小麦转基因系中B_D基因组上的Bar基因转移至联合山羊草中的风险评价

小麦转基因系中B_D基因组上的Bar基因转移至联合山羊草中的风险评价 () 安徽农业大学学报, 2001, 28 2: 115, 118 Jo u rna l o f A nh u i A g r icu ltu ra l U n ive r sity 基因小麦转基因系中 、基因组上的 BD B a r Ξ 转移至联合山羊草中的风险评价 林毅 ()安徽农业大学生物系, 合肥 230036 评价小麦转基因系中位于 B、D 基因组上的 B a r 基因向联合 摘 要: 通过调查杂交和回交后代的结实率, 山羊草转移的风险。B 基因组含有 B a r 基因的Bo bw h ite 31 系、D 基因组含有 B a r 基因的 Bo bw h ite 71 系和联合 山羊草作为亲本。 采用不去雄、 天然授粉, 去雄、 天然授粉和去雄、 人工授粉 3 种授粉方式以鉴定不同授粉方 式对 基因转移的影响; 通过测定回交后代 基因抗性植株的比例对分别位于 基因组和 基因组中的 B a r B a r B D 基因进行安全评价。 结果明, 在不去雄、 天然授粉的条件下, 结实率是非常低的, 在本次试验中未得到B a r 种子。但是, 在人工授粉条件下,可以获得杂种。基因位点在 B 基因组或在 D 基因组上, B a r 基因的转移有很 大差别。位于B 基因组上B a r 基因向联合山羊草转移比位于 D 基因组上的 B a r 基因更为困难。因为小麦基因组 构成为A A BBDD , 联合山羊草为 CCDD , 它们有公共的 D 基因组, 在配子形成时 D 基因组的染色体不会形成单 () (价体而丢失。试验中,71 系×联合山羊草×联合山羊草群体中 基因抗性植株比例较高, 31 系×联合山 B a r ) 羊草×联合山羊草未检出抗性植株。因此, 或 基因组带 基因的转基因小麦可以用来控制杂草, 以减 B A B a r 轻抗性基因从转基因小麦中向联合山羊草转移的风险。 小麦; 联合山羊草关键词: 风险评价; 基因; B a r () 中图分类号: 789文献标识码: 文章编号: 100022197 20010220115204 Q A 利用抗除草剂基因结合施用除草剂的来控制杂草是生物技术领域里近年来倍受关注的一个重 方法。 采用基因工程技术培育出带有抗除草剂基因的作物品种, 可以有效地解决价格低廉、 广谱灭生 除草剂只能在播前施用的缺点, 由空茬一次施用到作物生长期全程施用, 从而有效地控制杂草, 降低 本, 增加产量, 提高经济效益。带有 基因具有草苷磷抗性的转基因小麦的育成, 展示了这一应用领 B a r 的十分广阔的前景。 但是, 转基因小麦中的转基因是否存在着向它的近缘杂草转移的风险, 这是科学 普遍关注的问题。 目前已有多篇报道证明转基因小麦中的抗除草剂基因可以通过有性杂交向麦田中主 杂草联合山羊草中转移, 形成一个介于小麦与联合山羊草之间的过渡类型。 这种过渡类型可能通过多 1 , 4 同山羊草回交, 形成一种能抗除草剂的山羊草, 或者自然界尚不存在的新型杂草。这种结果将会使 麦杂草控制更加复杂和困难。 鉴于小麦中转基因主要通过有性杂交转移, 而小麦和它的近缘杂草基因组构成又不相同的这一事实 因此, 可以利用基因位点在特定的基因组上的小麦转基因系来降低或避免转基因向山羊草转移的风险。 通小麦是一个异源六倍体, 含有 基因组; 联合山羊草是一个异源四倍体, 含有 基因组A A BBDD CCDD 二者共同含有 基因组, 具有一定程度的同源关系。对两种不同的物种而言, 其基因组同源程度越大,D 们杂交的可能性及杂种可育程度也越大。 普通小麦之所以能和联合山羊草杂交并产生可育的种子, 就 因为它们都拥有 基因组。D 基于对普通小麦和联合山羊草基因组组成和植物有性繁殖过程的分析, 选择转基因位于、基因 A B 上的转基因小麦品种来降低抗除草剂转移的风险, 理论上应是可行的。 为了实际验证这种理论上的可 性,本试验选用 基因分别位于 和 基因组的转基因小麦品系,在温室条件下, 通过有性杂交和 B a r B D Ξ 收稿日期: 2000211228 () 作者简介: 林毅 1957- , 男, 硕士, 副教授。 种后代的抗性分离比例分析, 对不同位点的转基因向联合山羊草转移的风险和不同杂交方式对杂交可能 性的影响进行了比较, 以期为选择转基因位于适当的基因组上的转基因小麦提供科学依据, 使转基因小 麦品种, 结合除草剂的施用, 既能有效地控制杂草又能降低或避免转基因向杂草转移的风险。 