TRAIL、DR5及NFκB p65在人难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕中的表达及其意义的研究（可编辑）

TRAIL、DR5及NFκB p65在人难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕中的表达及其意义的研究（可编辑） TRAIL、DR5及NFκB p65在人难愈合创面肉芽组织和增 生性瘢痕中的表达及其意义的研究 山东大学 博士学位 TRAIL、DR5及NF-κB p65在人难愈合创面肉芽组织和增生性瘢 痕中的表达及其意义研究 姓名:李强 申请学位级别:博士 专业:外科学(整形) 指导教师:蔡景龙 20081021尔人。’’尊卜丫:何论文、及 在人难愈合创面肉芽组织 和增生性瘢痕中的表达及其意义研究 中文摘要 研究背景 瘢痕是各种创伤组织修复愈合的必然结果。它主要发生在创伤、感染、手术 是最常见的病理性瘢痕 和烧伤等创面中。增生性瘢痕 ,其是以成纤维细胞的过度增生和细胞外基质成分的过度聚集 为主要特征,临床上其虽然仅局限在原伤口范围内生长,但其发病机制至今 尚不 确切。其临床表现为局部疼痛、瘙痒、突出于皮肤表面的增生肿块,并伴有不同 程度的功能障碍,危害人们的身心健康,在预防及治疗上尚无特效,是目前 整形外科研究的热点和难点问之一。 细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象,是维持体内细胞数量动态平衡的 , 基本措施。细胞凋亡,又称为程序性细胞死亡 ,是有别于细胞坏死而受基因控制的一种主动性细胞自杀过程。肿瘤坏死 因子凋亡配体【, 广泛地存在于人体各个组织和器官,能定向地导致异常细胞的凋亡,而 不会影响下常细胞的生长分化。在增生性瘢痕中的死亡受体 ,起着重要的促凋亡作用【】。越来越多的研究表明许多疾病的发 生、发展都与的凋亡抑制有关,以作为靶点治疗或缓解疾病已经 成为研究热点,并已应用于临床实验中。 ,.是一种具有多向性调节作用的转录因 核因子一 子,对细胞内许多基因的表达起着关键性的调控作用,参与细胞的生长、发育、 凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用。越来越多 的研究表明许多疾病的发生和发展都与?的过度活化有关。.信号转 导通路也贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程。研究表明,? 是 ..信号传导通路的关键基因。 目前,有关及其和. 在难愈合创面肉芽组织及增生性乃:人学博十孚:何论文 瘢痕中表达状况如何、它们之间的联系如何等问题国内外尚未见报道。本研 究拟 以人难愈合创面肉芽组织、不同时’白范围阶段的增生性瘢痕为研究对象, 以正常 皮肤为对照,采用免疫组化、和 技术检测及其死亡 受体和. 在难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕各阶段中的表达,并 探讨其之间的联系,以进一步探讨瘢痕增生的机理,为临床治疗增生性瘢痕 提供 新的研究方向和思路。 目的 本研究拟观察信号传导通路中凋亡因子及其凋亡受体 和.信号传导通路关键基因在人难愈合创面肉芽组织、不同时间阶段 的增生性瘢痕以及正常皮肤标本的表达水平是否存在差异及、和 . 之间的联系。 方法 收集临床标本例为实验组,其中难愈性创面难愈合创面肉芽组织组、 半年内增生性瘢痕组、半年至一年增生性瘢痕组、一年以上增生性瘢 痕组组织各例,收集正常皮肤组织标本例为对照组组。采用组 织免疫化学方法分析各标本中、. 表达:提取以及核蛋白, 实时荧光定量检测组织中、及. 表达水平; 利用 技术检测以及. 的蛋白表达水平。 结果 .病理切片染色各组组织均为相应的病理表现。组中可见大量内皮 细胞和毛细血管,以及许多新生的圆形纤维母细胞,胶原纤维形成少,有炎性 细 胞浸润。组到组中纤维母细胞逐渐减少,形态由扁圆形逐渐变为细长,炎 性细胞和毛细血管逐渐减少至消失,皮下胶原纤维由粗大、紊乱逐渐变细、 排列 逐渐变规则,表皮较正常皮肤薄,无脚突和皮肤附属器。组表皮层次清楚,角 化层角化明显,皮肤附属器丰富,胶原纤维束排列规则,少而疏松、细胞较少。 。免疫组化法染色在组、组成纤维细胞细胞浆中表达强阳 性,组、组阳性表达逐渐减弱,接近组;组和组表达明显强于组、 . 组和组: 主要表达部位为基底细胞和成纤维细胞的细胞浆和细 胞核内,组内表达与组接近,在增生性瘢痕各阶段、、组中表达力:人’学考十’ ?市沦文 阳性,尤其是在组中皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显。 .检测表达水平在组和组呈较高水平,明显 均高于其它各组.,而组与组之间差异无显著的统计学意义 .,组、组与组各组间比较,其差异也均无显著的统计学意义 .。 表达水平在组中最高,明显高于各组.,、、 组表达水平均低于组,其差异均有显著的统计学意义.,但、、 组之间比较,其差异均无显著的统计学意义.。 . 表达水平各组间比较,其差异均无显著的统计学意义 .。但从各组均数来看,组和组处于较低水平组为.,组为 .,、、组处于较高水平组为.,组为.,组为.,数 值相近,并且有高于组和组的趋势。 