几种乳杆菌协同作用对产生大果沙棘籽油共轭亚油酸的影响

几种乳杆菌协同作用对产生大果沙棘籽油共轭亚油酸的影响 几种乳杆菌协同作用对产生大果沙棘籽油 共轭亚油酸的影响 第37卷第4期 2009年4月 东北林业大学 JOURNALOFNORTtJEASTFORESTRYUNIVERSITY VolI37No.4 Apr.2009 几种乳杆菌协同作用对产生大果沙棘籽油共轭亚油酸的影响’ 王振宇孙琪 (东北林业大学,哈尔滨,150040) 摘要以乳化的沙棘(HippophaerhamnoidesL.)籽油作为底物加入到试验所制备的复合乳杆菌中,利用乳 杆菌所产生的亚油酸异构酶使亚油酸(LA)转化为共轭亚油酸(CLA).通过几种乳杆茵不同配比组合的协同试 验,发现不同种乳杆菌的协同转化共轭亚油酸的能力要高于单一茵种.结果明,复合乳杆菌中植物乳杆菌:德式 乳杆菌保加利亚亚种为7:3转化效果最好,其亚油酸异构酶酶活为21.36U/mL,共轭转化率为33.38%,共轭亚油 酸质量浓度为28.83g/L. 关键词复合乳杆菌;协同作用;大果沙棘籽油;亚油酸异构酶;共轭亚 油酸转化率;酶活测定 分类号Ts2:s793.6 EffectofSynergisticActionsofSeveralKindsofLactobacilHonProducingConjugatedLinoleicAcidfromSea? BuckthornSeedOilofLargeBerryCultivars/WangZhenyu,SunQi(SchoolofForestry,NortheastForestryUniversi— tv.Harbin15O04O,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity.一 2o09,37(4).一37—39 Emulsiftedseedoilfromlarge.berrycultivarsofsea.buckthom(HippophaerhamnoidesL.)wasaddedintothecom. poundofLactobacillisassubstrate,and1inoleateisomeraseproducedbyBacterilt?ll,lacticumwasusedtoconvertlinoleic acid(LA)intoconjugatedlinoleicacid(CLA).Undertheconditionsofdifferentratiosandcombinations.itwasfoundthat thecompoundLactobacillishadmuchstrongerconversionabilitythanthatofsingleone.Thebestconversioneffectwasob. tainedundertheconditionthattheratioofLactobacillusplantarumtoLactobacillusbu~aricwas7:3.amongwhich.the activityoflinoleateisomerasewas21.36U/mL,theCOnjugatedconversionratiowas33.38%.andtheconcentrationof conjugatedlin0】eicacidwas28.83g/L. KeywordsCompositeLactobaciUi;Synergisticactions;Seed0ilfromlarge. berrycuhivarsofsea—buckthom:Linole. ateisomerase;Conjugatedconversionratios;Enzymeactivityassay 沙棘(Hippophae?m凡oL.)在我国分布范围很广. 沙棘油是通过对沙棘果(FructusHippophae)的深加工,从沙棘 的果肉或种子中提取出的植物油,分别为沙棘果油和沙棘籽 油.沙棘油是沙棘的精华部分,20t沙棘果实提取1t沙棘种 子,可萃取5Okg沙棘籽油,而1t沙棘果肉中仅能提取出2kg 沙棘果油….沙棘果实油脂的多重功能源于存在多种抗氧 化物,脂肪酸和甾醇的结果J.沙棘籽油的成分以脂肪酸为 主,其中不饱和脂肪酸的量占85%,不饱合脂肪酸在受伤组 织的再生中起重要作用. CLA的制备方法一般有2种:一种是化学异构法——亚 油酸的碱法异构化.利用碱性催化剂使富含亚油酸的油脂异 构化,在工业上被广泛采用.