小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径（可编辑）

小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径（可编辑） 小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径 博士学 位 论文目 小脑顶核 调节免 疫系统 功能的 中枢和外 周途径 曹蓓蓓研究生姓名指 导 教 师 姓 名 彭聿平专 业 名 称 人体解剖 与组织 胚胎学 神经免疫 调节研 究 方 向论 文 提 交 日 期 2013 年 3 月 基金资助 :国家自然科学基金面 上项目:30870819江苏省自然科学基金项目:BK2010278南通市应用研究项目:K2009047 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 中文 摘要 小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径 中文摘要 目 的: 我们实验室以前的研究表明小脑顶核可参与调节淋巴 细胞功能。 由于小脑与免疫 系统之间没有直接的结构上的联系, 因此探讨小脑调节免疫功能的途径和机制对于更 好地理解小脑的免疫调节功能具有重要的意义。 下丘脑是中枢神经系统中重要的免疫 调节中枢。 为此, 本研究一方面进一步揭示小脑顶核至下丘脑的神经投射 路径及性质; 另一方面,在上述研究的基础上分别研究 小脑顶核至下丘脑 γ- 氨基丁酸( γ -aminobutyric acid, GABA ) 能和谷氨酸能神经投射对淋巴细胞功能的影响, 以探讨小 脑顶核调节免疫功能的中枢和外周途径, 进一步拓宽和加深对小脑神经免疫调节的认 识和理解。 方 法: 1. 单 侧 小 脑 顶 核 内 微 量 注 射 葡 聚 糖- 德 克 萨 斯 红 (Texas red dextran amine, TRDA ) , 顺 行 追 踪 顶 核 至 下 丘 脑 的 神 经 投 射 路 径 及 终 止 部 位 。 单 侧 下 丘 脑 外 侧 区 (lateral hypothalamic area, LHA ) 内微量注射 逆行追踪剂红色荧光金 (Fluoro-Ruby, FR ) , 结 合 GABA 和谷氨酸免疫荧光组织化学 染色, 进一步确定顶核至下丘脑投射的 性质。 2. 双侧小脑顶核 内 微量注 射 GABA 降解 酶 ?GABA 转 氨酶的 抑制剂 氨已烯酸 ( vigabatrin, VGB )或 GABA 合 成 酶 ? 谷氨 酸 脱 羧 酶 的 抑 制 剂 3- 巯基丙酸 (3-mercaptopropionic acid, 3-MP ) ,并以未作任何处理的空白大鼠和双侧小脑顶核注 射 等 量 生 理 盐 水 的 大 鼠 作 为 对 照 。 注 射 后 第 3 天,用 羧 基 荧 光 素 琥 珀 酰 亚 胺 酯 (carboxyl fluorescein succinimidyl ester, CFSE ) 和抗 CD3 抗体流式双标技术检 测 T 淋巴细胞对刀豆蛋白 A (concanavalin A, Con A )刺激的增殖反应;用酶联免疫吸附 法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ) 检测血清中抗绵羊红细胞 (sheep red blood cells, SRBC )特异性 IgM 抗体水平;动物于第 6 天加强注射药物,3 天后用 CAM/EH-1 流式双标技术检测脾脏自然杀伤 (natural killer, NK ) 细胞杀伤肿瘤靶细胞 I. 中文 摘要 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 YAC-1 的活性。在检测淋巴细胞功能的同时, 用 FR 逆行追踪结合 GABA 免疫组化 染色检测顶核至 LHA 投射中 GABA 能神经元 数目的变化 , 并用高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC )检测下丘脑中 GABA 的含量变化。 3. 大鼠用小牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA ) 进行免疫。免疫后第 3 天,双侧小脑顶核 内 微量注射谷氨酸合成酶 ? 谷氨酰胺酶的抑制剂 6- 重氮-5- 氧代-L- 正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON ) ,同时双侧 LHA 或丘脑腹外侧核 (ventrolateral thalamic nuclei, VL )内 微量注射 谷氨酸膜转运体抑制剂苏式-3- 羟基天 冬氨酸(D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA ) 。动物饲养 3 天,用抗 CD3 ,CD4 , CD8,CD45RA 和 NKR-P1A 抗体标记流式检 测外周血中 T 细胞及其亚群,B 细胞和 NK 细胞的百分比变化; 用 CD3/CD25 和 CD3/CFSE 流式双标技术分别检测肠系膜淋 巴结 T 细胞对 Con A 刺激的活化和增殖能力; 用 real-time PCR 法检测淋巴结 T 细胞 中细胞因子 IL-2 ,IFN- γ,IL-4,IL-5,IL-10 ,TGF-β ,IL-22 ,IL-17 mRNA 的表达 及用 ELISA 法检测细胞培养上清中细胞因子 IL-2 , IFN- γ , IL-4 , IL-10, TGF-β , IL-22 , IL-17 的水平 。 此外, 大鼠 B 细胞抗 BSA IgM 和 IgG 抗体生成能力及脾脏 NK 细胞的 杀伤活性也分别用 ELISA 法及流式细胞术进行检测。在检测上述淋巴细胞功能的同 时,同样用 FR 逆行追踪结合谷氨酸免疫组化染色检测顶核至 LHA 投射中谷氨酸能 神经元数目的变化,以及用 HPLC 法检测下丘 脑及丘脑组织中谷氨酸含量的变化。 4. 