在与线性相关分析中,相关系数为.,.., 说明与存在正相关。 在? 与线性相关分析中,? 与的 相关系数为.,..,说明? 与存在正相关。 在. 与线性相关分析中,相关系数为..,. .,说明.与相关性无显著的统计学意义。 . 检测在组和组中蛋白表达水平较高,在组、 组、组蛋白表达水平基本接近,经统计学处理,组和组蛋白表达水平明 显高于其它各组.,而组与组之间差异无显著的统计学意义 .。 . 在组和组中蛋白表达水平差异没有显著的统计学意义 .,组、组、组的蛋白表达水平明显要高于组和组.。 结论 .在难愈合创面肉芽组织中和死亡受体表达水平明显增高, . 表达水平较低,表明难愈合创面肉芽组织中细胞凋亡增强,抗凋亡 水平受到抑制,组织难以愈合。尔人。丫:博十’半:何论文 .在增生性瘢痕早期半年内中,的表达仍然较高,但其死亡受 体的凋亡水平明显低于正常,. 的表达明显增强,表明在增生性 瘢痕早期瘢痕组织凋亡作用降低,抗凋亡作用明显增强,瘢痕组织表现出明 显的 增生作用。. 皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显,表明? 可能在增生性瘢痕增生中发挥着重要作用,对增生性瘢痕凋亡有着强有力的 抑制 作用,促进了增生性瘢痕增生。 .在增生性瘢痕后期半年.年,及其死亡受体的表达均处 于较低水平,. 的表达仍高于正常皮肤,表明在增生性瘢痕后期细胞 凋亡水平较低,抗凋亡水平较高,仍有组织增生。 .在增生性瘢痕成熟期年后,和? 表达水平接近正 常皮肤。瘢痕组织凋亡作用增强,增生减弱,变得平坦和消退。 .. 与存在正相关,表明了与. 表达水平 变化趋势是同向的,在一定程度上反映了表达与. 表达相互影 响和作用。与存在正相关,表明与其受体表达水平的 变化趋势是同向的,在一定程度上反映了组织细胞对诱导凋亡的敏感性。 意义 本研究率先检测了、死亡受体和. 在难愈合创面肉芽 组织及增生性瘢痕中不同增生阶段的表达,提示了凋亡途径和. 凋亡调控极有可能参与难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕的异常凋亡过程, 对进一步认识难愈合创面肉芽组织的修复和瘢痕增生的机制及其防治具有 一定 意义,为我们在临床上开展难愈性肉芽创面治疗和瘢痕增生防治提供新的研 究方 向和思路。 关键词:增生性瘢痕; 一 ? : ;核转录因子:凋亡力:人。丫:博十。、?:何论文?. , , . ,,. . ,, . , ’ . . , .,?。. , , . , . . ,.?.‘ 尔人学博十学节论史,. ,, , ,雒 .?.. ? .??,., ? .., ?: ?., ,,?, . , , , , , , ,?. .; . ; . , : , , , .. ., ,... . .,. , . ,;, ;? , ,,, .... . , ., 尔人学博十。学仲论文., , .尸..., , ..,,..,,.. ., 护.. ., ., ., .. ,,, .,,., . . ,.., ? ,.,.., .? ,.,.., .. , ,, , ..., , ,.. 尔人。字:博十。;:何沦文 . ,. , ? . , . , , ,? . ,. 。 ,..,, . , ., . ,... ?. ., , ., ? , 尔人学尊十学何论文. .. ; : . ; ; ;; 尔人”.尊十。『.论文 符号说明 英文缩写 英文全名 中文全名 细胞凋亡配体 半胱氨酸蛋白酶 . ?氨基木端激酶 二氨基联苯胺 焦碳酸二乙酯 死亡受体 死亡受体 死亡诱骗受体 死亡诱骗受体死亡诱导信号复合体 溴化乙锭 细胞外基质 乙二胺四乙酸表皮生长因子受体细胞外信号调节激酶 .相关死亡域成纤维细胞增生性瘢痕 丙三醇细胞分裂素活化蛋白激酶 / 毫摩尔/升 醋酸钠 正钒酸钠 正常皮肤成纤维细胞 . 核转录因子. 尔人学博十学市论文 护骨素 程序性细胞死亡 重组人 核糖核酸酶 每分钟转数 ? 逆转录 十二烷基磺酸钠 四甲基乙二胺 ,,,’,,一三甲氧基苯甲醛 肿瘤坏死因子凋亡配体 嘶 三羧甲基氨基甲烷 尿激酶型溶酶原激活剂 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名:?矽络 日期:塑缉幽幽 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名: 日 碰: 导师签名:趁 期:超陋尔人‘彝十学何论文 第一部分 及在人难愈合创面肉芽组织和 增生性瘢痕中的表达及意义研究 上?‘ 刖 吾 增生性瘢痕是皮肤的病理性表现,主要表现为细胞外基质的异常沉积以及成 纤维细胞的增殖和凋亡异常,是机体创伤后一种修复异常的愈合过程。增生性瘢 痕在组织修复过程中广泛存在,对患者组织和器官的功能及外观均造成影响,严 重的甚至给病人的身心健康和工作生活带来极大危害。 增生性瘢痕的发病机制至今仍不明确,造成临床上预防和治疗的困难,因此 研究其发病机制和探寻良好的治疗方法成为烧伤、整形和美容医学界迫切解决的 问题。 增生性瘢痕是机体对损伤的异常愈合反应。皮肤损伤修复是一个复杂的生物 学过程,是环境与机体、细胞、因子以及基因之间相互作用的结果。目前对其研 究主要集中在成纤维细胞、血管内皮细胞、角质形成细胞、细胞外基质、细胞因 子和蛋白水解酶等方面,但是这种研究和认识存在一定的局限性。