金水六君煎总黄酮清除氧自由基的作用

金水六君煎总黄酮清除氧自由基的作用 金水六君煎总黄酮清除氧自由基的作用 第26卷第3期 2005年6月 暨南大学(自然科学版) JournalofJinanUniversity(NaturalScience) Vo1.26No.3 Jun.2o05 金水六君煎总黄酮清除氧自由基的作用 谢晓华,郭书好2,沈英森 (暨南大学1.华文学院预科部,2.化学系,3.中医系,广东广州510632) [摘要]研究了金水六君煎总黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用.用benton反应 产生羟自由基,用黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基.分别向产生羟自由基和超氧阴离 子自由基的反应系统中加入金水六君煎总黄酮,两种自由基的产生量显着减小,且随着黄酮量的增 加,两种自由基产生量减小得也越明显. [关键词]金水六君煎;黄酮;超氧自由基;羟自由基 [中图分类号]11284[文献标识码]B[文章编号]1000—9965(2005)03—0443—03 金水六君煎由当归,熟地黄,法半夏,茯苓,陈皮,炙甘草等组成,是至今仍在临床上使用的明代古方[1I,对 慢性支气管炎有良好的疗效[2,3].单味陈皮,炙甘草中含有的橙皮苷和甘草总黄酮已被证实具有较强的清除 羟自由基的能力[,.金水六君煎作为复方药剂,从中提取的总黄酮清除自由基的作用还未见有报道. 由于 炎症的发生与自由基密切相关,为了进一步探讨金水六君煎的治疗机理,本实验用 溶剂法从金水六君煎里提 取总黄酮,并对其清除羟自由基及超氧自由基能力进行了实验研究. 1仪器与试药 1.I仪器和试剂 970一MC荧光分光光度计,上海第三分析仪器厂;双波长双光束紫外分光光度计,英国,UMQ蝴UV500. Ce(NO3)3?6O:AR,中国医药集团上海化学试剂公司生产;黄嘌呤(m【),黄嘌呤氧化酶(x0),细胞色素 C(CytoC):Sienna公司生产;甘露醇,分析纯,上海伯澳生物试剂厂;乙醇,石油醚,乙酸乙酯,FeS04?7H20,质量 分数为30%H202,磷酸氢二钾,磷酸二氢钾:分析纯,广州化学试剂厂生产. 1.2药品 法半夏(1042),安徽产,用粉碎机粉碎;陈皮(2133),广东产,剪成细条状;当归(1016A),甘肃产,剪成细条 状;炙甘草(1015B),内蒙产,用粉碎机粉碎;熟地(1018B),河南产,剪成细条状;茯苓(70o1B),湖北产,用粉碎 本地产,切成细条状.甘草总黄酮【J及橙皮苷[']自制. 机粉碎;生姜, 2实验方法 2.1金水六君煎总黄酮的制备 将140g金水六君煎,用体积分数为75%乙醇按固液比为1:9(1g:1lnL)索氏抽提至接近无色,过滤,滤液 于60?水浴中减压浓缩成稠状,加热水搅拌溶解后,依次用石油醚,乙酸乙酯萃取3次,乙酸乙酯萃取液用质 量分数5%的碳酸钠水溶液萃取,碱水液用浓盐酸调至pH为5左右,放置冰箱过夜,待有沉淀析出,过滤,沉 [收稿日期】2O04—06—25 [基金项目】广东省中医药管理局资助项目(100069) [作者简介】谢晓华(1969一)女,讲师,主要研究方向:天然产物分析 444暨南大学(自然科学版)20o5年 淀物于60~C恒温干燥至恒重,即获得棕黄色总黄酮.经紫外分光光度法测定,黄酮质量分数为12.4%. 2.2金水六君煎总黄酮清除羟自由基的能力【引, 在稀硫酸介质中,Ce3能产生特征荧光,其最大激发波长在280nin,荧光峰在360啪.有荧光的Ce3+被 Fenton反应产生的?OH氧化生成无荧光的Ce4,通过测定Ce3的荧光强度变化可间接测定系统中?OH的生 产量. 在10rTIL容量瓶中,加入8mmol/LC~(NO3)3,0.5mol/LHzSO4,20mmol/LFeSO4和3mmol/LHz02各1rTIL, 加去离子水至刻度,混匀.60rain后,测定360nin的荧光强度(激发波长为280nin).此体系为空白体系,测得 的荧光强度为.在另外几个容量瓶中除空白体系外分别加入1mL不同浓度的金水六君煎黄酮溶液,测得 荧光强度为;未加Fenton试剂(FeSO4和H202)及清除剂的体系,测得的荧光强度为F,则 rF—F, 清除率=×100% ,一,0 依上述方法,同样可测定不同质量浓度的甘草总黄酮,橙皮苷及甘露醇对羟自由基的清除率. 