注射 DON 及 THA 后第 3 天 ,用 ELISA 法 检测 血清中促肾上腺皮质激素 (adrenocorticotropic hormone, ACTH), 皮质醇(cortisol ) , 促 甲 状 腺 激 素 (thyroid stimulating hormone, TSH), 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸 (triiodothyronine, T3 )及甲状腺素 (thyroxin, T4 ) 的水平,用 HPLC 法进行检测 外周免疫器官 脾脏及淋巴结中去甲肾上 腺素(norepinephrine, NE )的含量 变化。 结 果: 1. 顶核神经元发出的 TRDA 阳性纤维,在小 脑上脚中走行,至小脑上脚交叉处 交叉至对侧,并进入下丘脑,主要终止于 LHA 。在 LHA 注射逆行追踪剂 FR ,标记 的阳性纤维逆行穿行于小脑上脚交叉, 并可到达小脑顶核。 结合免疫荧光组织化学染 色发现顶核投射到 LHA 的神经元既有 GABA 能又有谷氨酸能。 2. 双侧顶核注射 VGB 导致肠系膜淋巴结 T 细 胞对 Con A 诱导的增殖反应, 血清 II. 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 中文 摘要 中抗 SRBC IgM 抗体水平及脾脏 NK 细胞杀伤 肿瘤 YAC-1 靶细胞的杀伤活性均低于 空白组及顶核注射生理盐水的对照组。而双侧顶核注射 3-MP ,可导致相反的变化。 与此同时,顶核注射 VGB 可显著增加顶核 至 LHA 投射 中 GABA 能 神经元的数目和 下丘脑中 GABA 的含量, 而顶核注射 3-MP , 顶核至 LHA 投射中 GABA 能神经元的 数目和下丘脑中 GABA 的含量均降低。 3. 双侧顶核注射 DON 后, 外周血中 CD3+T 细胞,CD3+CD4+T 细胞数 目及 CD4/CD8 比值均低于空白组和顶核注射生理盐 水的对照组,而 CD3+CD8+T 细胞数 目没有显著变化;肠系膜淋巴结 T 细胞的活化和增殖能力降低;淋巴结 T 细胞 致 炎 细胞因子 IL-2 ,IFN- γ ,IL-17,IL-22 的 mRNA 表达及在细胞培养上清中的含量均 显著低于空白组和生理盐水对照组,而 抗炎细 胞因子 IL-4 ,IL-10,IL-5 ,TGF-β 的 mRNA 表达和培养上清中 IL-4 ,IL-10,TGF-β 的含量没有显著变化。另外,外周血 中 B 细胞数 目 及血清中 抗 BSA IgM 和 IgG 水 平也明显 下降 。外周血 中 NK 细胞数目 及脾脏 NK 细胞 杀伤活性也明显降低。与此同时,顶核注射 DON 后,顶核至 LHA 投射中谷氨酸能神经元的数量及下丘脑中谷氨酸的含量也降低。 顶核注射 DON 联合 LHA 注射 THA 可使上述外周血中 CD3+ 及 CD3+CD4+T 细胞数目和 CD4/CD8 比值, 淋巴结 T 细胞的活化和增殖, 致 炎细胞因子的 mRNA 表达和细胞培养上清中的含量 都显著高于单独顶核注射 DON 组。此外,外 周血中 B 细胞数 目及血清中抗 BSA 抗 体水平, 外周血中 NK 细胞数目及脾脏 NK 细胞 杀伤活性也均高于单纯顶核注射 DON 组。同时下丘脑中 谷氨酸的含量也比单纯顶核注射 DON 组有所升高。顶核至 VL 也 有直接的谷氨酸能神经投射, 而顶核注射 DON 的同时 VL 注射 THA , 虽然丘脑中谷 氨酸的含量较单纯顶核注射 DON 有所升高 , 但上述 T ,B ,NK 细胞的数目 和功能降 低没有显著改变。 4. 双侧顶核注射 DON 可导致脾脏和淋巴结中 NE 含量高于空白组和生理盐水对 照组, 联合 LHA 注射 THA 后脾脏和淋巴结中 NE 含量较单纯注射 DON 组有所降低。 动物注射 DON 及 THA , 血 清 中 ACTH , 皮 质 醇 ,TSH ,T3 及 T4 的 水 平 没 有 显 著 变 化 。 结 论: 1. 小脑顶核发出直接的神经纤维 投射至下丘脑 ,主要终止于 LHA ;这些神经投 射中有 GABA 能和谷氨酸能纤维。 2. 小脑顶核的 GABA 能神经元调节 T 、B 和 NK 细胞的功能,此调节作用由顶 III. 中文 摘要 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 核至下丘脑的 GABA 能神经投射所介导。 3. 小脑顶核的谷氨酸能神经元调节 T 、B 和 NK 细胞的数目和功能, 这种调节作 用由顶核投射至下丘脑而不是投射至丘脑的谷氨酸能神经所介导。 4. 交感 神经 而非 肾上 腺 皮质 和甲 状腺 激素 途径介 导 小脑 顶核 ? 下 丘脑 谷 氨酸 能 神经投射的免疫调节作用。 5. 综合上述结果, 提示 顶核 GABA 能/ 谷氨酸 能神经元?下丘脑?交感 神经?淋 巴细胞 途径 参与介导了 小脑顶核对免疫 系统功能的调节 。 关键 词: 小脑; 顶核; 小脑 ? 下丘脑投射;GABA ; 谷氨酸; 淋巴细胞; 去甲肾 上腺素;神经免疫调节 作 者 :曹蓓蓓指导老师: 彭聿平 教授 IV. 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 英 文 摘要 Central and Peripheral Pathways MediatingModulation of Immune System Function By Cerebellar Fastigial NucleiAbstract Objectives:Our previous work has shown that the cerebellar fastigial nucleus FN participates in the modulation of lymphocyte functions. Since there are no direct connections in structure between the cerebellum and the immune system, it appears especially important