组织内与修复 有关的生长因子/凋亡因子种类繁多,不同的生长因子/凋亡因子之间存在着相互 促进、效能叠加或相互拮抗、效应抑制的作用。目前研究表明各种生长因子 /凋 亡因子效能的发挥必须与其相应靶细胞膜上的受体结合,通过特定的信号传导通 路。生长因子/凋亡因子与其受体结合后的信号转导通路众多,包括、 .、、.家族以及?氨基木端激酶 . , 通路等。增生性瘢痕作为皮肤创伤异常愈合的形式,涉及复杂的相互影响 的分子生物机制,不可能用某个单一基因的表达异常来解释其发病机制,但对一 个基因表达异常的评估是必要的。 信号转导通路在人各种组织器官中广泛存在,尤其是在病理性组织 中表达尤为突出。在肿瘤研究中成为当今研究热点,并在临床治疗中已达到临床 期研究。凋亡因子在增生性瘢痕中同样存在并发挥作用。但是,作为 在增生性瘢痕形成与生长过程中起到怎样的作用,作用大小等问题均都 有待研究。山尔人学博十学何论文 是家族成员,有种受体,其中与介导的凋亡有关的受 和 和 体有四种,包括两种死亡受体 。而第个受 两种诱骗受体 和 体虽与相关,但与其它四个受体相比, 与亲和力更弱。其中在增生性瘢痕凋亡过程中是起主要作用的受体。 【。因此本实验主要研究及其死亡受体的基因表达。 我们选择在难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕形成及生长各阶段中 信号转导通路中的活性及凋亡因子的表达情况,探讨该通路在难愈 合创面肉芽组织及增生性瘢痕中的表达情况,以及该通路在难愈合创面肉芽 组织 及增生性瘢痕中动态变化规律,比较其与正常皮肤来源和难愈合创面肉芽组 织及 增生性瘢痕各阶段的差异,以明确信号转导通路在难愈合创面肉芽组织 及增生性瘢痕发病机制中的重要作用,为探寻难愈合创面肉芽组织及增生性 瘢痕 的发病机制提供分子生物学基础和新的研究思路。 材料和方法 一、实验材料 一标本采集、处理及分组 收集山东大学附属省立医院烧伤整形美容外科手术切除的难愈合创面肉芽 组织及增生性瘢痕组织例以及正常皮肤例,年龄~岁,平均.?. 岁,其中女性例,男性例。其中,难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕病因 如下:火焰烧伤为例,热液烧伤为例,化学烧伤为例,外伤为例,其 它例。难愈合创面肉芽组织为上述原因导致?个月尚未愈合的创面,增生 性瘢痕位于面颈部例、躯干例,上肢例,下肢例,?个月内增生性 瘢痕例,半年至一年增生性瘢痕例,一年至三年增生性瘢痕例。临床 收集标本,每份标本分为两部分,分别用于病理免疫组化检测和转录、翻译水 平 等检测,组织保存于液氮。 实验分组情况,难愈合创面肉芽组织为组,半年内增生性瘢痕为组,半 .尔人学尊十。亨:节论文 年至一年增生性瘢痕为组,~年以上增生性瘢痕为组,对照组正常皮肤组为 组。 二主要仪器及耗材 .一超低温冰箱:日本公司产品。 . 型自动双重纯水蒸馏器:上海玻璃仪器一厂制造。 .处理的管、:用.%水浸泡小时,甩干 后高压分解残留. .微量移液器:、.、,、,法国公司产品。 .玻璃研磨器:干烤小时,存放备用不超过周。 ..型快速混匀器:江苏省新康仪器厂制造。 .高速低温离心机及配套转子:美国 公司产品。 . 水平电泳槽:北京六一实验仪器厂产品 .?多功能电泳仪:美国公司产品。 ..型多功能紫外投射反射分析仪:上海长明光学电子仪器厂制造。 ..型扩增仪:美国 公司产品。 ..型台式高速离心机:上海安亭科学仪器厂制造。 . 凝胶分析系统:美国公司产品。.电子天平, ; .电热恒温水浴箱,上海医用恒温设备厂; ..磁力搅拌器; .一快速混匀器; .微量移液器:、、和,法国公司产品; ..恒流/恒亚电泳仪,,仪器公司; .公司; .蛋白垂直电泳槽, .电转膜设备, .公司; .低温冰箱:; .扫描仪及软件,柯达公司; .液氮罐; .脱水机, ,德国; .石蜡切片机, ,德国; .封蜡机, ,德国; .漂烘处理仪,华利.,中国常州; .发热恒温水温箱中国北京;为:人学博十学何论文 三主要试剂及配制方法 . 实验材料 公司产品。 焦碳酸二乙酯 :美国 去水的配制:.%水溶液混匀后,放置过夜,然后高压 分解。 :.,用去水配制。 水饱和酚:酚/去水//,摇荡后静置分层,水相为., 存放备用。 氯仿:分析纯,上海试剂一厂产品。 异丙醇:分析纯,上海试剂一厂产品。 无水乙醇:分析纯,上海试剂一厂产品。公司产品。 /溴化乙锭 :瑞士 琼脂糖:电泳级,美国公司产品。 液体石蜡:化学纯,山东省化工研究院。 : 配方 碱 . ‘ . 冰乙酸 . 加蒸馏水至定容。 .%琼脂糖凝胶:每 加入.琼脂糖,加热熔化,冷却至 后加入/ ,混匀备用。 上样缓冲液:.%溴酚蓝,%甘油。 胶带纸 :公司。 ..实验材料 亚甲 %丙烯酰胺溶液:将丙烯酰胺上海生工生物工程公司, 双丙烯酰胺公司产品,溶于双蒸水,..滤膜过滤, 避光贮存于棕色瓶中,室温。 × :.,.%,. :. × ,.%,. ,,’’’一四甲基乙二胺,产品,。避光保存。 : ,%,%.巯基乙醇,%甘油,.% × 溴酚蓝 ×确.甘氨酸: ,甘氨酸,用双蒸水溶解至。 ×.甘氨酸,. 电泳缓冲液: %,加双蒸水至 。 . 实验材料 转膜液:.甘氨酸缓冲液,甲醇,加双蒸水至。 洗膜液:含.%.的。 