另一种是生物异构法——亚 油酸异构酶制备法.CLA的生物合成法生产主要由微生物产 生的亚油酸异构酶转化而来J,一些微生物细胞产生的共轭 亚油酸异构酶可特异性地催化亚油酸(LA)转化为活性共轭 亚油酸(CLA)异构体,近年来倍受关注,因此CLA的生物合 成已成为该领域未来的发展方向J. 乳杆菌可将游离的LA转化为CLA_6.本实验利用菌种 协同作用将几种乳杆菌进行组合培养,运用一定的方法将其 处理,使其释放出亚油酸异构酶,利用紫外分光光度法对所培 养菌体的酶活进行测定,利用乳杆菌发酵催化亚油酸转化为 共轭亚油酸,使其共轭亚油酸转化率增高.乳杆菌生物转化 LA为CLA奠定理论基础. 1)黑龙江省重大科技攻关项目(GB06B404—1). 第一作者简介:王振字,男,1957年8月生,东北林业大学林学院 和哈尔滨:E业大学食品科学与工程学院,教授. 收稿日期:2008年l2月3日. 责任编辑:张玉. 1材料和方法 1.1试验材料与设备 菌种及主要试剂:植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum), 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusbulgaricus),嗜酸乳杆 菌(Lactobacillusacidophilus)购于黑龙江省微生物研究所.共 轭亚油酸标品(99%)购于sigma公司;沙棘籽油(不饱和脂肪 酸量/>85%)由高原圣果沙棘制品有限公司提供. 实验设备:PH600A型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪 器有限公司);T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有 限责任公司);JY92—2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物 科技股份有限公司);GL一20G—II型高速冷冻离心机(上海 安亭科学仪器厂);高压蒸汽灭菌锅(长春百奥生物仪器有限 公司);HZQ—Xl00震荡培养箱(哈尔滨市东明医疗仪器厂); FJ一200高速分散均质机(上海标本模型厂). 1.2培养基 MRS培养基:蛋白胨10g,葡萄糖20g,乙酸钠5g, K!HPO42g,MnSO?4H2O0.05g,牛肉膏l0g,酵母粉5g,柠 檬酸二胺2g,MgSO4?7H200.2g,Tween801mL,以上药品均 溶于lL蒸馏水中,pH=6.5.121?灭菌15min. 脱脂乳培养基:纯牛奶煮沸5min,冷却至室温,冰箱4? 过夜,除去上层油脂,115?灭菌15rain 1.3复合乳杆菌的培养方法 种子的培养:将保藏于冰箱中的植物乳杆菌,德氏乳杆菌 保加利亚亚种,嗜酸乳杆菌在脱脂乳培养基中活化3次后,将 其各挑出一环转接到100mLMRS液体培养基中,37?培养 24h后,按表1不同乳杆菌配比组合表(组合配比量共1mL) 转接到50mLMRS液体培养基中进行复合菌种的培养,37oC 培养24h. 38东北林业大学第37卷 表1不同乳杆菌配比组合表 组合植物乳杆菌(a)嗜酸乳杆菌(b)德氏乳杆菌保加利亚亚种(c)配比 一 0.3 — 0.5 一 O.7 l:5: 2:l: 2:3: 2:6: 3:3: 3:5: 4:1: 4:3: 4:4: 6:3: 沙棘籽油乳浊液的制备:取沙棘籽油0.5mL,Teewn801 mE,H098.5mL,在冰浴下进行超声波乳化分散(超声波功 率800w,超声波工作时间5s,间歇时间5s,超声工作次数30 次),配制成沙棘油乳浊液,冰箱保存备用. 共轭亚油酸(CLA)的转化培养:在50mL的MRS培养基 中加入5mL沙棘籽油乳浊液,121aC灭菌20rain后接入2% 的种子液(每mL含菌体5×10个左右),37?诱导培养24 h.将培养好的菌体于4?,7000r/rain下冷冻离心20rain 后,弃上清液,收集菌体后用pH为5.6的磷酸氢二钠一柠檬 酸缓冲液洗涤2次,7000r/rain,4?离心20rain,收集菌体. 称取一定量的菌体溶于磷酸二氢钠一柠檬酸缓冲液中(质量 :体积=1:4),均质10min后,冰浴中用超声波破碎仪进行间 歇破碎处理(超声波功率400W,工作3s,间歇8s,80次),再 于4?,12000r/rain冷冻离心20rain,收集上清液,即为共轭 亚油酸粗酶液. 共轭亚油酸的检测:共轭亚油酸在233—234nm之间有 特殊吸收峰,而亚油酸却没有.