絮凝方法收集产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3条件的优化

第 33卷 第 4期 2003年 12月 工 业 微 生 物 Industrial M icrobiology Vo1．33 NO．4 Dec．2003 絮凝方法收集产氨短杆菌 MA一2、黄色 短杆菌 MA一3条件的优化 胡永红 ， 刘 洋 ， 江昌明， 沈树 宝， 欧阳平凯 (南京工业大学制药与生命科学学院，南京 210009) 摘 要 采用壳聚糖作絮凝剂收集富含延胡索酸酶活力的产氨短杆菌 MA一2、黄 色短杆茵 MA一 3。研 究 了絮凝剂加入 量及加入 时混合方式与 时间等 因素对延胡 索酸酶 活力及 分 离效果的影响 ，并 对 壳聚糖絮凝 收集产氨短杆 茵 MA一2、黄 色短杆菌 MA一3的过程 进行 了初步分析 。 关键 词 ：絮 凝 ； 茵体 收集 ； 延 胡索酸酶活力 微 生物菌体 的收集是 发酵工业 中一个至关重要 的步骤 ，而微 生物 培养液是一种胶体溶 液 ，对这些 菌 体细小且粘 度较 大 的发 酵液 进行 菌体 收集 ，其 固液 分离 比较 困难 ，国内外 普遍 采用 的是 高速 离 心机 收 集法 。大 多数 研究论文将 絮凝 方法用于发酵液 中微 生物菌体 的 去 除 。]，笔 者 首 次将 絮凝 方 法 用 于 富 含延胡索 酸 酶活 力 的 产 氨短杆 菌 MA一2、黄色 短 杆 菌 MA一3微 生物菌体 的收集 。本 文对絮凝 方法用 于产 氨短 杆菌 MA一2、黄色短杆菌 MA一3菌体 收集过 程进行 了优化 ，并对 壳 聚糖 对上 述两 种微 生物 菌株 絮凝过程 的机 理进行 了初步探讨 。 1 材 料 和 方法 1．1 试 剂 富马酸 ，化学 纯 ，上海 试 剂一 厂 ；聚丙烯 酰胺 ， 江苏南天集 团 ；壳 聚糖 ，中等 粘度 ，东辰 生物 工程 公 司 。 1．2 菌株 本文所用 的菌株是 由我 院筛选并保存 的产氨短 杆菌 MA一2(B．ammoniagenes MA一2)和 黄 色短 杆 菌 MA一3(B．f／avu．~MA一3)。 1．3 培 养基组成 1．3．1 斜 面培养基 上述两株菌均于普通 肉汤培养基 中培养，其成 分为：蛋白胨 1％，牛肉膏 0．5％，氯化钠 0．5％。 1．3．2 产氨短杆茵 MA一2发酵培养基成份 柠檬 酸 氢 二铵 3％，KH2PO 0．2％，MgSO · 7H，O 0．05％，玉 米 浆 4．5％，用 30％NaOH 调 节 pH 至 7．5左右 ，灭 菌后 备用 。 1．3．3 黄色短杆茵 MA一3发酵培养基成份 丙 二 酸 2％，KH2PO 0．2％ ，MgSO ·7H2O 0．05％ ，玉米浆 2％，用 30％NaOH 调节 pH至 7．5 左右 ，灭菌后 备用 。 1．4 培养条件 产 氨 短 杆 菌 MA一2于 32～34℃ 下 培 养 24～ 36h，摇瓶接种量为 10％，摇床转速 180r／min。黄色 短杆菌 MA一3培养温度 为 30～32℃ ，其 余条件 同产 氨短杆菌 MA一2。 1．5 絮凝操作方法 分别 量取 100mL产 氨短 杆 菌 MA 2、黄色 短杆 菌 MA一3发酵 液 ，移置三角瓶 中 ，在 电磁搅拌器 搅拌 下缓慢加入一定量 的絮凝 剂 ，加入完毕后 ，继续搅拌 10～15min，静 置 观察 分层 时间 ，抽 滤 ，并 测 定上 层 清液光密度及絮凝体延胡索酸酶活力的变化。 1．6 仪 器 DU650分光光度计(Beckman)，MD100—2电子 分析天平(上海第三分析仪器厂)，HHS14一型电热 恒温水浴锅(常州国华仪器厂)，PHS一3C电位测定 仪(上海雷磁仪器厂)，卜U一3恒温电磁搅拌器 (常州 国华仪器厂 ) 江苏省教育 自然科学基金(01KJB530003)及江苏省科技省科技厅 自然科学基金(No．BK2002201)资助。 第一作者简介 ：胡永红(1968～)，女，博士，副教授。 一 l4 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 胡永红 ，等 ：絮凝方 法收集产氨短 杆菌 MA一2，黄 色短杆 菌 MA一3条件优化 第 33卷 1．7 分析 方法 游离细胞延胡索酸酶活力 的测定方法详见文 献 ·引，生物量的测定详见文献 。 2 结果与讨论 2．