to explore the potential pathways and mechanisms underlying the cerebellar immunomodulation. The hypothalamus is an important immunoregulatory center in the central nervous systemHerein, we on the one hand further revealed the pathways and properties of the FN projections to the hypothalamus and on the other hand investigated the effects of FN γ-aminobutyric acid GABA-ergic and glutamatergic projections to the hypothalamus on lymphocyte functions so as to explore the central and peripheral pathways involved in the cerebellar FN immunomodulation and obtain more comprehension and knowledge on cerebellar functionsMethods: 1. Texas red dextran amine TRDA, an anterograde tracer, was injected into unilateral cerebellar FN to trace the traveling courses and ending locations of the neuronal projections from the cerebellar FN to the hypothalamus. Further, retrograde tracing by injection of Fluoro-Ruby FR into unilateral lateral hypothalamic area LHA combined with GABA or glutamate fluorescence immunohistochemistry were performed to identify the properties of FN neurons projecting to the hypothalamus2. Vigabatrin VGB, an inhibitor of GABA-transaminase GABA-T that degrades GABA, or 3-mercaptopropionic acid 3-MP, an antagonist of glutamic acid decarboxylaseV. 英 文 摘要 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 GAD that synthesizes GABA, was microinjected into bilateral cerebellar FN. Rats with intact or saline-infused FN were used as controls. On the third day after the injections, carboxyl fluorescein succinimidyl ester CFSE and anti-CD3 antibody double-labeling flow cytometry was used to detect concanavalin A Con A-induced T lymphocyte proliferation. Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA )was employed to measure anti-sheep red blood cell SRBC IgM antibody level in the serum. On day three following the second injection of VGB or 3-MP, NK cell cytotoxicity to YAC-1 target cells was evaluated by means of CAM/EH-1 double-labeling flow cytometry. Simultaneously, the number of GABA-immunoreactive neurons in FN-LHA projections and GABA content in the hypothalamus were measured by FR retrograde tracing combined with GABA fluorescence immunohistochemistry and high performance liquid chromatography HPLC, respectively3. Rats were immunized with bovine serum albumin BSA. On the third day after the immunization, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine DON, an inhibitor of glutaminase for glutamate synthesis, was microinjected in bilateral FN and D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid THA, an inhibitor of glutamate transporters on plasma membrane, was microinjected in both