水浸束缚应激对大鼠下颌下腺内瘦素表达的影响 .doc

水浸束缚应激对大鼠下颌下腺内瘦素表达的影响 .doc 水浸束缚应激对大鼠下颌下腺内瘦素表达 的影响 作者:赵豫凤，刘广忠，杨加周，苗乃周 【关键词】 应激;水浸 束缚;颌下腺;瘦素;大鼠 Effect of mersion restraint stresss on leptin expression in submandibular gland of rats 【Abstract】 AIM: To observe the changes of leptin expression in submandibular gland of rats follomersion restraint stress and to explore the effects and significance of stress response on leptin secretion in submandibular gland. METHODS: Tmersion restraint stress (al control group (n=10). Localization and distribution of leptin in rat submandibular gland munohistochemistry, and the concentrations of leptin in serum and submandibular gland ined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS:Leptin immunoreactive cells ainly located in the epithelial cells of the granular convoluted and striated ducts.The immunoplexes of the ducts but not in the nuclei. The staining intensity for leptin in the granular convoluted duct uch higher than that in striated duct. The leptin staining in the ducts of submandibular gland in and submandibular gland arkedly pared al control group (P0.01). CONCLUSION: Leptin is andibular gland. andibular gland, and these results suggested that leptin in submandibular gland might be involved in the regulation of stress response process. 【Keymersion restraint; submandibular gland; leptin; rat 【摘要】 目的:观察应激状态下 大鼠颌下腺内瘦素表达的变化，探讨应激反应对颌下腺瘦素分泌的 影响及其意义. 方法: 采用水浸束缚应激(ersion restraint)组 (n=10)和正常对照组(n=10). 采用水浸束缚应激模型〔4〕. 乙 醚麻醉下将大鼠四肢固定于特制的木板上，待动物清醒后，置于高 约30 cm的方形塑料桶内，桶内加入温度为21?1?的冷水，使水面 至大鼠的胸骨剑突，经10 h后，即可成功诱发L注射器心内取血2 mL于4?静置2 h，离心(7000 r/min)20 min取上清，-20?保存 备用. 然后从颈部取出双侧颌下腺组织，一侧颌下腺于-70?保存、 留待ELISA检测;另一侧颌下腺组织入Bouins液固定24 h后，常 规脱水、石蜡包埋、制成厚5 μm切片，分别裱贴于预先用APES (3aminopropyltriethoxysilane, Sigma公司)处理过的载玻片上，于 37?恒温箱烤干备用. 1.2方法 1.2.1免疫组织化学染色兔抗 瘦素多克隆抗体购自武汉博士德公司(Boster);生物素标记的羊抗 兔IgG以及ABC试剂盒均购自Sigma公司. 根据免疫组化ABC染 色程序，取制备好的石蜡切片入二甲苯脱蜡10 min×2次，无水乙醇 漂洗5 min×2次. 新鲜甲醇配制的3 g/L(V/V)双氧水漂洗30 min，以 消除内源性过氧化物酶. 0.01 mol/L PBS(pH 7.3)漂洗5 min×3次. 用 15 g/L(V/V)正常羊血清封闭30 min;甩去正常羊血清后，滴加第一 抗体兔抗瘦素(1?200)，4?冰箱内孵育过夜;PBS漂洗5 min×3 次，滴加生物素标记的羊抗兔IgG(1?400)，室温2 h;PBS漂洗5 min×3次，滴加ABC复合物1 h(1?200);PBS漂洗5 min×3次， DAB H2O2显色8~15 min;常规脱水、透明、DPX封片. 用正常兔 血清替代瘦素抗体作为第一抗体进行染色作为阴性对照实验.1.2.4颌 下腺及血清中瘦素的检测瘦素 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司 (Boster)，具体操作步骤按试剂盒说明书进行. 取冻存的颌下腺组 织、称重，用2 mL匀浆器匀浆(加1 mL PBS). 组织匀浆液用样 品稀释液稀释5倍，将预先配置好的品和样品各0.1 mL加入酶 标板孔内，室温孵育5 h;甩去酶标板内液体、不洗，每孔滴加生物 素化抗瘦素抗体工作液0.1 mL， 37?反应1 h;0.01 mol/L PBS洗 涤3 min×3次;ABC工作液每孔0.1 mL(TMB空白显色孔除 外)，37?反应1 h，0.01 mol/L PBS洗涤5 min×3次;TMB显色液 每孔90 μL，37?避光反应25 min;TMB终止液每孔0.1 mL终止显 色. 酶标仪在450 nm测定A值，绘制标准曲线，计算各样品浓度. 血清内瘦素测定同法进行. 统计学处理: 实验数据以x?s表 示，两组间用t检验进行分析， P.05认为有统计学意义. 2结果 2.1瘦素在大鼠颌下腺的定位与分布大鼠颌下腺组织的实质由腺泡和 导管组成，其中纹状管和颗粒曲管(GCT)是导管的主要部分. 瘦 素在正常及affei M, et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue〔J〕. Nature, 1994, 372(6505):425-432. 〔2〕 Moller N, O’Brien P, Nair KS. Disruption of the relationship betans〔J〕. J Clin Endocrinol Metab, 1998, 83(3):931-934. 〔3〕 De Matteis R, Puxeddu R, Riva A, et al. Intralobular ducts of human major salivary glands contain leptin and its receptor〔J〕. J Anat, 2002,201:363-370. 〔4〕 Bohlender J, Rauh M, Zenk J, et al. Differential distribution and expression of leptin and the functional leptin receptor in major salivary gland of humans〔J〕. J Anat, 2002,201:363-370. 〔5〕 彭彦霄, 伍雪芳, 王惠珠，等. 瘦素及其受体在大鼠 下颌下腺的定位研究〔J〕. 解剖学报，2004,35(6): 640-642. 〔6〕 颜光涛, 郝秀华, 薛辉，等. 血清瘦素在手术创伤后应激反应 中的变化〔J〕. 中国危重病急救医学. 2006, 18(3): 172-175. 〔7〕 Konishi N, Otak M, Odashima M, et al. System stress increases serum leptin level〔J〕. J Gastroenterol Hepatol，2006,21(7):1099-1102.