高效液相色谱法测定狂犬病人免疫球蛋白制品中甘氨酸含量

· 药物鉴定 · Drug Idenlificotion 中目蔼 China Pharmaceuf 口 2012年7月 5日 第2l卷第 l3期 Vo1．21，No．13，July 5，2012 高效液相色谱法测定狂犬病人免疫球蛋白制品中甘氨酸含量 高莉萍，盛凤仙，浦奕奕 (上海新兴医药股份有限公司，上海 200135) 摘要：目的 建立测定狂犬病人免疫球蛋白制品中甘氨酸含量的高效液相色谱法。方法 采用Shim—Pack CLC—ODS色谱柱f150 mill× 6．0 mm，5 txm)，以 50％ 乙腈溶液一0．05 mol／L醋酸钠缓冲液 (35：65)为流动相 ，检测波长为 360 nm。结果 甘氨酸质量浓度在 0．025～0．20 g／L范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0．999 9)，平均回收率为99．58％，RSD为 1．18％(n=6)。结论 所用方法简便 灵敏，结果准确可靠，可用于狂犬病人免疫球蛋白制品中甘氨酸含量的测定。 关键词：狂犬病人免疫球蛋白；甘氨酸；高效液相色谱法；含量测定 中图分类号：R927．2；R977．6 文献标识码：A 文章编号：1006—4931(2012)13—0022—02 Determination of Glicine in Human Rabies Immunoglobulin by HPLC Gao Liping，Sheng Fengxian，Pu Yiyi (Shanghai Xinxing Medicine Co．Ltd．，Shanghai，China 200135) Abstract：0bjective An HPLC method was established for the determination of glicine in human Rabies Immunoglobulin．Methods A Shim—Pack CLC—ODS column was used with the mobile phase of 50％ acetonitrile 一0．05 mol／L sodium acetate buffer(35：65)，at the detection wavelength of 360 nm．Results The calibration curve of glicine was linear in the concentration range of 0．025～0．20 g／L．the average recovery was 99．58％ ，with RSD of 1．1 8％ ．Conclusion The method was simple and sensitive．and the determ ination result was accurate and reliable，indicating that the method was suitable for determination of glicine in human Rabies Immunoglobulin． Key words：human Rabies Immunoglobulin；glicine；HPLC；content determination 狂犬病人免疫球蛋白是肌肉注射制剂，制品中含有高效价的 狂犬病抗体，能够特异地中和狂犬病毒，起到被动免疫作用”。 ， 临床上可用于治疗被狂犬或其他疯动物咬伤、抓伤的患者，以及 所有怀疑有狂犬病暴露的患者 41。本公司研发的狂犬病人免疫 球蛋白制品中加入适量甘氨酸作为稳定剂 ，并且规定其含量为 10～30 g／LI 。因此，必须对其在制品中含量进行检测和控制。笔 者参考 2010年版《中国药典(二部)》中高效液相色谱法，采用 2， 草苷峰面积积分值。结果的 RSD为 1．3％(n=6)，表明供试品溶 液在 24 h内稳定性良好。 重复性试验：取同一批样品(批号为 101021)适量，研细 ，混 匀 ，取 6份，各 1．0 g，精密称定，依法制成供试品溶液并测定含 量。结果的 RSD为0．58％(n=6)。 加样回收试验：精密称取已知含量的样品(甘草苷含量为 0．203 mg／g)0．5 g，共称取 6份 ，用 0．