[doc] 蚯蚓体腔细胞彗星试验检测阿散酸在泥浆体系中降解前后的遗传毒性变化

[doc] 蚯蚓体腔细胞彗星试验检测阿散酸在泥浆体系中降解前后的遗传毒性变化 蚯蚓体腔细胞彗星试验检测阿散酸在泥浆 体系中降解前后的遗传毒性变化 应用与环境生物2007,13(1):46—49 ChinJApplEnvironBiol=ISSN1006-687X20072_25 蚯蚓体腔细胞彗星试验检测 阿散酸在泥浆体系中降解前后的遗传毒性变化术 徐韵陈海冈4李兆利李梅孙华2孔志明 (南京大学环境学院/污染控制与资源化研究国家重点南京210093) (中国科学院南京土壤研究所南京210008) 摘要配制不同浓度的阿散酸液,与某养猪场附近的表层土壤混合形成泥浆系统,放在摇床上连续培养30d. 在第0,1,2,3,4周取出适量降解液,分别用分光光度法测定阿散酸的降解率;用彗星试验检测降解液对赤子爱胜蚓 体腔细胞DNA的损伤.结果表明,阿散酸低浓度时在泥浆体系中能被较快降解,500mg/L的降解率达到了25%;蚯蚓 体腔细胞彗星试验表明,所有降解液均具有遗传毒性,可导致蚯蚓体腔细胞DNA明显损伤,与对照相比具有显着性差 异(P<0.05).图1表1参17 关键词蚯蚓体腔细胞;彗星试验;泥浆;阿散酸;降解;遗传毒性 CICX】71.5 GenotoxicityChangesofArsanilicAcidBeforeandAfterDegradation inSlurrywithCometAssayonEarthwormCoelomocytes XUYun,CHENHaigang,LIZhaoli,LIMei’, SUNHua,&KONGZhiming’ (StateLaboratoryofPollutionControlandResourceReuse,SchoolofEnvironment,NanjingUniversity,Nanjing210093,China) (InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China) AbstractDegradationexperimentswerecarriedoutusingslurrywith4-aminobenzenearsonicacid(arsanilicacid)atdifferent concentrationsandsurfacesoil(0, 20cm)fromapiggery.Theslurrywasinoculatedonarockingbedandcontinuedforabout 4weeks,thenarsanilicacidwasdeterminedspectrophotometrically(450nm)andthegenotoxicitychangesofarsanilicacidon earthwormcoelomocytesweretestedwithcometassay(singlecellgelelectrophoresistest,SCGE)in0,1,2,3,4weeks,re— spectively.Theresultshowedthatthearsanilicaciddisappearedgraduallyintheslurry,especiallydisappearedmorequicklyat lOWconcentration.andthedegradationrateofarsanilicacidreached25%atconcentrationof500mg/Linthe4week.The cometassayshowedthatthedegradationproductsofarsanilicacidcouldmaketheDNAofearthwormcoelomocytesdamagedob— viously,whichdemonstratedthatthereweregenotoxiccompoundsproducedinthedegradationprocess.Sotheveterinarydrugs andanimalremedyadditiveconsistingofarsanilicacidmustbemanagedandcontrolledstrictly,andattentionshouldbepaidto itspotentialdamagetoenvironment.Fig1,Tab1,Ref17 Keywordsearthwormcoelomocyte;cometassay;slurry;arsanilicacid;degradation;genotoxicity CLCXl71.5 阿散酸(p-arsanilicacid,对氨基苯胂酸)是近年来世界范 围内广泛使用于畜牧生产中的有机胂类促生长剂添加剂,在我 国广泛用于养鸡业和养猪业等养殖业…,并取得了良好的经 济效益.然而有研究表明,添加到饲料中的砷化物在动物体内 的残留非常少,其中大部分没有任何形式变化就随粪尿等排泄 物进入环境,在环境中能转化为迁移能力强,毒性大的中间或 末端代谢产物,对环境造成污染’.我国是畜牧业大国,畜禽 养殖规模很大,通过猪和鸡的排泄物向环境中排放的含砷化合 物数量巨大,必将对生态环境造成潜在的毒性影响;因此研究 收稿日期:2005-09—14接受日期:2005.11-25 高等学校博士学科点专项科研基金(No.20020284041)和江苏省环 保科技项目(No.2004022)SuppoaedbytheDoctoralFundofMinis— tryofEducationofChina(No.20020284041)andtheEnvironmentPro- tectionPro~amofJiangsu,China(No.2004022) }}通讯作者Correspondingauthor(E—mail:zmkong@ju.edu.cn) 阿散酸降解产物的毒性变化规律,评价其对环境生物造成的影 响,具有重要意义. 彗星试验是一种灵敏,高效而且快速的测试手段,近年来 得到了广泛的应用.