sides of LHA or ventrolateral thalamic nuclei VL. On day three after the injections, flow cytometric assay with anti-CD3, CD4, CD8, CD45RA and NKR-P1A antibody labeling was employed to examine the percentage of T lymphocytes and its subsets, B lymphocytes and NK cells in the peripheral blood. CD3/CD25 and CD3/CFSE double-labeling flow cytometry were used to detect Con A-induced T lymphocyte activation and proliferation, respectively. Real-time PCR was used to measure mRNA expressions of IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-10, TGF-β, IL-22 and IL-17 in T lymphocytes of the mesenteric lymph nodes and ELISA was used to detect the concentration of IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, TGF-β, IL-22 and IL-17 in the cell culture supernatant. In addition, levels of anti-BSA IgM and IgG antibodies in the serum and splenic NK cell cytotoxicity were measured by ELISA and flow cytometry, respectivelySimilarily, when the lymphocyte functions were assayed, the number ofVI. 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 英 文 摘要 glutamate-immunoreactive neurons in FN?LHA projections and glutamate content in the hypothalamus and thalamus were measured by FR retrograde tracing combined with glutamate fluorescence immunohistochemistry and HPLC, respectively 4. On the third day after treatment with DON and THA, the levels of adrenocorticotropic hormone ACTH, cortisol, thyroid stimulating hormone TSH, triiodothyronine T3 and thyroxin T4 in the serum and norepinephrine NE content in the spleen and lymph nodes were detected by ELISA and HPLC, respectivelyResults:1. TRDA-labeled fibers from the FN traveled through the superior cerebellar peduncle SCP, crossed in decussation of SCP XSCP, entered the hypothalamus, and primarily terminated in the LHA. By injecting FR in the LHA, the FR-stained fibers retrogradely passed through the XSCP and reached the FN. Combined with fluorescence immunohistochemistry, we observed that among these FR-positive neurons in the FN, there were GABA and glutamate immunoreactive cells2. After VGB injection into the bilateral FN, the Con A-induced T lymphocyte proliferation, the level of anti-SRBC IgM antibody in the serum and the NK cell cytotoxicity to YAC-1 cells were all decreased in comparison with control rats with intact or saline-infused FN. However, 3-MP injection in the bilateral FN resulted in the contrary changes. Meanwhile, VGB treatment notably raised but 3-MP remarkably reduced the number of GABAergic neurons in the FN-LHA projections and GABA content in the hypothalamus3. After DON injection into bilateral FN, the number of CD3+ and CD3+CD4+ T lymphocytes