002 002 g／L的甘草苷对照 品70％乙醇溶液代替 70％乙醇，依法制成供试品溶液，按上述检 测方法测定，计算回收率。结果见表 1。 表 1 甘草苷加样回收试验结果(n=6) 取样量(g)样品含量( g)加入量( )测得量( g)回收率(％) (％)RSD(％) 2 4 样品含量测定 取样 品 3批 ，照拟订的含量测定方法测定。结果批号为 101021，101122，100908的样 品中甘草苷含量分别 为 0．203， 0．205．0．201 mg／g。 2．5 耐用性试验 取同一批样品(批号为 101021)适量，研细，混匀，精密称定 4一二硝基氟苯(DNFB)为柱前衍生剂[61，对狂犬病人免疫球蛋白 制品中甘氨酸的含量测定作了初步探讨。 1 仪器与试药 日立高效液相色谱仪，包括 L一7100型泵，L一7420型紫外 可见分光检测器，L一7610型真空脱气机和 L一7300型柱温箱。 2，4一二硝基氟苯(DNFB，中国医药上海化学试剂公司，纯)； 碳酸氢钠 (分析纯)；甘氨酸(中国惠兴生化试剂有限公司，分析 适量，依法制成供试品溶液，选用不同的仪器(Waters e2629，岛津 LC一20AT)及不同厂家的色谱柱[YMC C。s柱(250 mm x4．6 IBm， 5 p．m)，Agilent C1 8柱(250 mm x4．6 mm，5 p3n)】，按上述检测方 法进行测定。结果的 RSD为 0．5％，表明该方法耐用性良好。 3 讨 论 采用 2010年版《中国药典(一部)》甘草含量测定所用的流动 相(乙腈 一0．5％磷酸)、梯度洗脱，结果样品中甘草苷峰与其他杂 峰重叠，反复调整比例仍不能达到基线分离。后采用 2010年版 《中国药典 (一部)》附子理中丸含量测定所用的流动相[乙腈 一 0．05％醋酸(20：80)]，通过调整比例为(13：87)后 ，得到分离度 良好、出峰时间适宜的色谱图。 供试品溶液的制备过程中，对超声时间、所加溶剂的量、大孔树 脂的高度和洗脱液量都进行了考察，最后确定为文中的提取方法。 本法简便 、准确、灵敏，并有较好的重现性，可用作逍遥丸的 质量控制方法。 作者简介：韩慧琴(1980一)，女，学士，主管中药师，研究方向 为中药检验及质量标准，(电子信箱)hnhiqg668899@sohu．com；王 晓青(1976一)，女，中药学博士研究生，研究方向为天然药物活性 成分分布规律，本文通讯作者，(电子信箱)wangxiaoqin760519@ yahoo．con．cn。 参考文献： [1]国家药典委员会 ．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药 科技 出版社 ．2010：994． (收稿日期：2011—08—05) 2012年7月5日第2l卷第l3期 中目茄 C ina armaceuticals · 药物鉴定 · Drug Identification 纯，含量不少于99．5％)；乙腈(Merck公司，色谱纯)。 2 方法与结果 2．1 色谱条件 色谱柱 ：Shim—Pack CLC—ODS柱(150inn x 6．0mm，5 Ixm)； 流动相：50％乙腈溶液 一0．05 mol／L醋酸钠缓冲液(35：65)；检 测波长 ：360 nm；流速 1．0mL／min；柱温：常温；进样量：10 IxL。 2 2 溶液制备 精密称取甘氨酸对照品 100 mg，置 1O0 mL容量瓶中，用纯 化水定容，摇匀，制得质量浓度为 1 g／L的甘氨酸对照品溶液。精 密吸取狂犬病人免疫球蛋白样品 1．0 mL，用 4．0 mL 1．5％磺基 水杨酸沉淀蛋白质，3 500 r／min离心25 rain，取上清液 1．0 mL，加 入 3．0 mL纯化水，混匀，作为供试品溶液。取不含甘氨酸狂犬病 人免疫球蛋 白样品适量 ，照供试品溶液的制备方法制得阴性对照 品溶液 。 2．3 衍生化反应 精密吸取适量体积的甘氨酸对照品溶液或供试品溶液于 1 0 mL 容量瓶中，加入0．5 mol／L碳酸氢钠(pH=9．0)衍生缓冲液 1．0 mL， 摇匀 ，再加入 1％(DNFB)衍生溶液 0．6 mL，混匀，避光 ，于 60℃ 恒温水浴中衍生 1 h，取出，放置冷却。加入磷酸盐缓冲液(pH= 7．O)定容，摇匀，放置 15 rain。经 0．45／xm微孔滤膜过滤，取过滤 液进样。 2 4 方法学考察 阴性干扰试验：分别精密吸取对照品溶液 、供试品溶液和阴 性对照品溶液 1．