利用紫外分光光度计,在波长 200—400nm范围内对所购买的共轭亚油酸品进行扫 描,结果在233nm处有最大吸收峰.以环己烷为溶剂,将 CLA标样配制成不同浓度的溶液,以环己烷作参比,在233 nm处测定其吸光值,绘制标准曲线.以不接种的培养基为参 比,用紫外分光光度计测定在特征吸收峰233hill处的吸收 值.根据标准曲线计算发酵液中CLA的含量.已知沙棘籽 油中含LA37.5%,通过公式:CLA转化率=(生成CLA的量/ 沙棘籽中含有LA的量)×100%来计算CLA转化率.参比: 培养基中加人与样品同量的沙棘籽油,不接菌种,其它步骤同 样品. 亚油酸异构酶酶活的测定:在50mL三角瓶中加入0.5 mL粗酶液,0.5mL亚油酸和1mLTween80,37?下缓慢振摇 3h后,加入20mL环己烷;200r/rain振摇3h后,l5?,10000 r/rain离心20rain;取环己烷层,用微量进样器取l0于装 有10mL环己烷的刻度试管中;用分光光度计测定233nm处 的吸光值,再对照标准曲线求得共轭亚油酸的含量.一个亚 油酸异构酶活力(单位u)定义为:在上述酶活力测定方法 下,ls内生成1IxgCLA所需的酶量. 酶活力(U?mL)=(g)/(V×t).g为所生成的共 轭亚油酸量(txg);为酶液稀释倍数;V为酶液体积(mL);t 为保温时间(s). 2结果与分析 2.1共轭亚油酸(CLA)紫外吸收标准曲线 CIA紫外吸收标准曲线的线性回归方程为:Y=0.0221+ 0.1167X.X为CLA质量浓度,y为233nm处紫外吸光值. =0.9974;线性范围:0,10g/L. 2.2乳杆菌菌种组合培养测定结果及分析 2种乳杆菌协同作用对亚油酸异构酶的影响:不同乳杆 菌配比组合表(表1)中的2种乳杆菌配比组合培养后,经过 均质和超声波处理制备成粗酶液,以不接种的培养基作参比, 测定亚油酸异构酶的酶活(见表2). 表2复合乳杆菌产生亚油酸异构酶酶活测定 复合乳亚油酸异构酶酶活/u?mII1复合乳亚油酸异构酶酶活/u?mI 杆菌测定值标准差杆菌测定值标准差 b3c720.17l40.0987albsc418.07670.2962 bsc519.75250a2ble719. 33350.9380 bTC318.42590.3456a2b,c18.21640.0494 a3e720.10l60.8393a2b6c216.95960 a3b717.09920.2962a3b3c418.56550.9381 a5e520.24120.1975a3bsc2l5.98210.7899 asb517.86730.3950a4b】0518.07671.2343 7321.35830.0494a4b1c119.124l0.9381 aTb319.19390.3456a4b40221. 07910.4937 a6b3e117.72760.5925 从表2可以看出,2种菌种组合培养所生成的亚油酸异 构酶酶活最高的菌种为a712,亚油酸异构酶酶活为21.36U/ mL,复合乳杆菌组合配比为a7c.复合乳杆菌亚油酸异构酶 酶活最低的菌种为a,,亚油酸异构酶酶活为17.10U/mL. 复合乳杆菌a7c的亚油酸异构酶酶活比ab的酶活高4.26 U/mL.由此可知,植物乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种按 7:3(a7c)比例组合时所制成的复合乳杆菌产生的亚油酸异 构酶的活性最高. 2种乳杆菌协同作用对转化生成共轭亚油酸含量的影 响:复合乳杆菌按一定的配比组合培养后,将沙棘籽油乳浊液 作为底物,分别加入2种菌种组合培养的复合乳杆菌中,使亚 油酸(LA)转化为共轭亚油酸(CLA),测定结果见表3. 表3复合乳杆菌转化亚油酸生成共轭亚油酸含量的测定 复合乳共轭亚油酸转化率/%复合乳共轭亚油酸转化率/% 杆菌测定值标准差杆菌测定值标准差 b3731.52310.1541aIb5428.18080.4624 b5.530.83290a2b,c130.21531.4643 bTC328.83470.5395a2b128.39880.0771 a3e731.34151.3101a2b?.47330 a3b726.65500.4624azb3c~28.980l1.4643 a5e531.63210.3083a3bC224.98381.2331 ash527.85390.6165tt4blC528.18081.9267 a7c333.37590.0771a4b29.88831.4643 aTb330.03360.5395a4bde232.94000.7707 a6b3c27.70850.9248 从表3可以看出,共轭亚油酸转化率最高的复合乳杆菌 为ac,共轭转化率为33.38%,共轭亚油酸质量浓度为 28.83L.