as well as CD4/CD8 ratio in the peripheral blood were all less than those of the intact and saline-treated control rats, but the number of CD3+CD8+ T lymphocytes had no significant change. The Con A-induced T lymphocyte activation and proliferation decreased following DON treatment in comparison with the two control rats. The mRNA expressions of proinflammatory cytokines of IL-2, IFN-γ, IL-17, IL-22 in T lymphocytes and their concentration in the cell culture supernatant were all significantly reducedVII. 英 文 摘要 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 following DON treatment when compared with the intact and saline-infused rats, while the mRNA expressions of IL-4, IL-10, IL-5, TGF-β and concentration of IL-4, IL-10, TGF-β in the cell culture supernatant had no remarkable change. In addition, DON treatment in the FN notably attenuated B lymphocyte number in the peripheral blood and anti-BSA IgM and IgG levels in the serum. Injection of DON in the bilateral FN also diminished the number of NK cells in the peripheral blood and NK cell cytotoxicity in the spleenSimultaneously, the number of glutamatergic neurons in the FN-LHA projections and glutamate content in the hypothalamus were also reduced after DON treatment in the FNCombined treatment with DON in the FN and with THA in the LHA resulted in the enhancement in the number of CD3+, CD3+CD4+ T lymphocytes and CD4/CD8 ratio in the peripheral blood, T lymphocyte activation and proliferation, and mRNA expressions and concentration in the supernatant of proinflammatory cytokines when compared with DON injection alone. In addition, B lymphocyte number in peripheral blood and levels of anti-BSA antibodies in the serum as well as the NK cell number in peripheral blood and NK cytotoxicity in the spleen were also raised relative to DON treatment alone. Combined treatment with DON and THA increased glutamate content in the hypothalamus in comparison with DON injection alone. There were direct glutamatergic projections from the FN to the VL. However, co-treatment with DON in the FN and with THA in the VL did not significantly alter DON-dependent changes in the number and functions of T, B and NK cells, although the co-treatment altered DON-dependent glutamate content in the thalamus 4. DON injection into bilateral FN increased NE content in the spleen and lymph nodes relative to the intact and saline-treated rats, co-treatment with DON in the FN and THA in the LHA reduced the NE content compared with DON treatment alone. After injection with DON and THA, the levels of ACTH, cortisol, TSH, T3 and T4 in the serum did not significantly alterVIII. 