尔人宁:博十学何论文 封闭液:%脱脂奶粉,用含.%一的配制。 底物缓冲液:./?.,二氨基联苯胺, .% , .,充分混匀,现用现配。 硝酸纤维素杂交膜:公司产品。 蛋白提取液 蛋白提取液配方 ? . 钒酸钠 % . % 丙三醇 ‘蛋白酶抑制剂 单克隆抗人抗体购自美国系统有限公司、酶标二抗辣根过氧 化物酶标记的羊抗鼠抗体购自北京中山金桥美国 。 .检测细胞因子试剂盒 变性液 . 逆转录酶/ 逆转录反应体系 聚合酶/ 反应体系 去水 二、实验方法以及步骤 一各组标本及免疫组化染色 .常规染色 取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,切片。 切片在二甲苯中脱蜡分钟。 经二次二甲苯脱蜡分钟。尔人。半:博十学位论文 %、%、%、%酒精,各级为分钟。最后经蒸馏水分钟。 苏木精染液染色分钟。 水洗玻片上多余染液,.~%盐酸酒精%酒精配制分色片刻。镜检 控制,直至细胞核及核内染色质清晰为止,约数秒钟。 流水冲洗分钟。 蒸馏水短洗。 .~.%伊红染液染色分钟,若着色困难,可在每毫升染液中加 入~滴冰醋酸,使易着色且不易脱色。 依次经%、%、%、%酒精脱水,各级为分钟,在%以 下浓度的酒精中伊红易脱色,应适当缩短时间。 二甲苯透明二次,共约分钟。 封片:擦去切片周围多余二甲苯,切勿干涸,迅速滴加适量中性树胶,再加 盖玻片封固。 . 免疫组织化学.法染色 微米的组织切片脱蜡、水化; %双氧水室温孵育一分钟; 蒸馏水洗次,每次洗分钟; 洗次各分钟; 正常血清:湿盒孵育分钟; 倾去血清将切片周围擦干; 滴加一抗,置湿盒中室温孵育分钟; .洗次各分钟; 滴加生物素标记的二抗工作液置湿盒孵育分钟; 洗次各分钟: 滴加链霉亲和素过氧化物酶复合物工作液室温孵育分钟; 洗次各分钟: 显色~分钟,在显微镜下掌握染色程度;尔人导:枣卜学市论文 流动自来水洗分钟; 苏木精复染分钟; 自来水洗,盐酸酒精分化: 自来水冲洗~分钟; 逐级酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。 二检测各组凋亡因子及其死亡受体表达 根据文献旺川,设计合成、及内参照?的引物各一对,序 列如下: ’一一’ 上游弓物: ’一一; 游弓物: 上游引物:’一.’, 下游引物:’..’;?’ 上游引物: 不 一’。 下游引物:’. 扩增的片段分别为、和。上述引物均由美国生物公 司合成。 、实验所用物品的去处理 所有玻璃器皿均应于使用前干烤小时以上。 塑料器皿需用.%水冲洗浸泡,放置小时,控干液体, 高压除去。 、组织及细胞总的提取 取难愈合创面肉芽组织及各阶段增生性瘢痕和正常皮肤组织标本各约 变性液,冰上研磨,匀浆 ,移入组织匀浆器中,加入 后吸取至管中,以后操作同。 变性液,轻轻催打 每只收集细胞沉淀的管中加入 至细胞裂解。,颠倒混匀;再加入水饱和酚, 每管加入. 轻轻混匀:最后加入氯仿,颠倒充分混匀,冰浴分钟。 】 离心分钟,吸取上清移至另一新. 管中, 加入等体积的异丙醇,.放置小时。 变性液,轻轻催打, 离心分钟,弃上清,加入 使沉淀溶解,加入等体积的异丙醇,.放置小时。 离心分钟,弃上清,用无水乙醇洗一遍,弃上清,自“尔人学博十。 论文 然晾干,溶于适量的无.的去离子水中,直接应用,亦可加入 无水乙醇于.保存备用。 、逆转录反应 于经处理过的. 管中加入下表所示试剂: 逆转录反应体系 用量 试剂名称 细胞总 . . 随机引物 去水 补至 小时, 分钟灭活?;快速离心使蒸汽沉于管 快速离心混匀; 底。 、聚合酶链反应 在上述 产物的. 管中继续加入下表所示试剂。 、 聚合酶链反应体系 快速离心混匀; 分钟,冰浴冷却,然后快速离心使蒸汽沉于管底。加 聚合酶,快速离心混匀,加入液体石蜡。 入/ 分钟;共个循环,最后 循环条件: 分钟; 分钟; 延长分钟。电泳鉴定。 尔人学博十?半:何论文 、定量分析 将凝胶电泳图像输入美国凝胶分析系统,应用进行表达强度分析,按下 计算相对系数。 相对系数细胞因子表达强度邝.表达强度 三 检测各组及的蛋白表达 、蛋白质的抽提 本试验应用蛋白提取液含蛋白酶抑制剂%抽提各个实验组织的总蛋白, 可以有效抑制蛋白降解。 步骤: 于冰上将人正常皮肤组织和难愈合创面肉芽组织及各阶段增生性瘢痕组 织剪切成细小的碎片,组织研磨冰浴。 取适当量的蛋白提取液。按照每毫克组织加入微升的比例加入 蛋白提取液。 对组织进行再研磨冰浴。 取出微升于.管中。 。 冰浴. /离心分钟,。。 取上清于. 管中,加等体积的蛋白上样液,煮熟约, 保存或上样。 、 检测 蛋白质.凝胶电泳方法 ?洗净玻璃板,装好电泳槽; ?确定凝胶体积,按下表配制%的分离胶,轻轻混匀,加至两层玻璃之间, 顶层用双蒸水隔绝空气; ?待分离胶聚合后,倒掉顶部的水,放好梳子,配制.%的浓缩胶见下表: 将浓缩胶加至分离胶的上面。待胶凝固后,轻轻拔掉梳子; ?将样品与等体积×上样混合,?煮沸,冰浴冷却; ?将电泳槽加入足量电泳缓冲液,用上样器轻轻将处理好的样品缓缓加入到 上 尔人。孚:博十。学何论文 样孔中,每孔加样品: ?电泳:开始电泳时电压为/,待溴酚兰进入分离胶后,将电 压增加至/,继续电泳至溴酚兰抵达分离胶底部; ?取下凝胶,固定、染色、观察结果。 .凝胶的配制 、 方法 ?上述.凝胶电泳完毕,小心取下凝胶,于转膜液中浸泡; ?