1 不 同絮凝剂对微 生物 中延 胡 索酸 酶 活力 的影 响 1 不 同絮凝 剂对酶活力的影响 考察指标 聚丙烯酰胺 壳聚糖 选用了聚丙烯酰胺 、壳聚糖等高分子絮凝剂对 产氨短杆菌 MA一2、黄色短杆菌 MA一3培养液进行处 理 ，结果发现采用简单易得的大分子阳离子絮凝剂 壳聚糖对上述两株微生物进行絮凝处理效果最佳 ， 对 照实 验结果 见表 1。 2．2 絮凝剂 壳聚糖加 入量对 絮凝效果 的影 响 为了考 察不 同剂 量 壳 聚糖 对 产氨 短杆 菌 MA一 2、黄色短杆菌 MA一3絮凝效果及延胡索酸酶活力的 影 响 ，考察 了上述两株微 生物发酵液 中 ，加入不 同剂 量的絮凝剂进行试验 ，结果如表 2所示 ，当絮凝剂壳 聚糖加 入量为 6O～70 mg／L时 ，产氨 短杆 菌 MA一2、 黄色短杆菌 MA一3两菌体中延胡索酸酶活回收率最 高，且抽滤时间短 ，滤液澄清度高，O．D．值最低，因 此在试 验中以上述加量 。 表 2 壳聚糖加入 量对絮凝 效果 的影响 2．3 壳聚糖 加入时的搅 拌 状态 及搅 拌时 间对 絮凝 效果的影响 在不 同搅 拌状 态 下 (即快 速搅 拌 60r／min与慢 速搅拌 30r／min)加 入 60mg／L的 壳 聚糖 ，并 观察 搅 拌时间对 上清 液 澄 清程 度 及 产氨 短 杆 菌 MA一2、黄 色短杆菌 MA一3的延胡索酸酶活回收率的影响，结 果 如表 3所示 ： 表 3 搅拌速 度及搅拌 时间对絮凝 效果的影 响 编号 考察指标 0 1 2 3 4 5 6 壳聚糖加量(mg／L) 0 60 60 60 60 60 60 快搅时间(min) 0 5 5 5 5 5 5 慢 搅 时间(min) 0 0 5 10 15 2O 25 MA．2 O．D．(600nm，1／50) O．515 0 043 0 037 0．022 0．021 0 029 0 037 体 系 电位 变化 (mV) 126 126 126 126 126 126 126 酶活 回收率 (％ ) 100 92 7 93 9 96．0 96 1 94 8 94．3 MA．3 O．D．(600nm，1／5O) 0．348 0．1I2 0 017 O．O19 0．019 0．022 0 035 体系电位变化(mV) 127 127 I27 127 127 127 127 酶活 回收 率 (％) 100 93 5 94．6 97 96．8 95．4 95 由上 述实验 结 果可 见 ，搅拌 对絮凝 效 果影 响较 大，搅拌过程有利于促进壳聚糖与产氨短杆菌 MA一 2、黄色短杆菌 MA一3微生物胶体粒子间的相互碰撞 与接 触 的 机 会 ，当 快 速 与 慢 速 搅 拌 时 间 为 15～ 20min时，上述两菌的延胡索酸酶活回收率达 96％ 以上 ，上清液 O．D．值与初始培养基相 当，而且粘度 不大 ，很容易通过过滤 的方式收集到菌体。因此在 具体操作时采用搅拌时间以 15～20min为宜。 2．4 壳 聚 糖 与 产 氨 短 杆 菌 MA．2、黄 色 短 杆 菌 MA．3絮凝过程初步分析 絮凝机理是 十分 复杂 的 ，特 别是微 生 物 菌体 的 絮凝机理 由于影响因素多 ，使 之机理更为复杂 ，目前 关于壳聚糖 与富含延胡索酸酶 活力的产氨短杆菌 MA一2、黄 色短杆 菌 MA一3絮凝 机理的研 究与探讨 还 未见报道。壳聚糖 是一 种水 溶性 的线性 聚合 物 ，由 大量的链节组成，其吸附在微生物表面上的高分子 一 l5 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 工 业 微 生 物 第 33卷 长链可同时吸附在另一个微生物的表面上，通过“架 桥”方式将两 个或 更多 的微生物联在一 起 ，从而导致 絮凝 ，笔者认为壳聚糖对产氨短杆菌 MA一2、黄色 短杆 菌 MA一3两 种微 生物的絮凝过程所表 现 的特 征 可以用此絮凝架桥机理来解释，其作用示意图如图 1所示 。