1 材料与方法 111 实验材料 转基因小麦Bo bw h ite 31 系, B a r 基因位于其B 基因组; 转基因小麦Bo bw h ite 71 系, B a r 基因位于其 基因组; 联合山羊草, 冬小麦麦田中危害严重的一年生越冬性杂草, 分布范围较广。D 转基因系由英国 实验室提供, 联合山羊草由以色列魏兹曼科学院植物科学系提供。Bo bw h ite P u rau 转基因小麦系是采用基因枪轰击法, 将抗草苷磷 基因导入普通小麦品种 的幼胚,Bo bw h ite B a r Bo bw h ite 经过组培筛选、抗性鉴定、自交纯化等过程选育而成的。它们的基因位点已通过细胞遗传学和分子生 B a r 物学方法鉴定。 112 实验方法 11211 试验材料的种植 采用营养钵种植。供试材料各种 10 钵。31 系和 71 系每钵种 5 株, 联合山羊草 每钵 1 株。播种前, 选择成熟饱满种子于室温下浸泡 4 , 再移至带有用水浸透的滤纸的培养皿中, 倒臵h 于 25?下,转基因材料催芽 24 , 联合山羊草催芽 48 。选择露嘴的种子用镊子植于营养钵中。所有试 h h 验材料, 1999 年和 2000 年均种植于以色列魏兹曼科学院自动化温室中。 11212 杂交和回交方法 采用不去雄、天然授粉, 去雄、天然授粉和去雄、人工授粉 3 种方式进行杂交。 杂交时以联合山羊草为母本, 转基因系为父本; 回交时以 为母本, 山羊草为父本。当母本材料部分现F 1 穗时, 开始去雄。用剪刀剪去 13 小穗上部, 再用镊子拔除 3 枚花药, 然后套上杂交袋, 用别针别好。去 ƒ 雄 2 后开始授粉。授粉之前, 检查花药是否开始散粉。以花药顶端触及拇指盖, 如有花粉散出, 表示此d 花药适于授粉。授粉时, 以花药轻涂柱头一次即可。一般 1 枚花药可授粉 3, 5 朵小花。由于麦穗不同部位、 小穗发育的时间不同, 因此, 在温室条件下, 上午 9 时至下午 5 时均可进行授粉。 自然授粉时, 将 花期相遇的父、母本穗子平行迭套在两头开口的同一杂交袋中, 父本在上, 母本在下, 用回形针别好, 让 其自然完成授粉过程。 11213 抗性鉴定 采用涂抹法对 代和 代植株进行 基因抗性鉴定。 在鉴定材料生长至 1 月左 F 1 BC 1 B a r 右 时, 用小毛笔醮上 150 加 011% 吐温 20 溶液涂抹主茎和分蘖上部的叶片, 每株取主茎ƒm lL g lu fo sin a te 和分蘖叶各 1 片, 于叶片中部涂抹 1 长, 正、反面涂抹, 每天 1 次, 连续涂抹 7 , 整个过程完成 3 cm dd后, 检查叶片涂抹区变化。含基因的抗性植株叶色正常, 没有基因的敏感植株叶色变黄甚至枯萎。B a r B a r 结果与分析2 211 杂交方式对 B a r 基因转移的影响 通过有性杂交完成B a r 基因向联合山羊草的转移, 杂种的结实率 是唯一的衡量指标, 而杂交方式又明显地影响杂种的结实率。由表 1 可见, 不去雄、天然授粉这一方式, 没有获得任何种子。 这是由于普通小麦和联合山羊草均为自花授粉植物, 天然异交率很低, 所以, 在小 样本条件下, 普通小麦参与联合山羊草的授粉过程难以发生。 去雄、 天然授粉, 可以得到 16%, 17% 的 杂交结实率。 这一结果表明, 普通小麦的花粉可以在联合山羊草的柱头上萌发, 完成授粉、 授精和种子 发育成熟过程。 但是, 由于授粉过程是一种随机的、 自然发生的过程, 加之联合山羊草的花器较小, 很 难保证每个柱头上都有花粉散落, 所以结实率很低。 去雄、 人工授粉方式可以保证每个柱头都有花粉散 落, 因此, 有提高结实率的可能。 不过授粉的时期和授粉的技能是影响结实率的关键。 只有选择成熟的 2 开始授粉较为适宜,而花去雄后 花粉粒, 在柱头易于接受花粉时授粉, 才能提高结实率。试验表明,d 药变黄并且开始散粉是花粉成熟的标志。 212 不同的 B a r 基因位点对 B a r 基因转移的影响 由于 31 系和 71 系中B a r 基因的位点不同, 它们转移 () 至联合山羊草的可能性差异很大。通过对 群体中 基因抗性植株鉴定的结果 见表 2可以看出,BC 1 B a r ) (尽管两个系与联合山羊草杂交和回交的结实率无明显差异, 但是在回交群体中, 71 系×联合山羊草× () 联合山羊草的群体中, 抗性植株比例明显增加, 而在 31 系×联合山羊草×联合山羊草群体中未检测 出抗性植株。这种结果表明, 在五倍体 杂种中, 位于 基因组上的 基因, 由于所在的基因组是成F 1 D B a r 双的, 在形成配子时, 每个配子都能得到完整的 D 基因组, 所以 B a r 基因不会丢失。