon paste electrode detection of H22為600 rpm之偵測過氧化氫濃度之偵測極限的 with ruthenium hexacyanoferrate : carbon powders = 3 : 7, stirring rate 600rpm (B) carbon TB 圖 paste electrode with ruthenium hexacyanoferrate : Fig 2. The detection limit of TB graphs for carbon powders = 3 : 7, stirring rate 500rpm (C) detection of HO for (A) carbon paste electrode 22unmodified carbon paste electrode, stirring rate with ruthenium hexacyanoferrate : carbon 600rpm powders = 3 : 7, stirring rate 600rpm (B) carbon paste electrode with ruthenium hexacyanoferrate : 圖4、以酵素碳糊電極分別注入1、2、4、8、carbon powders = 3 : 7, stirring rate 500rpm (C) unmodified carbon paste electrode, stirring rate 16μL 之 100 mM 葡萄糖溶液所得之TB圖 600rpm Fig 4. The TB graphs for glucose electrode ; 1μL、2μL、4μL、8μL and 16 μL of 100 mM glucose solution were injected respectively 圖3、(A)含釕黃血鹽與碳粉掺混比例為3:7之 碳糊電極,攪拌速率為600 rpm (B)含釕黃血鹽 與碳粉掺混比例為3:7之碳糊電極,攪拌速率 圖5、以酵素碳糊電極每次注入 16 μL 之 100 mM 葡萄糖溶液所得之TB圖 Fig 5. The TB graphs for glucose electrode ; 16 μL of 100 mM glucose solution was injected each time