生化实验报告 胰蛋白酶活力测定胰蛋白酶活力测定
一、实验原理
1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼蓝)。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
三、实验试剂
1、福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)
2、0.55mol/L碳酸钠溶液:58.3...
胰蛋白酶活力测定
一、实验原理
1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钨蓝和钼蓝)。
2、蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
二、实验仪器
1、试管
2、7220分光光度计
3、恒温水浴锅
三、实验试剂
1、福林试剂B:见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中)
2、0.55mol/L碳酸钠溶液:58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水,稀释并定容至1000ml
3、10%三氯乙酸溶液
4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5):
5、0.5% 酪素溶液:称取0.5g酪素,以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润,再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解,冷却,稀释并容至100ml,冷藏在(冰箱)里。
6、500ug/L酪氨酸溶液
7、胰蛋白酶溶液(冰箱中)
四、实验步骤
1、标准曲线的制作:按下
加入试剂:
管号
1
2
3
4
5
6
500ug//酪氨酸溶液/ml
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水/ml
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
各管中加0.5%酪素2ml,于37℃水浴中反应15分钟,然后加入10%三氯乙酸3ml,过滤除去沉淀,取清液1ml,加入0.55mol/L碳酸钠5ml,再加入福林试剂1ml,于37 ℃水浴中显色15分钟,测OD680。
以光密度为纵坐标,酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。
2、样品测定:取干燥的试管2支,按下表加入试剂
管号
7
备注
0.5%酪素溶液
2.0
37水浴中酶解15分钟
2mg/ml胰酶溶液
1.0
10%三氯乙酸溶液
3.0
过滤
上清液
1
37水浴中显色15分钟
0.55mol/L碳酸钠溶液
5.0
福林试剂B
1
OD680
酶活力:在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。
样品中含酶活力单位=A/15 ╳F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
五、实验结果
管号
1
2
3
4
5
6
7(样品)
酪氨酸微克数
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
-----------
OD680
0
0.157
0.258
0.379
0.499
0.585
0.993
OD680
0
0.156
0.259
0.379
0.496
0.585
0.993
OD680
0
0.157
0.258
0.378
0.497
0.585
0.994
OD680(平均)
0
0.157
0.258
0.379
0.497
0.585
0.993
由上表可作出标准曲线如下:
由上可知,样品的吸光度y=0.993,则x=0.8μg,即A=0.8μg
故根据
样品中含酶活力单位=A/15 ╳F
A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数
F—酶液稀释倍数
胰蛋白酶活力为:0.8 /15 ╳13=0.69
六、实验
1. 测定胰蛋白酶活力的原理?
答:蛋白质中含具酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),用胰蛋白酶水解蛋白底物,生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应,生成蓝色化合物,在一定的范围内,蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。
2. 胰蛋白酶的最适PH值多少? PH值对胰蛋白酶稳定性有何影响?
答:胰蛋白酶的最适PH值为8.1。胰蛋白酶的活性在一定的PH值范围内随着PH值的升高而升高,超过最适的PH值时酶活性降低。
本文档为【生化实验报告 胰蛋白酶活力测定】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑,
图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。