剪与凝胶大小相同的块滤纸和一块硝酸纤维素膜,在转膜液中浸泡 ?转膜:在夹垫中依次放置滤纸、凝胶、膜、层滤纸,并去除气泡。将膜 朝向正极,胶朝向负极,置于转移槽中槽中注满转移液, 转移过 夜或 ; ?取出膜,置于%脱脂奶粉中,室温封闭; ?用含.%.的沈膜三次,每次. ?将膜置于平皿或小袋中,加入适当稀释的一抗单克隆抗人抗体, 浸没膜,室温振荡..; ?将膜取出,用含.%一的沈膜三次,每次. ?加入适当稀释的酶标二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体,浸没膜, 室温振荡..; ?用含.%.的洗膜三次,每次.力人。’尊十’:何论文 ?显色:将膜置于显色液中,直至显色效果满意为止,立即将膜置于双蒸水中 终止反应。 三、统计学分析: 全部实验数据均采用.医学统计学软件进行分析,各组样本的凋亡 水平均以均数?差?。多组均数比较进行一维方差分析 ,.作为差异显著性界值。两种因素相关性比较进行线性相关分 析,.具有统计学意义。 结 果 一、法观测各组样本病理学形态 组镜下可见表皮层次清楚,角化层角化明显,皮肤附属器丰富,包括汗腺、 皮脂腺、毛囊等结构。胶原纤维束排列规则,少而疏松、卷曲,细胞较少。图 . 组镜下可见大量由内皮细胞增生形成的实性细胞索及扩张的毛细血管, 向创面垂直生长;在毛细血管周围有许多新生的纤维母细胞,呈圆形,增生的 纤 维母细胞散在分布于毛细血管网络之间,很少有胶原纤维形成;多少不等的 炎性 细胞浸润于难愈合创面肉芽组织之中。图. 组镜下可见表皮覆盖创面,但鳞状上皮薄,基底层增生较活跃,表层上 皮细胞未见明显角化。许多纤维母细胞,呈扁圆形,有网状纤维及胶原纤维增多, 网状纤维有胶原化,皮下胶原较旺盛,粗大,排列紊乱;间质中炎性细胞少见; 可见少量毛细血管。图. 组镜下可见表面鳞状上皮基底层、棘层及角化层层次较清楚,可出现较 少角化现象。网状纤维及胶原纤维增多,网状纤维胶原化,皮下胶原纤维较前变 细,排列规则,部分呈玻璃样变性;纤维母细胞减少或消失,仅见少量纤维细胞, 呈细长;间质中炎性细胞消失;毛细血管闭合、退化、消失,可见稀少的小动脉 及小静脉。 图卜 尔人学博十学节论文 组镜下可见鳞状上皮层次清楚,出现角化,但仍比正常鳞状上皮薄,无 脚突,无皮肤附属器。皮下胶原细、少,排列更规则,呈玻璃样变性;仅见少量 纤维细胞,细长;间质中炎性细胞消失;仅见稀少的小动脉及小静脉。图. 二、免疫组化法检测认表达及分布 组可见纤维母细胞胞浆中均匀着色的棕黄色颗粒,细胞呈圆形,背景清晰 无非特异性着色。图. 组可见纤维母细胞胞浆中均匀着色的棕黄色颗粒,但较组减少,背景 清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色。 图? 组可见细胞阳性率明显下降,成熟的纤维细胞胞浆内未见棕黄色颗粒,蓝 色核染增多,背景清晰无非特异性着色。细胞减少,以细长为主,而瘢痕组织 中 大量胶原纤维无着色。 图. 组可见细胞阳性率偶见,成熟的纤维细胞胞浆内未见棕黄色颗粒,呈细 长,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色。 图? 组可见成纤维细胞基本无阳性表现,呈细长,背景清晰无非特异性着色。 组织中胶原纤维无着色。 图. 在组、组细胞浆中表达强阳性,组、组阳性表达逐渐减弱, 接近组;组和组明显强于组、组和组。 三、检测及的表达 表达水平在组和组表达呈较高水平,明显均高于其它各 组.,而组与组间差异无显著的统计学意义.,组、 组与组各组问比较,其差异均无显著的统计学意义。 .表, 图,。 表达水平在组中表达呈较高水平,明显高于组., 在增生性瘢痕各阶段组、组和组其表达水平明显低于组.。 、、组各组问比较,其差异均无显著的统计学意义.。、、 各组均低于组,其差异均有显著的统计学意义正.表,图。 在五组实验组中与线性相关分析,相关系数为., 【』尔人。丫:博十一::何论文 ..,说明与存在正相关。 图 四、 检测表达 在组和组中蛋白表达水平较高,在组、组、组蛋白表达 水平基本接近,经统计学处理,组和组蛋白表达水平明显高于其它各组 .图。 论 讨 增生性瘢痕是一种临床上常见的纤维结缔组织增生性疾病,一直是整形外科 研究的重点和难点,其发病机制至今不甚明了。其临床表现为瘢痕表面可呈红色、 潮红或紫色,局部可有疼痛、瘙痒、突出于皮肤表面的增生肿块,并伴有不同程 度的功能障碍,其发病机理尚不清楚。 增生性瘢痕是机体对损伤的异常愈合反应,以成纤维细胞的过度增生和细胞 外基质成分的过度聚集为主要特征,有扩张的毛细血管、炎症细胞浸润及成肌纤 维细胞。一般持续个月至~年或更久,充血减退,毛细血管减少,瘢痕渐趋 柔软,稍平坦,疼痛及瘙痒症状亦可减轻或消失。目前对大多数增生性瘢痕的研 究主要集中在成纤维细胞、细胞外基质、生长因子细胞因子和蛋白水解酶等 方面,研究调控创面愈合中的作用。随着现代细胞生物学和分子生物学在瘢痕领 域的深入研究,从而进一步认识了病理性瘢痕的生物学基础:即修复细胞主要是 成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制、细胞外基质中胶原合成与降解失衡、 的生物学行 部分细胞因子的大量产生及其三者之间的密切关系。病理性瘢痕 为是探索其发病机制的重点,信号传导通路激活和抑制在纤维化疾病中的意义已 引起关注。