2.3金水六君煎总黄酮对超氧阴离子的清除作用【l0J 黄嘌呤(}D()在黄嘌呤氧化酶(x0)的作用下可产生一,一可使细胞色素C还原,CytoC—Fe(?)+0=i一 一CytoC—Fe(?)+02,细胞色素C的最大吸收峰由557nm移至550nm. 一 的抑制率的测定:在反应池中加入HX,EDTA,50mlol/L磷酸钾缓冲液(=7.8),各提取物(对照以等 体积缓冲液代替提取液),CytoC.各物质反应浓度为HX:0.1ramol/L;EDTA:0.1retool/L;CytoC:0.01ramol/L;提 取物浓度不等.最后以6.25U/L的XO启动反应,以其前2rain的反应速度的变化来计算提取物对一的 抑制能力,以,(%)表示.提取物的抑制率,可由下式给出 ,(%)=(Vo,对照一Vo,加提取物)/Vo,对照×100% 前2min的反应速率变化I/o一2=CO—c2/2(c为CytoC的浓度),根据hber—Beer定律A=,(其中J4为 溶液的吸光度;?A为开始和2rain时溶液的吸光度的差值;K为摩尔消光系数;L为比色池的光径长度) C=A/KL,=(Vo一2对照一Vo一2加提取物)/Vo一2对照=(对照一AAIm~)/对照(ZXA=Ao—A2). 3结果 3.1金水六君煎总黄酮对?OH的作用 (1)金水六君煎总黄酮对?OH的作用:图1表明,金水六君煎对?OH有清除作用,且呈剂量依赖关系.对? OH产生50%清除效应所需药物剂量为26.64mg/L. (2)金水六君煎,橙皮苷,甘草总黄酮,甘露醇对?OH的作用:实验中以公认的羟自由基清除剂一甘露醇作 阳性对照.图1,图2表明,橙皮苷,甘草总黄酮,甘露醇对?OH产生50%清除效应所需药剂量分别为:16.8, 473.0,2653.6mg/L.上述几种药品对?OH的清除作用大小关系为:橙皮苷>金水六君煎总黄酮>甘草总黄酮 >甘露醇. 褥 篮 士 9 图1金水六君煎总黄酮和橙皮苷清除?OH作用 褥 篮 士 0 P/(mg?0'1 图2甘草总黄酮和甘露醇清除?OH作用 第3期谢晓华等:金水六君煎总黄酮清除氧自由基的作用445 3.2金水六君煎总黄酮对超氧阴离子的作用 金水六君煎总黄酮,橙皮苷和甘草总黄酮抑制l?和XO体系产生的o2一活性的作用,见表1 表1提取物抑制ItX和XO体系产生的oi一活性n:3 金水六君煎总黄酮,甘草总黄酮,橙皮苷都有明显的清除超氧自由基的能力.其中甘草总黄酮清除超氧自 由基的能力大于金水六君煎总黄酮大于橙皮苷.由橙皮苷与甘草总黄酮做协同实验,显示两者有协同效应. 本实验为金水六君煎治疗慢性支气管炎的研究提供了一些实验依据,同时也为研究金水六君煎总黄酮的 抗氧化作用机理提供了科学资料.至于金水六君煎总黄酮在动物体内清除自由基的能力如何,还有待进一步 加以研究. [参考文献] [1]张景岳.景岳全书[M].第5版.上海:上海科学技术出版社,1984:986. [2]赵长鹰,沈英森,盂辉等.金水六君煎121服液治疗慢性支气管炎的临床及实验研究[J].中国中西医 结合杂志,1997,17(5):264. [3]沈英森,吕小亮,姜杰等.金水六君煎121服液质量的动物实验研究[J].中药材,2002,25(1): 484—486. [4]吴碧华,龙存国,王晓明等.甘草总黄酮清除羟自由基作用的体外实验探讨[J].川北医学院, 2001,16(1):3—4. [5]秦德安,苏丹,王晓玲.橙皮苷对羟自由基的清除作用[J].中国药学杂志,1996,31(7):396—398. [6]高素莲,王雪梅.甘草中皂甙和黄酮类化合物的提取分离与测定[J].安徽大学(自然科学版), 2000,24(4):69—74. [7]严赞开,严奉伟,曾扬等.桔皮中提取橙皮苷方法的研究[J].湖北农学院,2000(2):166—167. [8]贾凌云,孙毅,王春阳等.菊花总黄酮提取工艺研究[J].中药材,2003,26(1):35—36. [9]徐向荣,王文华,李华斌.荧光法测定Fenton反应产生的羟自由基[J].分析化学,1998,26(12):1460. [编辑:黄建军]