起始密码子论文海水细菌分泌性蛋白的筛选分析及其在载体疫苗中的应用

起始密码子论文海水细菌分泌性蛋白的筛选分析及其在载体疫苗中的应用 起始密码子论文:海水细菌分泌性蛋白的筛选、分析及其在载体疫苗中的应用 【中文摘要】据统计,目前已发现的水产养殖疾病不少于5 000种,其中,细菌性疾病成为水产养殖中最常见、最严重的病害之一,常给水产养殖业造成巨大的经济损失,因而针对病原菌的免疫防治研究具有切实意义。在传统的解决中,以抗生素和优质饲养的解决方案在一定程度上发挥了积极作用,但长期频繁使用抗生素及其它一些化学药物会引起环境中包括致病性和非致病性微生物产生耐药性、水产动物体内药物残留及对水环境的污染等弊端。因而,以微生物疫苗为主的免疫防治有不可替代的优势。目前,在微生物疫苗的研制中,活细菌疫苗载体的研制成为热点,主要集中在食品、药品的研发当中,在水产动物的免疫防治方面还鲜有报道。本文从改造重组表达载体提高蛋白表达量着手,构建了能够高效表达外源蛋白的可视化高效表达载体,然后又分析筛选出了水产动物源性细菌的分泌性蛋白及其分泌性信号肽序列,进而可以将获得的蛋白序列分析后用以分泌型高效表达载体的构建,并将构建的载体用于基因的大量表达、有益菌载体表达的口服疫苗研制以及有价值蛋白的动物肠道表达。本研究主要包括2部分内容。第一部分:一种改造重组表达载体提高蛋白表达量方法的初步研究。这部分研究中,我们首次利用PCR方法在商品化的表达载体pGFPuv起始密码子后插入人工合成的编码多密码子氨基酸的寡核苷酸序列将原始的绿色荧光蛋白表达载体pGFPuv进行了修改,通 过诱导表达和SDS-PAGE分析了原表达载体和修改的表达载体对GFP的表达差异。结果表明,IPTG诱导后原载体pGFPuv和修改的phGFPuv载体在大肠杆菌DH5α中均能正常表达出绿色荧光蛋白,但原pGFPuv载体对GFP的表达量不足细菌总蛋白的9%,而修改的phGFPuv载体对GFP的表达量占到了细菌总蛋白的20%以上。证明了在表达载体或基因起始密码子后插入编码多密码子氨基酸的寡核苷酸序列可以使蛋白的表达量提高2-5倍。第二部分:水产动物源性细菌主要分泌性蛋白的鉴定及其分泌性序列的分析。从本保种的常见的水产动物病原菌鳗弧菌(V. anguillarum) MN、鳗弧菌(V. anguillarum)3101、费氏弧菌(V. fischeri)及对虾肠道中分离的非病原菌坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)培养液中分别获取了分泌性蛋白,进行SDS-PAGE,对表达量较高的8条蛋白区带进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定表明,它们分别是鳗弧菌MN金属蛋白酶(empA-MN)、鳗弧菌3101金属蛋白酶(empA-3101)、锌金属蛋白酶( zinc empA )、费氏弧菌VFMJ111094蛋白(VFMJ111094)、费氏弧菌ES114的外膜蛋白(OMP)、坚强芽孢杆菌几丁质酶(chitinase)、坚强芽孢杆菌肠毒素A(enterotoxin A)和坚强芽孢杆菌BCG9842蛋白(hypothetical protein BCG9842)。根据所鉴定的序列设计引物,分别从鳗弧菌MN、鳗弧菌3101费氏弧菌和坚强芽孢杆菌中扩增出相应基因,克隆后,测定了empA、empA2、zinc empA、VFMJ11-1094、OMP、chitinase、enterotoxin A和BCG9842相应基因的序列,经在线软件SignaIP 3.0分析,确定empA、empA2、zinc empA、VFMJ11-1094、OMP、chitinase、 enterotoxin A和BCG9842均存在不同的分泌性信号肽序列 angMN-35、ang3101-35、ang3101-25、vf-38、vf-23、bf-43、bf-37 和bf-16,通过在线软件PSORT分析表明,所有信号肽均定位在细胞的 周质空间、细胞外膜或细胞外。本研究为分泌性载体的构建提供理论 依据。 【英文摘要】According to the statistics, more than 5000 species of diseases have been found in aquaculture at present, of which the bacteriosis was one of the most common and serious diseases and often caused aquaculture huge economic losses. Thus, the immune control for the pathogens has practical significance. In the traditional solutions, the solution of feeding antibiotics and high-quality feedstuff played a positive role to a certain extent, but after a long-time frequently using of antibiotics and other chemicals, the environment has been caused some defects such as drug tolerance of the pathogenic, non-pathogenic microorganisms and drug residues in the aquatic animal’s immune. At present, in the microbial vaccines research and development, live bacteria vaccine vector