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 英 文 摘要 Conclusions:1. There are direct GABAergic and glutamatergic projections from the cerebellar FN to the LHA2. The cerebellar FN GABAergic neurons regulate the functions of T, B and NK cells, this effect is mediated by the GABAergic neuronal projections from the cerebellar FN to the hypothalamus 3. The cerebellar FN glutamatergic neurons modulate the number and functions of T, B and NK cells, this effect is mediated by the FN glutamatergic projections to the hypothalamus, but not the thalamus 4. The sympathetic nerve but not the adrenal cortical hormone or thyroid hormone pathways mediate the immunomodulatory effect of the cerebellar FN glutamatergic projections to the hypothalamus 5. In conclusion, the central and peripheral pathways involved in mediating the cerebellar FN immunomodulation may be the FN GABAergic and glutamatergic neurons?hypothalamus?sympathetic nerves?lymphocytes Keywords: cerebellum, fastigial nucleus, cerebellohypothalamic projection, GABA, glutamate, lymphocyte, norepinephrine, neuroimmunomodulation Writtenby: Bei-Bei Cao Supervised by: Professor Yu-Ping Peng IX 目 录 前 言. 1 与4 1 材 料4 2 方 法9 结 果23 1 小脑顶核至下丘脑的神经投射路径及终止部位. 23 2 小脑顶核至下丘脑具有 GABA 能和谷氨酸能 神经投射 24 3 小脑顶核至下丘脑的 GABA 能神经投射介导 小脑的免疫调节. 26 4 小脑顶核至下丘脑的谷氨酸能神经投射介导小脑的免疫调节34 讨 论60 结 论66 参考文献. 67 综 述76 参考文献 91 英文缩写词表 104 攻读学位期间公开发表的论文 106 博士生期间承担科研项目情况 107 致 谢 108 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢 和 外周 途径 前 言 前 言 长期以来, 小脑一直作为大脑皮层下最大的运动调节中枢被人们广泛的认识和接 受, 其传统的功能是配合皮层完成躯体的运动, 在维持躯体平衡 , 调节肌肉张力, 协 调随意运动, 及技巧性运动的获得和建立过程 中发挥重要的作用。 近几十年来, 越来 越多的研究表明小脑除了经典的调节躯体运动的功能以外, 还参与诸多非躯体性活动 [1-3] [4] 的调节, 比如心血管 , 呼吸, 消化等内脏活动 , 摄食行为 , 情感认知和学习记忆 [5, 6] 等。免疫 功能也是机体 重要的非躯体功 能 之一,机体通过免疫 功能识别― 自己‖ 和 ― 异己‖ , 清除各种有害物质, 维持机体内环境的平衡和稳定。 近半个多世纪以来, 随 着神经 ? 内分泌 ?免疫调节网络研究的兴起, 大量的研究表明神经内分泌系统和免疫 系统之间存在着双向复杂的联系, 免疫系统可受到神经内分泌系统的广泛调节。 而小 脑作为中枢神经系统的重要组成部分,其与免疫功能的关系也逐渐受到人们的关注。 [7] 早在 1995 年 Green-Johnson 等 发现在一种小脑 内去甲肾上腺素 (norepinephrine, NE ) 异常增高的神经变异小鼠体内,T 细胞和巨噬细胞的功能均被抑制。 随后 Ghoshal 等 [8] 报 道 毁 损 大 鼠 小 脑 绒 球 小 结 叶 可 导 致 体 外 培 养 的 骨 髓 和 胸 腺 细 胞 分 泌 造 血 细 胞 因 子减少,外周血液中的白细胞浓度降低和抗绵羊红细胞 (sheep red blood cell, SRBC ) [9, 10] 的抗体滴度减弱。 另有一些研究还揭示小脑中有趋化因子及其受体的表达 。 这些 研究均表明小脑和免疫功能之间存在着密切的联系。 小脑在组织结构上由 外层的灰质( 皮质) ,内 部的白质和位于白质 深部的三 对小 脑核团组成。 这三对小脑核团分别是顶核, 间位核和齿状核。 近十年来, 我们实验室 对小脑核团与免疫功能的关系进行了研究。 研究发现, 用兴奋性神经毒性氨基酸海人 酸毁损大鼠双侧小脑顶核,可导致 T 细胞增殖功能及自然杀伤(natural killer ,NK ) [11] 细胞的杀伤活性增强 。 此外, 毁损双侧顶核 还可促进胸腺细胞的分化和成熟, 并增 [12] 强辅助性 T 细胞的功能 。 而海人酸毁损小脑的双侧间位核,可产生相反的变化, [13] 大鼠 T 淋巴细胞增殖功能,B 淋巴细胞的抗体 应答及 NK 细胞的杀伤活性均减弱 。 由于小脑核团神经元轴突组成的离 核纤维是小脑功能输出的唯一途径, 因此, 我们的 研究更为直接 地证明了小脑参与机体的免疫功能调节。 但迄今为止, 对小脑参与免疫 调节的具体途径和机制还研究甚少,尚不清楚。1. 