但是这种研究和认识存在一定的局限性。对增生性瘢痕组织为 与凋亡通路的研究较少,对在其发生与发展过程中的变化国内外尚未见报道。 细胞凋亡,又称为程序性细胞死 ,, 它普遍存在于生物的生理、病理过程中,有别于细胞坏死的程序性细胞死亡过程 【】,是近年来广泛研究的热点问题。其特点是细胞死亡过程中有细胞出泡、细 胞收缩、染色体凝集、核酸片段化,并形成凋亡小体。它不仅对胚胎发生、器官 发育、分化作用及保持机体的平衡稳定等过程至为重要,而且对控制细胞的增殖、 尔人学博十学何论文 肿瘤发生和发展极为重要。通过细胞凋亡,机体得以及时清除受损及危险的细胞, 因此细胞凋亡对机体的正常发展具有十分重要的生物学意义。 在细胞凋亡通路中,目前研究较多的是/通路。也称之为 配体 ,,是一种基因超家族成员。年】 具有较高同源性的 等从人心肌文库中克隆出与细胞凋亡配体 ,即。它是继 超家族成员,命名为 、/之 后发现的第三个超家族中的凋亡分子,其结构和功能均类似/。 与或具有较高同源性,二者均具有广谱诱导细胞凋亡 的作用:但仅局限表达于激活的细胞、细胞和免疫赦免区,而 广泛存在于许多组织中,其诱导细胞凋亡的调控主要是通过严格的受体表达 来实 现的【。细胞凋亡的发生主要通过两个通路。第一个通路是指胞外或胞质通 路, 是由死亡受体所激活。第二个通路是胞内或线粒体通路,即刺激导致细胞色 素从线粒体中释放和死亡信号的激活。它们最终都引起蛋白酶的级联 反应,从而导致细胞死亡?。 目前对的研究也多集中在肿瘤领域,而在皮肤瘢痕领域的研究较少 见。表达为一个型跨膜蛋白质,其受体结合域羧基端突出细胞外。 被金属酶从细胞膜上分离形成可溶性的三聚体生物活性形式,与第位的带二 价锌离子的半胱氨酸残基密切相关】 。/受体包含有个不同受 除了以外,其它四个四个 体分子,,,,,和。 受体基因紧密结合在人染色体上。和有一个胞质死亡区域, 能通过细胞膜传递凋亡诱导活性。其它三个受体则没有功能性的死亡区 域。因此它们也许是诱骗受体,可能与,竞争。虽与相关, 但与其它四个受体相比与亲和力更弱。 /能定向性地导致变异细胞的凋亡。/的凋亡作用 是唯一在临床应用的特效肿瘤细胞死亡配体。肿瘤坏死因子凋亡配体 是一种型膜结合的配体广泛分布于组织中,而且显示与细胞毒性因子配体 有很大的同源性。.酶原的激活是通过相关死亡域. ,募集而形成死亡受体复合物。一旦激活, 开始了凋亡前期信号级联反应。一个凋亡前期信号通路叫不依赖线粒体通路, 直 尔人。;:’尊’一孚:节论文 接激活死亡。另一个凋亡前期信号通路叫依赖线粒体通路,通过线粒体 产物来激活死亡,受,.家族成员激发。激活的.将通过 两个主要通道来激活如.和.的死亡因子。和激发 。和导致的中影响酶原和/或酶 原。在凋亡的胞外途径中,初始受体复活和随之而来的的激活都刺激了 。除了能导致凋亡以外,受体的激活可能也通过转录因子 .来激活生存信号】。当前重组蛋白和受体对抗抗体已 经在临床上应用。主要有重组人类和等来激活和 /或刺激凋亡胞外通路。这两种物质显示有明显的肿瘤退化和生长抑制作用 而没有明显毒性。在一期安全试验中已确定这些物质是适合更深入的临床研 究 】。受体成为清除肿瘤细胞有效武器,而不会伤害正常细胞。显示了 令人振奋的抗肿瘤活性和中等副作用。只是对治疗的抵抗常需要复合治 疗来提高药物的敏感性。,.家族成员,的抑制物,? 调质,和信号均可被激活【】。及其受体,也是对肿 瘤有凋亡诱导作用,而其受体,则没有凋亡诱导作用。损伤因素,如 化疗药物和放疗,能够调高的表达,但同时也增强诱骗受体 ,表达而抑制凋亡【?。和的基因突变可以产生抵 抗。早期研究显示和也许与肿瘤细胞的凋亡诱导相关,这是因为诱 骗受体在正常组织比肿瘤细胞高。在实验室设计中,诱骗受体过度表达可阻 止 敏感细胞产生诱导的凋亡。然而,随后的研究对此并没显示两者 有必然的联系【。这表明生理水平下诱骗受体可能不能有效抑制诱导 的凋亡。虽然如此,这些诱骗受体可能在生理或病理条件下引起对的抵 抗【】。 通过死亡诱导信号复合体传导凋亡信号。这个复合体的形成 会导致蛋白酶的级联反应激活,最终导致细胞的死亡。死亡受体引导的 外在及内在通路是受.家族的相互作用来决定细胞的生死。而是否产生凋亡 信号是受.、/和信号通路【。通过与死亡受 体结合介导体内异常组织细胞凋亡,而不引起正常组织细胞的凋亡,与 其受体表达水平的差别,是对异常组织细胞杀伤力不同的一个重要因素,尔人’?尊十。:乏何论文 并可反映组织细胞对及其受体诱导凋亡的敏感性。在增生性瘢痕中, 基因中死亡受体的表达下调,诱导受体的表达上调,有抵抗 诱导凋亡的特性】。有研究表明在对有成纤维细胞生长的关节液和滑膜 的类风湿性关节炎患者中诱导.的表达是积极的【。而且通过 的失活对抑制角质形成细胞的凋亡有明显作用【】。 难愈合创面肉芽组织通常是以瘢痕愈合为最终结果,大部分形成病理性瘢 痕,多以增生性瘢痕表现,或需要手术来消灭创面。病理状态下所耿难愈合创 面肉芽组织大都为烧伤长期不愈创面及溃疡、褥疮等难愈创面,不易自我修复, 增殖异常,凋亡增多,组织凋亡显著增加,创面难愈使创面修复易导致瘢痕 增生。因此研究信号传导通路在难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕 各阶段的表现对于研究瘢痕形成的基本机制及研究创面修复、如何减轻瘢痕和抑 制瘢痕增生很有必要,为临床和科研研究提供理想的切入点。 