而位于 B 基因组 的 基因,它在五倍体中是成单的。 在减数分裂时,成单的 组染色体随机向两极分离,每一极分B a r B 1, 7 条染色体不等。 但是, 7 条染色体同时分到一极的概率是相当低的, 而带有不完整染色体的配子 常是败育的。这样, 基因随配子的败育和染色体的丢失而丢失。因此, 其后代群体中含有 基因 B a r B a r 株的比例大大降低。 3表 1不同杂交方式下的 结实率 F 1 1 T ab le Seed se t o f F 1 w ith d iffe ren t c ro ssing m e tho d s 处理穗数结实率ƒ% 杂交方法 31 系71 系31 系71 系 不去雄、 天然授粉200 200 0 0 去雄、 天然授粉 100 100 16 17 100 100 21 18 去雄、 人工授粉 3 父本为转基因 31 系和 71 系。 3表 2不同回交方式下 的结实率及抗性和敏感植株分离比率 BC 1 2Seed se t and seg rega t io n ra t io be tw een th e re sistan t and sen sit ive p lan t s T ab le o f BC 1 w ith th e d iffe ren t m e tho d s 处理穗数结实率%分离比率ƒ 回交方式 31 系71 系31 系71 系31 系71 系 不去雄、 天然授粉100 99 0 0 0 0 94 94 0 0 0 0 去雄、 天然授粉 50 50 2 去雄、 人工授粉 ?12?10215 3 回交父本为联合山羊草。 3 小结与讨论 ,基因的转移都是通过有性杂交来实在自然条件下311 关于 基因转移至联合山羊草的可能性 B a r 的。 由于起源和进化过程不同, 不同的物种之间形成了生殖隔离。 在自然, 甚至人工条件下, 都不能 过有性杂交产生可育的种子来完成遗传物质的转移。 因此, 判断 基因有无转移至联合山羊草的可 B a r 性, 主要是依据带有基因的转基因小麦能否与联合山羊草发生杂交并产生可育的杂种后代。本试验B a r 果是在温室条件下取得的。在比较接近大田自然授粉条件的不去雄、天然授粉方式下, 未得到杂交种子 5 , 6 () 但是,这一结果并不能说明小麦和联合山羊草的自然杂交是不可能的。 等1998报道小 Zem e t ra 和联合山羊草可以发生杂交, 其杂种的育性为 2%, 3% 。本试验之所以未得到杂交种子, 主要是因为 交群体偏小所致。从人工杂交和回交的结果来看, 基因向联合山羊草转移的风险还是存在的, 因为 B a r 能得到可育的种子。 在大田条件下,如果具有 基因的小麦品种种植面积较大,它们与联合山羊草杂交的机会将增加 B a r 因此, 基因向联合山羊草中逃逸的风险也随之增加。但是, 考虑到小麦与联合山羊草的染色体组成B a r 异较大, 仅有 基因组是相同的; 加之杂交后形成的五倍体是不稳定的, 可育程度极低, 基因要稳 D B a r 地存在联合山羊草中, 或者稳定地存在介于小麦和联合山羊草之间的过渡类型中, 也将是一个漫长的 程。 基于这种情况, 可以采取适当的大田管理, 如在未成熟之前拔除杂种植株, 换茬轮作等, 以 轻或避免 基因逃逸的风险。B a r 312 关于位于 、、基因组上的 基因逃逸的风险评价 本试验选择的转基因材料只包括 A BD B a r B a r 因位于 、基因组上的两种情况, 而不包括位于 基因组的材料。因为位于 、基因组上的 基BD A A B B a r 向联合山羊草转移的过程是相同的, 所以, 为了减少工作量,只选择了 基因位于 基因组上的材料 B a r B 从回交群体中抗性与敏感性植株分离比例来看, 在以 基因位于 基因组上的转基因小麦为父B a r B 的回交后代群体中, 抗性植株为零, 表明基因在传递过程中随带有基因所在的染色体在减数分B a r B a r 过程中丢失而丢失;而以 基因位于 基因组上的转基因小麦为父本的回交后代群体中,抗性植株 B a r D 多, 说明小麦与联合山羊草共同存在 基因组, 在减数分裂过程中, 组染色体是均衡的, 可以正常D D 分配到配子当中去, 以保证 B a r 基因的正常传递。由此可见, 位于 A 、B 基因组上的 B a r 基因转移至联合 山羊草的风险小于位于 基因组上的 基因。 因此,可以利用这一差别,创造和选育 基因位于 D B a r B a r A 或 基因组上的转基因小麦品种应用于大田, 以控制小麦的主要杂草联合山羊草。 但是, 本文仅讨论了B 转基因的同源侵染, 而未涉及异源侵染的问题。