其次为a5c5,共轭转化率为31.63%,共轭亚油酸 质量浓度为27.36L.复合乳杆菌a5c比a7c,共轭转化率 753753753 1J51,1J57,1JCJ7 753753一一一4752425321 OOOOOO_一.00OO0OOO0O 7535l3635l343 000OOOOOO0OOO 3573571222334446 OO000OOOOOOO0O0O bbbaaaaaa 第4期王振宇等:几种乳杆菌协同作用对产生大果沙棘籽油共轭亚油酸的影响39 低1.75%.共轭转化率最低的复合乳杆菌为a,b,转化率为 26.66%,共轭亚油酸质量浓度为23.O8L.复合乳杆菌 a7c的共轭转化率比a3b高6.72%.因此可以看出,复合乳 杆菌a7c为2种菌种组合配比时沙棘籽油中亚油酸转化成 共轭亚油酸的最佳复合乳杆菌. 3种乳杆菌协同作用对亚油酸异构酶的影响:不同乳杆 菌配比组合表(表1)中的3种乳杆菌配比组合培养后,与2 种乳杆菌组合培养菌种处理方法相同,测定结果见表2.从 表2可以看出,3种菌种按一定的配比组合培养后,得到的复 合乳杆菌都能够产生亚油酸异构酶,其中a4bC的酶活最高 (21.08U/mL),复合乳杆菌a,b5C所产生的酶活最低(15.98 U/mL).复合乳杆菌a4bC比a3bC所产生的亚油酸异构 酶酶活高5.1U/mL.由此可知,菌种组合实质上是菌群间的 一 种互生和共生关系,但是由于菌种之间也存在着抑制作用, 所以选择适当的组合配比使其显现出更高的活性非常重要. 3种乳杆菌协同作用对转化生成共轭亚油酸含量的影 响:将沙棘籽油乳浊液作为底物,加入到3种乳杆菌组合配比 培养所制成的复合乳杆菌中,培养后进行共轭亚油酸含量的 测定(见表3).由表3可见,复合乳杆菌a4bC的共轭转化 率最高,共轭亚油酸转化率为32.94%,共轭亚油酸质量浓度 为28.46L.共轭转化率最低的复合乳杆菌为a3bC:,共轭 转化率为24.98%,共轭亚油酸质量浓度为21.58L.复合 乳杆菌a4bC:比33bC:的共轭转化率高7.96%.所以,复合 乳杆菌84bC为3种乳杆菌组合培养后,转化沙棘籽油中亚 油酸为共轭亚油酸的最佳复合乳杆菌. 2.32种最佳复合乳杆菌aTc,与a4bC的测定结果比较 将2种菌种组合配比培养所得到的最佳复合菌种a7C 与3种菌种组合培养所得到的最佳复合菌种a4be的亚油酸 异构酶酶活和共轭转化率进行比较(表4),结果发现,2种组 合培养的复合乳杆菌a7c的共轭转化率和亚油酸异构酶酶 活明显高于3种菌种组合培养的复合乳杆菌a4bC,亚油酸 异构酶酶活高0.28U/mL,共轭亚油酸转化率高0.44%.这 表明,3种菌种利用协同作用按一定配比组合后,复合乳杆菌 a7c,为高酶活且高共轭转化率的最佳复合乳杆菌. 表42种最佳复合乳杆菌的比较 3讨论 从试验中可以看出,植物乳杆菌,德氏乳杆菌保加利亚亚 种和嗜酸乳杆菌3种菌种,按适当的比例共同培养制成复合 菌时,能充分发挥群体的联合作用优势.通过自身代谢以及 代谢产物之间的相互作用,调整菌群之间的关系,维持和保证 在微环境中微生物群在这种组合中具有相对稳定性,提高这 种组合在微环境中的一些特性,有利于我们对这种菌群更深 一 层的探索与研究.本文利用菌种的协同作用来提高大果沙 棘籽油中亚油酸转化成共轭亚油酸的含量,从而提高共轭亚 油酸的转化率.由于亚油酸异构酶的酶活和共轭亚油酸的含 量成正比,所以提高亚油酸异构酶的活性并挑选出酶活高的 菌种是IA转化为CLA的关键因素.实验证明,筛选出亚油 酸异构酶酶活高的复合菌株对功能食品的开发和研究具有广 泛的应用前景.由于国内对微生物发酵法合成CLA的研究 较少(尤其是提高亚油酸异构酶的活性方面),本试验着重于 微生物发酵产生亚油酸异构酶,通过菌种的协同作用提高亚 油酸异构酶的活性,并使共轭转化率增加.实验原料选择沙 棘油,虽然沙棘油中的亚油酸含量比较高,但由于沙棘的产地 分布不均匀,并且成本较高,因此在今后的开发实验中可以寻 找一些含亚油酸较为丰富的其它油原料,降低CLA生产的原 料成本.利用微生物发酵法生产CLA,将进一步受到人们的 青睐与重视. 参考文献 [1]薄海波,秦榕.沙棘果油与沙棘籽油脂肪酸成分对比研究[J]. 食品科学,2008,29(5):378—381. 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