根据我们的实验结果,结合既往的增生性瘢痕有关发病机制的研究,我们推 测机体发生创伤后,受界的某些理化刺激和各种细胞因子的影响,可以导致 凋亡信号转导通路的活化,尤其是的激活,在难愈合创面肉芽组织 中表达增强,使细胞凋亡明显增强,使参与组织修复能力显著受抑,组织难以愈 合。而在增生性瘢痕各阶段中,半年内的表达依然较强,但的表达 却甚至低于正常皮肤组织,这表明在增生性瘢痕各阶段里细胞凋亡水平降低,而 抑制细胞凋亡水平却增强,使得组织仍以增生为主。半年后增生性瘢痕 的表达趋于正常皮肤组织,的表达仍然处于较低水平,表明增生性瘢痕在 后期增生减弱,抗凋亡水平降低,但凋亡水平仍然较低。对增生性瘢痕后期临床 上表现为瘢痕增生,但不始趋于萎缩的特点提供了有力的论据。如何能提高增生 性瘢痕中凋亡死亡受体的表达可能为是目前预防与治疗纤维性增生类疾病 提供一个新的渠道,有望成为治疗增生性瘢痕的有潜力的途径。 小 结 .在难愈合创面肉芽组织组织和死亡受体凋亡水平明显增高, 表明难愈合创面肉芽组织中细胞凋亡增强,抗凋亡水平受到抑制,组织难以愈合。尔人。学博十学何论文 .在增生性瘢痕早期半年内中,的表达仍然较高,但其死亡受 体的凋亡水平明显低于正常,表明在增生性瘢痕早期瘢痕组织凋亡作用降 低,而抗凋亡作用明显增强,瘢痕组织表现明显增生作用。 .在增生性瘢痕后期半年.年,及其死亡受体均处于较低 水平,表明在增生性瘢痕后期细胞凋亡水平较低,抗凋亡水平较高,仍有组织增 生。 .在增生性瘢痕成熟期年后,表达水平接近正常皮肤。瘢痕 组织凋亡作用增强,增生减弱,变得平坦和消退。 .与存在正相关。表明与其受体表达水平的变化 趋势是同向的,在一定程度上反映了组织细胞对诱导凋亡的敏感性。尔人学 博十‘孚何论文 第二部分 . 在人难愈合创面肉芽组织、 增生性瘢痕中的表达及意义研究 .吐刍 刖 吾 .信号转导通路贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程。. 存 在于几乎所有类型的组织和细胞,是一类关键性的核转录因子,是由 /.家族的多肽成员所形成的一组二聚体形式的转录因子的统称,因 能与细胞免疫球蛋白轻链基因的增强子序列的点位特异结合而得名【】。 于年第一次被确认【.它包含有?,果蝇蛋白和以及个 哺乳动物类一成员,分别为.及其前体、及其 前体、、和.。它们均属家族成员,共同含有一个 高度保守的同源序列。除.以外,其他的.成员均可以形成同源二 聚体或异源二聚体,以/异源二聚体最先确认并最常见。 .是一种具有多向性调节作用的转录因子,活化后通过调节许多细胞因 子、趋化因子、生长因子、粘附分子及多种酶的基因表达,对细胞内许多基 因的 表达起着关键性的调控作用,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能, 并在 细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用【。越来越多的研究表明许多疾病 的 发生和发展都与.的过度活化有关。而.中表达将阻止凋亡并提 高治疗细胞中的. 的活性。许多抗肿瘤药物因能使.活化而 使得许多肿瘤细胞产生药物抗性】。 在瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞中存在着.的活化, .有着高度表 达’,尿激酶型溶酶原激活齐持续减少,使瘢痕疙瘩成纤维细胞出现纤 维蛋白溶解能力、纤维凝块降解能力的降低,。. 通路激活对肿瘤发生 发展的促进作用,特别是亚基可反式激活很多基因,调节细胞的生长、 凋亡、血管形成和侵袭转移】。是肿瘤的浸润和转移的关键蛋白酶, 乃:人孚:博十学何论文 启动子中蕴含..结合位点,可以被直接介导的生成。它通过持续 的活化而在胰腺癌细胞中过度表达【】。 能在各种癌细胞中诱导凋亡活性。. 是抑制凋亡的中介者,它 的激活通过抑制细胞因子.活性启动来提高抗凋亡细胞和组织的阈值。 因此,诱导. 活性能通过激活产生抗凋亡基因的启动来抑制 诱导的凋亡】。 受体的激活除了能导致凋亡以外,可能也通过转录因子. 来激活生存信号‘。抑制的表达可以使抵抗肿瘤细胞重 新获得对凋亡的敏感性。的表达将阻止凋亡并提高治疗细胞 中的. 的活性。诱导. 活性。但同时在敲除后对. 表现消除活性,因此能抑制对强凋亡活性的作用抗凋亡蛋白的诱导 ,。 材料和方法 一、实验材料 一标本采集、处理及分组 同第一部分 主要仪器及耗材 .一超低温冰箱:日本公司产品。 . 型自动双重纯水蒸馏器:上海玻璃仪器一厂制造。 .处理的管、:用.%水浸泡小时,甩干 后高压分解残留. .微量移液器:、、.、,法国公司产品。 .玻璃研磨器:干烤小时,存放备用不超过周。 ..型快速混匀器:江苏省新康仪器厂制造。 公司产品。 .高速低温离心机及配套转子:美国 .水平电泳槽:北京六一实验仪器厂产品 ..多功能电泳仪:美国公司产品。 尔人’学尊十学何沦文 ..型多功能紫外投射反射分析仪:上海长明光学电子仪器厂制造。 ..型扩增仪:美国 公司产品。 ..型台式高速离心机:上海安亭科学仪器厂制造。 . 凝胶分析系统:美国公司产品。.电子天平, ; .电热恒温水浴箱,上海医用恒温设备厂: .磁力搅拌器; ..快速混匀器; .