0 mL，按 2．3项下方法进行衍生化，并按 2．1项 下色谱条件进样 ，色谱图。色谱图见图 1。结果供试品溶液色 谱中甘氨酸衍生物峰与杂质峰完全分离，阴性对照品溶液色谱在 甘氨酸衍生物峰位置处无相应峰出现，说明处方中其他成分对测 定无干扰。 400 200 ￡／min 0 U 7 14 0 7 l4 0 7 l4 A B C 1．甘氨酸衍 生物 A．对照品溶 液 B．供试品溶液 C．阴性对照品溶液 图 1 高效液相色谱图 线性关系考察 ：精密 吸取 对照品溶液 0．25，0．50，1．00， 1．50，2．00 mL，分别置 10 mL容量瓶中，按 2．2项下方法进行衍 生化 ，并按 2．3项下色谱条件测定 ，以甘氨酸质量浓度 (g／L)为 横坐标( )、峰面积积分值为纵坐标(1，)进行线性 回归，得回归方 程 Y=1．361 1 x 10 X+1．477 3 x 10 ，r=0．999 9(n=5)。结果 表明，甘氨酸检测质量浓度在 0．025～0．200 g／L范围内与峰面 积积分值呈良好线性关系。 精密度试验 ：精密吸取同一对照品溶液 1．0 mL，按 2．2项下 方法进行衍生化，并按 2．3项下色谱条件检测，重复进样 5次，测 定峰面积积分值。结果的 RSD为 0．39％( =5)，表明仪器精密 度 良好 。 稳定性试验 ：精密吸取供试品溶液 1．0 mL，并按 2．2项下方 法进行衍生化 ，分别于 0，2，4，8，12，24 h按 2．3项下色谱条件进 样 ，测定甘氨酸峰面积积分值。结果的 RSD为0．28％(n=6)，表明 衍生化供试品溶液在 20 h内稳定性良好。 重现性试验：取同一批(批号为 20050605)样品6份 ，按供试 品溶液制备方法制备溶液，并按 2．3项下方法进行衍生化后 ，按 2．1项下色谱条件测定。结果制品中甘氨酸含量的 RSD=2．17％ (n=6)，表明方法重现性良好。 加样回收试验：精密称取甘氨酸对照品 65．6，80．0，99．5 mg 加入4inL空白样品中，依法制备供试品溶液 ，并按 2．3项下方法 进行衍生化，按 2．1项下色谱条件测定含量。结果见表 1。 表 1 加样回收试验结果(n=6) 2 5 样品含量测定 取 3批样品，依法制备供试品溶液，并按2．3项下方法进行衍 生化，按 2．1色谱条件测定峰面积，按外标法计算含量。结果见表 2。 表2 样品中甘氨酸含量测定结果(n=3) 3 讨论 本试验采用磺基水杨酸为蛋白质沉淀剂，2，4一二硝基氟苯 为柱前衍生剂，衍生化反应为氨基酸在碱性条件下定量地与过量 的 DNFB迅速缩合生成二硝基苯氨基酸(DNP一氨基酸)，该衍生 化后产物可采用紫外检测器检测。 衍生化样品在室温下放置，甘氨酸含量基本不变，衍生化样 品至少可稳定 20 h。 本试验仪器配置要求不高，普通的带紫外检测器的高效液相 设备即可进行，同时衍生化试剂用量少 ，成本低，易于购买。 本试验分离完全，重现性、稳定性均 良好 ，测定结果准确，可 用于狂犬病人免疫球蛋白制品中甘氨酸含量测定。 作者简介：高莉萍(1968一)，女，大学本科，主要从事药品质 量监督和控制相关工作，(电话)021—50931037；盛凤仙 ，女，本 科 ，从事药品质量研究和控制相关工作，本文通讯作者，(电子信 箱)wlrssfx@citiz．net。 参考文献： [1]李振平，王玉琳，刘 燕，等 ．人狂犬病免疫球蛋白使用效果观察[J]． 微生物学免疫学进展 ，2004，32(2)：32—34． [2]刘 刚，叶 涛 ．26例人狂犬病免疫球蛋白临床应用观察[J]．中国 临床医药研究杂志，2005，136：14 714． [3]皱 浩，周 斌 ．500例应用冻干人用狂犬病纯化疫苗(Vero细胞)及 加用人狂犬病免疫球蛋白注射预防狂犬病临床观察[J]．中国临床医 药研究杂志，2005，136：14 713—14 714． [4]任桂林，张栓虎，高银生，等．狂犬疫苗与狂犬病免疫球蛋白联合应 用的血清学效果观察[J]．中国人兽共患病杂志，2002，18(2)：125． [5]国家药典委员会 ．中华人民共和国药典(三部)[M]．北京：化学工业 出版社 ，2010：225． [6]李 瑜 ，江 勇，李 爽 ．反相高效液相色谱法测定发酵液中L一精 氨酸含量[J]．工业微 生物 ，2004，34(3)：32—34． (收稿日期：2011—08—01) =主 = 6 4 2