前 言 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 由于小脑和免疫系统之间没有直接的结构上的联系, 因此小脑调节免疫功能必然 通过某些中枢和外周途径中介。 多年来大量的研究表明下丘脑是一个重要的 免疫调节 [14, 15] [16-18] 中枢, 其可通过调节神经内分泌的传出 和自主神经活动 两条主要的途径对免 疫功能发挥调节作用。在免疫细胞上广泛存在着各种内分泌激素及神经递质的受体, 下丘脑 一方面 可通过支配下丘脑 ? 垂体 ?内分泌腺轴分泌多种激素 , 如促肾上腺皮质 激素 (adrenocorticotropic hormone, ACTH ) , 皮质醇 (cortisol ) , 促甲状腺激素 (thyroid stimulating hormone, TSH), 三 碘 甲 状 腺 原 氨 酸 (triiodothyronine, T3 )及甲状腺素 (thyroxin, T4 ) , 雌二醇,睾酮等作用于免疫细胞膜上的相应受体从而影响免疫系统 [15] 的活动 ; 另一方面, 下丘脑也可通过调节交 感神经释放 NE 来影响淋巴细胞的功能 [19-28] 。 值得庆幸的是, 神经解剖学的研究发现 小脑和下丘脑之间存在着双向直接的神 经纤维联系, 即小脑? 下丘脑投射和下丘脑? 小脑投射, 两者构成小脑? 下丘脑神经 [29-30] 环路 , 这为我们的研究提供了依据。 其中 小脑 ? 下丘脑直接投射起源于 小脑的三 个深部核团(顶核, 间位核和齿状核 ) ,可上 行投射到下丘脑的诸 多区域和核团,包 括下丘脑外侧区(lateral hypothalamic area, LHA ) 、背侧区(dorsal hypothalamic area, DHA ) 、 后 侧 区 ( posterior hypothalamic area, PHA ) 、 腹 内 侧 核 ( ventromedial hypothalamic nucleus, VMN ) 、 背内侧核 (dorsomedial hypothalamic nucleus, DMN)和 [31-36] 室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus, PVN )等处 。且有研究报道,小脑 可凭借小脑? 下丘脑神经投射参与众多非躯体性活动, 如心血管, 呼吸, 消化等内脏 [2] 活动及摄食行为的调节 。 据此, 我们推测小脑可能通过下丘脑途径调节机体的免疫 功能, 即小脑发出的免疫调节信息通过小脑? 下丘脑投射传递给下丘脑, 继而下丘 脑 通过影响内分泌激素的释放或交感神经的活动对免疫功能起到调节作用。本研究中, 我们试图探索直接的小脑? 下丘脑投射在小脑免疫调节中的介导作用。 尽管小脑? 下丘脑神经投射已被报道, 但具体投射路径及神经递质的性质仍需进 一步的 证实 。我们 新近 的研 究表明 ,小 脑间 位 核可向 LHA 发出 直接 的 γ- 氨 基丁酸 (γ-aminobutyric acid, GABA )能和谷氨酸能 神经投射,通过这些神经投射可调节淋 [37, 38] 巴细胞的功能 。 然而, 关于小脑顶核, 一 个种系发生上较古老的小脑核团, 无论 是其 至下丘脑神经投射的性质还是在免疫调节中 的作用均不是很清楚。有报道表明, [39-43] 小脑顶核神经元也可分为 GABA 能和谷氨酸 能神经元 。且神经电生理学的研究 2. 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢 和 外周 途径 前 言 [44-47] 也表明,刺激小脑顶核可引起 LHA 的神经元 产生单突触的抑制或兴奋性反应 , 提示小脑顶核与 LHA 之间可能存在 GABA 能 和谷氨酸能神经投射。 基于上述研究基 础, 在本实验中, 我们首先运用神经束路追踪 及免疫组织化学染色方法确 定小脑顶核 至下丘脑神经投射的存在及其 GABA 能或谷 氨酸能神经投射的性质。在此基础上, 我们进一步研究小脑顶核 至 下丘脑 GABA 能 或谷氨酸能神经投射在免疫调节中的作 用,一方面在顶 核中微量注射 GABA 降解酶 ?GABA 转氨酶 (GABA transaminase, GABA-T ) 抑制剂 氨 已 烯 酸 (vigabatrin, VGB ) 或 GABA 合成酶 ? 谷氨 酸 脱 羧 酶 (L-glutamic decarboxylase, GAD ) 的抑制剂 3- 巯基丙酸(3-mercaptopropionic acid, 3-MP ) , 分别观察淋巴细胞的功能变化以探讨小脑顶核 至 下丘脑 GABA 能神经投射在 免疫 调节中的作用; 另一方面 , 我们在顶核中 微量 注射谷氨酸合成酶 ?谷氨酰胺酶抑 制剂 6- 重氮-5- 氧代-L- 正亮氨酸 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DON ) 及在 LHA 联合注 射 谷 氨 酸 膜 转 运 体 抑 制 剂 苏 式-3- 羟 基 天 冬 氨 酸 (D,L-threo-β-hydroxyaspartic acid, THA , 并以 顶核投射至 丘脑的主要部位 ?丘脑腹外侧核(ventrolateral thalamic area, [48, 49] VL ) 注射 THA 作为 对照 , 同时 观察淋巴 细胞的功能变化以探讨小脑顶核 至 下丘 脑谷氨酸能神经投射在免疫调节中的作用。 除研究上述中枢调节途径以外, 我们 同时 检测血清中 内分泌 激素及外周淋巴器官中 交感神经递质 NE 含量的变化, 以初步探讨 顶核免疫调节的外周 途径 。 通过这些研究 , 揭 示小脑调节 免疫系统功能的具体 途径 和 机制, 有助于进一步拓宽和加深对小脑功能的认识和增加神经免疫学的知识, 为临床 上解决小脑功能障碍时合并的免疫系统功能紊乱提供新的思路。 3. 材料 与方 法 小脑 顶核 调节 免疫 系统 功能 的中 枢和 外周 途径 材料与方法 1 材 料 1.1 实验动物 健康 Sprague-Dawley (SD )大鼠,体 重 220 g ? 20 g ,雌雄兼用,由南通大学 实验动物中心提供。