尽管在有性杂交过程中, 同源侵染是主要途径, 但是, 从 理论上分析, 不能排除异源侵染的可能。 这一问题有待于进一步探讨。 参考文献: 1 () , . T r i t icum aes t iv um L in Y iG re sse l JPo ten t ia l app ro ach e s fo r gene t ran sfe r be tw een t ran sfo rm ed w h ea t and it’ s () re la t ive w eed s [J . 安徽农业大学学报, 2001, 28 1: 1, 5 2 1999, 17: 361, 366G re sse l J. T andem co st ruc t s: P reven t ing th e r ise o f sup e rw eed s [J . T ib tech , 3 . : , , [. D uk e S OH e rb ic ide R e sistan t C rop sA g r icu ltu ra lE nv iro nm en ta lR egu la to ry and T ech n ica l A sp ec t s M CR P , 1991, 53: 3, 17P re ss 4 ,1992, 6: 613. 2: [. , H a r r iso n H F J rD eve lop ing h e rb ic ideto le ran t c rop cu lt iva r sin t ro duc t io n J W eed T ech no l 614 ) ((5 T r i t icum aes t iv um A eg i lop s , . Zem e t ra R Se t a lPo ten t ia l fo r gene t ran sfo r be tw een w h ea t and jo in ted go a tg ra ss ) cy l ind r ica [. , 1998, 46: 313, 317J W eed Sc i ) ((, . 2A eg i lop s cy l ind r ica ×T r i t icum S teven S Se t a lP ro duc t io n o f h e rb ic idere sistan t jo in ted go a tg ra ss w h ea t 6 ) aes t iv um [. , 1998, 46: 632, 634h yb r id s in th e f ie ld by na tu ra l h yb r id iza t io n J W eed Sc i R isk A s se s sm en t o f B a r Gen e T ran sfe r f rom B an d D Genom e s () T r i t icum a es t iv um o f T ran sfo rm ed W h ea t L in e s () to Jo in ted Go a tg ra s s A eg i lop s cy l in d r ica L IN Y i (), , 230036D ep a r tm en t o f B io eng inee r ingA nh u i A g r icu ltu ra l U n ive r sityH efe i A bstra c t: T h e r isk a sse ssm en t o f B a r gen e t ran sfe r f rom B an d D genom e s o f t ran sfo rm ed w h ea t 2. lin e s to jo in ted go a tg ra ss w a s do n e b y in ve st iga t in g th e seed se t o f h yb r id s o f c ro sse s an d b ack c ro sse ssT 31 , 71 ran sfo rm ed Bo bw h ite lin e w ith B a r gen e in B genom elin e w ith B a r gen e in D genom e an d jo in ted go . , 2a tg ra ss se rved a s th e p a ren t sT h ree w ay s o f po llin a t io n in c lu d in g no n em a scu la t io n