developement has become a focus mainly in food and medicine, but seldom-reported in the immune prevention of aquatic animals.Our research started with enhancing the protein expression from transforming recombinant protein expression vector, and constructed the visual expression vectors which can efficiently express the foreign protein. Then we screened out of the secreted proteins of aquatic bacterias and analyzed their signal sequences.This study includes two parts.Part?: Study on the method of modifying recombinant vector for improving protein expression. In this part of the study, the commercial recombinant green fluorescent protein expression vector pGFPuv was modified to phGFPuv with inserting of a oligo nucleotide sequence coding more amino acid codon following the iniation codon by PCR method firstly. The difference of GFP expression level between the two vectors expressing in E. coli DH5αafter IPTG inducing was analyzed by SDS-PAGE. Both of the vectors can successfully express green fluorescent protein by IPTG inducing. However, the GFP proportion expressed by the modified vector reached more than 20% of the bacterial total protein, while the proportion expressed by the original vector was less than 9%. It shows that the oligo nucleotide sequence insert coding several amino acids with synonymous codons following the iniation codon can increase the expression level of exogenous proteins for 2-5 times.Part?: Mass spectrometry identification of secreted proteins from aquatic bacterial isolates of animal origin and analysis of their secretive sequences. In this study, the secreted proteins of Vibrio anguillarum MN, V. anguillarum 3101, V. harveyi and Bacillus firmus which were isolated and conserved by our laboratory, were extracted. The components of secreted proteins were separated by SDS-PAGE. The 8 high expressed protein bands in the SDS-PAGE were identified by mass spectrometry MALDI-TOF/TOF as the metalloprotease of Vibrio anguillarum MN, the metalloprotease of Vibrio anguillarum 3101, the zinc metalloproteinase of Vibrio anguillarum 3101, the hypothetical protein VFMJ111094 and outer membrane protein of V. fischeri ES114, the putative chitinase, enterotoxin A and protein BCG9842 of Bacillus firmus. After downloaded the sequences of above proteins from NCBI database, PCR primers were designed and specific DNA bands were amplified , cloned and sequence analisised. 