微量移液器:、、和,法国公司产品; ..恒流/恒亚电泳仪,,仪器公司; .蛋白垂直电泳槽, .公司; .电转膜设备, .公司; .低温冰箱:; .扫描仪及软件,柯达公司; .液氮罐 .脱水机, ,德国; .石蜡切片机, ,德国; .封蜡机, ,德国; .漂烘处理仪,华利.,中国常州; .发热恒温水温箱中国北京; 三主要试剂及配制方法 . 实验材料 公司产品。 .美国 焦碳酸二酯 去水的配制:.%水溶液混匀后,放置过夜,然后高压 分解。 ...,用去水配制。 水饱和酚:酚/去水//,摇荡后静置分层,水相为., 存放备用。 氯仿:分析纯,上海试剂一厂产品。尔人。:毒博十学何论文 异丙醇:分析纯,上海试剂一厂产品。 无水乙醇:分析纯,上海试剂一厂产品。 公司产品。 :瑞士 /溴化乙锭 琼脂糖:电泳级,美国公司产品。 液体石蜡:化学纯,山东省化工研究院。 : 配方 碱 .. . 冰乙酸 加蒸馏水至定容。 .%琼脂糖凝胶:每 加入.琼脂糖,加热熔化,冷却至 ,混匀备用。 后加入/ 上样缓冲液:.%溴酚蓝,%甘油。 胶带纸 :公司。 .?实验材料 %丙烯酰胺溶液:将丙烯酰胺上海生工生物工程公司, ,’一亚甲 双丙烯酰胺公司产品,溶于双蒸水,.卜滤膜过滤, 避光贮存于棕色瓶中,室温。 :. × ,.%,. . × ,.%,. ,,’,’.四甲基胺,产品,。避光保存。 : ,%,%一巯基乙醇,%甘油,.% × 溴酚蓝 ×一甘氨酸:,甘氨酸,用双蒸水溶解至。 。 电泳缓冲液: ×.甘氨酸,. %,加双蒸水至 . 实验材料 转膜液:.甘氨酸缓冲液,甲醇,加双蒸水至。 洗膜液:含.%.的。 尔人。、鼻十学何论文 封闭液:%脱脂奶粉,用含.%.的配制。 底物缓冲液:./.,二氨基联苯胺, .% , ,充分混匀,现用现配。 硝酸纤维素杂交膜:公司产品。 蛋白提取液 蛋白提取液配方 ? . 钒酸钠 % . % 丙三醇蛋白酶抑制剂 , 兔单克隆抗体购自美国 技术公司、酶标二抗辣根过 氧化物酶标记的羊抗兔抗体购自北京中山金桥美国 。 .检测细胞因子试剂盒 变性液 . 逆转录酶/ 逆转录反应体系 外 聚合酶/ 反应体系 去水 二、实验方法以及步骤 一、免疫组化染色 .常规染色 取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,肛切片。尔人。字:博十。 :何论文 切片在二甲苯中脱蜡分钟。 经二次二甲苯脱蜡分钟。 %、%、%、%酒精,各级为分钟。最后经蒸馏水分钟。 苏木精染液染色分钟。 水洗玻片上多余染液,.%盐酸酒精%酒精配制分色片刻。镜检 控制,直至细胞核及核内染色质清晰为止,约数秒钟。 流水冲洗分钟。 蒸馏水短洗。 ..%伊红染液染色分钟,若着色困难,可在每毫升染液中加 入滴冰醋酸,使易着色且不易脱色。 依次经%、%、%、%酒精脱水,各级为~分钟,在%以 下浓度的酒精中伊红易脱色,应适当缩短时间。 二甲苯透明次,共约分钟。 封片:擦去切片周围多余二甲苯,切勿干涸,迅速滴加适量中性树胶,再加 盖玻片封固。 . 免疫组织化学染色.法 微米的组织切片脱蜡、水化; %双氧水室温孵育.分钟; 蒸馏水洗次,每次洗分钟; 洗次各分钟; 正常血清:湿盒孵育分钟; 倾去血清将切片周围擦干; 滴加一抗,置湿盒中室温孵育分钟; 洗次各分钟; 滴加生物素标记的二抗工作液黄湿盒孵育分钟; 洗次各分钟; 滴加链霉亲和素过氧化物酶复合物工作液室温孵育分钟; 洗次各分钟;乃人学博十。半:节论文 显色~分钟,在显微镜下掌握染色程度: 流动自来水洗分钟; 苏木精复染分钟; 自来水洗,盐酸酒精分化; 自来水冲洗一分钟; 逐级酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。 二检测 表达 根据文献【”,设计合成. 及内参照.的引物各一对,序列如下: ? ’..’ 上游弓物: ’..; 下游引物: .’ 上游引物: 。’。 .下游引物: 扩增的片段分别为和。上述引物均由美国生物公司合成。 、实验所用物品的去处理 所有玻璃器皿均应于使用前干烤小时以上。 塑料器皿需用.%水冲洗浸泡,放置小时,控干液体, 高压除去。 、组织及细胞总的提取 取难愈合创面肉芽组织及各阶段增生性瘢痕和正常皮肤组织标本各约 变性液,冰上研磨,匀浆 ,移入组织匀浆器中,加入 后吸取至管中,以后操作同~。 变性液,轻轻催打 每只收集细胞沉淀的管中加入 至细胞裂解。,颠倒混匀;再加入水饱和酚, 每管加入. 轻轻混匀;最后加入氯仿,颠倒充分混匀,冰浴分钟。 离心分钟,吸取上清移至另一新. 管中, 加入等体积的异丙醇,.放置小时。 尔人’’尊十学何论文 变性液,轻轻催打, 离心分钟,弃上清,加入 使沉淀溶解,加入等体积的异丙醇,.放置小时。 离心分钟,弃上清,用无水乙醇洗一遍,弃上清,自 然晾干,溶于适量的无的去离子水中,直接应用,亦可加入 无水乙醇于.保存备用。 、逆转录反应 于经处理过的. 管中加入下表所示试剂: 逆转录玎反应体系 试剂名称 用量 细胞总 . 盯 . 随机引物 去水 补至 快速离心混匀; 小时, 分钟灭活.;快速离心使蒸汽沉于管 底。 、聚合酶链反应 在上述 玎产物的. 管中继续加入下表所示试剂。 聚合酶链反应体系 试剂名称 腱一姒 枷 ? × 川 上游引物 洲 下游引物 超纯水 ? 快速离心混匀; 分钟,冰浴冷却,然后快速离心使蒸汽沉于管底。加