an d spo n tan eo u s po , , llin a t io n em a scu la t io n an d spo n tan eo u s po llin a t io n an d em a scu la t io n an d a r t if ic ia l po llin a t io n w e re . adop ted in o rde r to ve r ify th e effec t s to b a r gen e t ran sfe r u n de r th e d iffe ren t po llin a t io n co n d it io n sB y te st in g th e ra t io o f re sistan t p lan t s in b ack c ro ss pop u la t io n th e safe ty a sse ssm en t to B a r gen e lo ca t in g o n . B genom e an d o n D genom e w a s do n eT h e re su lt s show ed th a t th e seed se t w a s ve ry poo r u sin g th e w ay 2, , o f no n em a scu la t io n an d spo n tan eo u s po llin a t io n ac tu a lly no seed w a s o b ta in ed in th is exp e r im en thow 2 , . eve rth e h yb r id s w e re ava ilab le u n de r th e co n d it io n o f a r t if ic ia l po llin a t io nA s to B a r gen e t ran sfe r th e re . w a s sign if ican t d iffe ren ce b e tw een th e gen e lo c i in B genom e an d in D genom eT h e fo rm e r w a s m o re d if2 , f icu lt to b e t ran sfe r red f rom t ran sfo rm ed w h ea t to jo in ted go a tg ra ss th an th e la te rb ecau se w h ea t co n2 , , sist s o f A A BBDD genom e s an d jo in ted go a tg ra ss is CCDD genom e sw h ich sh a re a comm o n D genom e . so th e ch rom o som e s o f D genom e w ill no t b ecom e u n iva len t an d b e lo st in fo rm in g gam e teIn th is exp e r i2 () m en t, a h igh e r ra t io o f re sistan t p lan t s w a s fo u n d in pop u la t io n o f 71 lin e×jo in ted go a tg ra ss×jo in ted () , 31 ××go a tg ra ssan d no re sistan t p lan t s ex isted in th e pop u la t io n o f lin ejo in ted go a tg ra ssjo in ted go a t2 . g ra ssT h e refo re th e t ran sfo rm ed w h ea t w ith B a r gen e in B o r A genom e can b e u sed to co n t ro l g ra ss in .o rde r to m it iga te th e r isk o f gen e t ran sfe r f rom t ran sfo rm ed w h ea t to jo in ted go a tg ra ss : ; ; ; Key word sr isk a sse ssm en tB a r gen ew h ea tjo in ted go a tg ra ss