8 signal peptides were given by using of the online software SignaIP 3.0, namely angMN-35, ang3101-35, ang3101-25, vf-38, vf-23, bf-43, bf-37 and bf-16. The cellular localization of the secreted sequences were analyzed by PSORT. And we found that all the signal peptides located in the outer membrane, outside or periplasmic space of the cell. The results may be useful for construction of a secreted vector. 【关键词】起始密码子 分泌性蛋白 载体构建 疫苗载体 细胞定 位 【英文关键词】iniation codon secreted proteins vector construction carrier vaccine cellular localization 【目录】海水细菌分泌性蛋白的筛选、分析及其在载体疫苗中的应用 摘要 4-7 ABSTRACT 7-9 引言 13-14 第一章 绪论 14-20 1.1 海水养殖及其病害控制 14-17 1.1.1 水产养殖动物细菌性病原体鳗弧菌 14-15 1.1.2 水产养殖动物细菌性病原菌迟缓爱德华氏菌 15-16 1.1.3 水产养殖动物细菌性病原菌气单胞菌 16-17 1.2 渔用疫苗研究近况 17-20 1.2.1 灭活疫苗 17 1.2.2 减毒活疫苗 17-18 1.2.3 亚单位疫苗 18 1.2.4 生物技术疫苗-活细菌载体疫苗 18-20 第二章 一种改造重组表达载体提高目的蛋白表达量方法的初步研究 20-33 2.1 引言 20 2.2 材料与方法 20-27 2.2.1 细菌与质粒 20-21 2.2.2 实验用仪器 21 2.2.3 高效表达序列的选择 21 2.2.4 引物设计与合成 21 2.2.5 pGFPuv 质粒的扩大培养及提取 21-22 2.2.6 质粒DNA 片段与高效表达序列的扩增及纯化 22-23 2.2.7 高效表达载体phGFPuv 的构建 23-25 2.2.8 重组质粒的提取 25-26 2.2.9 绿色荧光蛋白表达的显微荧光观察及荧光检测 26-27 2.3 结果与分析 27-31 2.3.1 重组质粒phGFPuv 的构建 27-29 2.3.2 绿色荧光蛋白表达的显微荧光观察 29 2.3.3 表达蛋白的SDS-PAGE 及荧光检测 29-30 2.3.4 重组蛋白的表达量分析 30-31 2.4 讨论 31-33 第三章 4 条高效表达序列的效果验证 33-37 3.1 引言 33 3.2 材料与方法 33-34 2.2.1 细菌与质粒 33 3.2.2 实验用仪器 33 3.2.3 验证序列的信息 33-34 3.2.4 引物设计与合成 34 3.2.5 实验方法 34 3.3 结果与分析 34-36 3.3.1 表达蛋白的SDS-PAGE 及荧光检测 34-35 3.3.2 重组蛋白的表达量分析 35-36 3.4 讨论 36-37 第四章 3 株水产动物病原菌主要分泌性蛋白的鉴定及其分泌性序列的分析 37-55 4.1 引言 37-38 4.2 材料和方法 38-41 4.2.1 菌株 38 4.2.2 主要仪器和化学试剂 38 4.2.3 细菌培养及分泌性蛋白的制备 38 4.2.4 15%的SDS-PAGE 电泳鉴定 38-40 4.2.5 表达量的检测 40 4.2.6 主要分泌性蛋白区带的质谱分析 40 4.2.7 基因克隆及序列测定 40-41 4.3 结果与分析 41-53 4.3.1 获取的3 种海水细菌胞外蛋白的 SDS-PAGE 41-43 4.3.2 主要分泌性蛋白的质谱分析 43-50 4.3.3 PCR 扩增的结果 50-51 4.3.4 重组载体的筛选与测序 51-52 4.3.5 鉴定的蛋白序列的分泌序列分析筛选 52 4.3.6 分泌序列在细胞中的定位分析 52-53 4.4 讨论 53-55 第五章 坚强芽孢杆菌的性质研究及GFP 标记 55-64 5.1 引言 55 5.2 材料和方法 55-58 5.2.1 材料 55 5.2.2 坚强芽孢杆菌的生长曲线测量 55 5.2.3 坚强芽孢杆菌的革兰氏染色 55-56 5.2.4 坚强芽孢杆菌的药物敏感实验 56 5.2.5 坚强芽孢杆菌的pGFPuv 质粒标记 56-57 5.2.6 含有GFP 的穿梭载体pBE2 的构建及坚强芽孢杆菌的标记 57-58 5.3 结果与分析 58-62 5.3.1 坚强芽孢杆菌的生长曲线 58-59 5.3.2 坚强芽孢杆菌的革兰氏染色 59-60 5.3.3 坚强芽孢杆菌的药物敏感试验结果 60-61 5.3.4 坚强芽孢杆菌pGFPuv 质粒标记荧光观察 61 5.3.5 重组穿梭载体pBE2-GFP 的构建 61-62 5.4 讨论 62-64 第六章 坚强芽孢杆菌主要分泌蛋白的鉴定及其分泌性序列的分析 64-75 6.1 引言 64 6.2 材料和方法 64-66 6.2.1 细菌培养及分泌性蛋白的制备 64-65 6.2.2 分泌性蛋白SDS-PAGE 65 6.2.3 主要分泌性蛋白区带的质谱分析 65 6.2.4 基因克隆及序列测定 65-66 6.2.5 分泌性信号肽序列的生物信息学分析 66 6.3 结果与分析 66-73 6.3.1 坚强芽孢杆菌胞外蛋白的SDS-PAGE 66-67 6.3.2 主要分泌性蛋白的质谱分析 67-71 6.3.3 PCR 扩增的结果 71-72 6.3.4 重组载体的筛选与测序 72 6.3.5 测序的蛋白序列的分泌序列分析筛选 72-73 6.3.6 分泌序列在细胞中的定位分析 73 6.4 讨 论 73-75 结论 75-76 参考文献 76-84 附录 84-87 致谢 87-88 攻读学位期间的科研成果 88