此过程 包括 以下 几 个步骤 ：A、首 先在 分散 的产氨短 杆菌 MA一2或 黄色短杆菌 MA一3培养液 中 加入 絮凝 剂壳聚糖 ，此时壳聚糖均匀分散 、分布于微 生物微 粒 间 ；B、壳 聚糖 一 端 先 吸 附于 产 氨 短 杆 菌 MA 2或黄 色短 杆 菌 MA一3菌体 微粒 的表 面 ；C、通 过吸附链重排 ，絮凝剂壳聚糖包 围在产氨短杆菌 MA一2或 黄色短 杆 菌 MA一3微 生物 表 面 ；D、失稳 的 产氨短杆 菌 MA一2或黄 色短杆 菌 MA一3菌体微 粒通 过相互碰撞接触吸附其他微生物胶粒，形成架桥絮 凝 ，形 成较大絮 团 ，有利于采用过滤方式 收集富含延 胡索酸酶活力的微生物菌体；E、在絮凝过程中，由 于搅拌速度过快或时间过长，亦会造成部分产氨短 杆菌 MA一2、黄色短杆菌 MA-3絮团被打碎 的现象 ， ==， 一 咎 摹 ≈ D_ E 《耋 ——— 田-l 图 1 壳聚糖 与产氨 短杆菌 MA一2、黄 色短杆 菌 MA一3絮凝过程 示意图 破坏壳聚糖架桥作用的稳定性，从而降低凝聚效果， 因此在絮凝操作过程中笔者严格控制搅拌速度和搅 拌时间对絮凝过程的影响。 3 结论 对壳聚糖絮凝收集富含延胡索酸酶活力的产氨 短杆菌 MA 2、黄色短杆菌 MA一3菌体过程进行 了优 化 ，在优化的条件下两菌延胡索酸酶活回收率大于 96％，滤液澄清，过滤分离快 ，是很好的收集微生物 菌株的方法 。同时 ，还对 絮凝剂 壳 聚糖与 产 氨短杆 菌 MA一2、黄色短杆菌 MA一3相互作用的过程进行了 初步探讨 ，认为此絮凝过程的机理为架桥机理。 参 考 文 献 [1] 赵保国，冯裕新．发酵液凝聚和絮凝除菌体的研究试验 ．中国 调味 品 ，1997，(6)：8～12 [2] 云逢霖 ，崔焕明．谷氨 酸发酵液絮凝除菌的研究．微生物学通 报 ，1996，23(2)：91～94 [3] 胡永红，沈树宝等 ．凝聚和絮凝对收集富含延胡索酸酶活微生 物 的影 响研 究 化 工进展 ，2003，2：30—32 [4] Takata I，Tosa T et a1．Reasons for the high stability of fumarase activity of B．flaw m cells immobiolized with K-carrageenan ge1． Appl Biotechno1．1983，8(1)：39～48 [5] 胡永红 ，沈树宝，欧阳平凯．固定化产氨短杆菌 MA．2、黄色短 杆菌 MA．3反应动力 学的研究 ，生物工程学报 ，2002，18(2)： 235—238 [6] Neufeld RJ，PelegY，PinesO et a1．L-malic acidformation byim． mobilized Saccharomycea cerevisiae amplified for fumarase ．Enz． 3fine Microb Techno1．1991，13(12)：991～997 [7] 梁为民编著，凝聚与絮凝 ，冶金工业出版社 ，1987，40 Optimization of flocculation conditions for collecting B．ammoniagenes MA一2 and B．flavum MA一3 HU Yong—hong，LIU Yang，JIANG Chang—ming，SHEN Shu—bao，oUYANG Ping—kai (CoHege of Life Science and Pharmacy，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China) Abstract B．ammoniagenes MA一2 and B．fla~,um MA一3 were collected by using chitosan as flocculant．The optimum conditions such as the amount of chitosan used，the velocity of agitator and mixing time which influence the enzyme activ— ity and separation effects were determined．The flocculating process of collecting B．ammoniagenes MA一2 and B．fla~,um MA-3 with chitosan was also analyzed． Key words flocculation；microorganism collection；fumarase activity 一 16 — 维普资讯 http://www.cqvip.com