蚯蚓作为环境的指示生物广泛用于重金属 和农药的相关毒理学研究’,蚯蚓体腔细胞彗星试验可以非 常灵敏地检测环境污染物对靶位和非靶位生物的遗传毒性效 应’.生物泥浆反应体系是污染物降解去除的一种有效方法 和手段,它使得土壤微生物和添加物充分混合,提高了污染物 的可给性j.水环境是砷化合物产生和释放毒性效应的一个 重要介质和途径.为了评价阿散酸进入环境后的降解规律和对 环境生物的潜在毒性效应,本文研究了阿散酸在生物泥浆体系 中的降解规律,并应用蚯蚓体腔细胞彗星试验研究了不同阶段 的降解液对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤,以此评价阿散酸的降 解特性及遗传毒性特征,从而对含砷饲料添加剂的安全性标准 1期徐韵等:蚯蚓体腔细胞彗星试验检测阿散酸在泥浆体系中降解前后的遗传毒性变化47 提供理论和技术依据 1材料和方法 1.1生物材料 赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida),购于南京市花鸟市场,于实 验室中驯养2wk以上.试验中选取生殖环发育明显,体重100 , 200mg的健康成蚓. 1.2供试土壤与药品 试验用土壤为南京郊区某养殖场粪便堆置处附近的表层 土,采集0,20cm表层土壤,取回置4?冰箱保存,用时取出 置室内阴凉处1,2d,土壤含水率40%.阿散酸(Arsanilic acid),由南京壮大特种饲料厂提供,纯度为98%. 1.3降解实验设计 降解实验参照文献[8,9]所用方法进行.根据预试验结 果,在4个250mL三角瓶中分别加入100mL浓度为0,500, 1000,2000mg/L的阿散酸标准溶液和8g土壤作为微生物 接种.混合后的泥浆系统放在摇床上以180r/min振荡培养,温 度保持在室温(30?2)?范围内.培养体系中营养元素溶液主 要含有N和P,其组成为(p/gL):Na2HPO4.26,KH2PO4 2.65,NHC11.实验开始后,分别在0,1,2,3,4周用移液管 各取出16mL泥浆样品,3500r/min离心5min,然后进行相 关试验. 1.4阿散酸含量测定 阿散酸含量采用分光光度法测定,参照文献[10].其原理 是显色剂对二甲氨基苯甲醛的最大吸收波长为370nm,显色 剂与阿散酸反应产物西夫碱的最大吸收波长为440,460nm. 选用450nm为工作波长,通过标准曲线计算泥浆体系中阿散 酸的浓度,并求阿散酸的降解率. 1.5蚯蚓体腔细胞彗星试验 1.5.1染毒采用滤纸法进行染毒24h,按照OECD推荐 的标准方法进行.用移液管吸1mL受试物溶液,均匀加入 铺衬了中性滤纸的玻璃管中,空白对照用1mL的曝气水.试验 在黑暗条件下进行.试验期间,湿度控制在60%,70%,温度 控制在(20?1)?. 1.5.2蚯蚓体腔细胞提取根据Eyambe等(1991)报道的 蚯蚓体腔细胞提取方法,适当调整提取时间进行.用4?的 生理盐水淋洗受试蚯蚓,将冲洗干净的受试蚯蚓转移入1.5 mLeppendoff管中(每管中加入1条蚯蚓),加入1mL的体腔 细胞提取液,迅速盖上管盖,提取细胞1.5min.提取结束后,立 即将蚯蚓取出.离心提取液(3min,3000r/min),沉积细胞.用 PBS缓冲液清洗2次后,再离心(3min,3000r/min),沉积细 胞.4?储存备用. 1.5.3彗星试验彗星试验参照Singh,eta1.(1988)报道 的方法进行.常规方法制片,玻片制好后放入新配置冰凉的 细胞消化液中,4?冷藏1h.变性解旋30min后在25V,100 mA条件下电泳1h.彗星图像应用CASP(www.casp.of.p1)图 像分析软件对彗星照片进行分析,每个平行至少分析50个细 胞.选择Olive尾矩(Olivetailmoment,OTM)作为DNA损伤评 价指标. 数据的统计分析采用Excel和SPSS软件根据数据的分 布特征和方差,采用单因素方差分析(ANVOA)或非参数检验 (Mann—WhitneyU检验)进行各剂量组与空白对照组的显着 性检验,组问的多重比较采用Student—Newman—Keuls(SNK) 检验法,显着性水平为0.05. 2结果 2.1阿散酸在泥浆体系中的降解 根据预试验,阿散酸降解之前的回收率高于90%,因此土 壤的吸附作用对试验结果影响不大.阿散酸降解曲线如图1所 示,可以看出,阿散酸第1周内降解速度很慢或不发生降解,其 降解曲线的升高可能是土壤颗粒对阿散酸的吸附达到平衡所 致;第2周的数据表明,阿散酸发生缓慢降解;第3周和第4周 的实验数据表明,阿散酸降解较为迅速,并且与浓度呈负相关, 500mg/L浓度的阿散酸在第4周的降解率达到了25%. 2.2阿散酸降解前后对蚯蚓体腔细胞DNA的损伤 阿散酸在泥浆体系中降解前后对蚯蚓体腔细胞的遗传毒 性如表1所示.以OTM值为损伤检测指标,可以看出阿散酸降 解之前并没有任何遗传毒性,与对照组相比没有显着性差异 (P>0.05);然而1wk后阿散酸降解体系就能引起蚯蚓体腔 细胞DNA明显的损伤,表明阿散酸在泥浆体系中发生了降解 转化,并且这种混合物体系具有遗传毒性.比较4个阶段的遗 传毒性变化,可以发现第1周和第2周各浓度范围的毒性都有 异常的增加,500mg/L浓度的降解产物表现出了最显着的遗 传毒性,之后低浓度水平降解产物的遗传毒性逐渐降低,而高 浓度降解产物的遗传毒性基本维持不变,整个降解产物体系的 毒性趋于稳定.从表中还可以看出,空白对照组的OTM值在不 同时间段均有所变化,组问多重比较结果发现除了第3周,其 它时间段降解产物所导致的DNA损伤差异并不显着,表明土 壤中所含成份对蚯蚓体腔细胞尽管有一定的毒性效应,但影响 并不大. 3讨论 阿散酸结构中含有一个一氨基苯环和一个类似无机态五 价砷酸的取代基,使其很容易被微生物降解或发生其它形式的 转化.EPA的数据表明,阿散酸能与土壤中的Al,Fe,ca等以 砷酸盐和磷酸盐相同的方式形成盐.GarbafinoJR等人”曾 研究了与阿散酸结构类似的洛克沙砷在畜禽粪便中的降解,结 果发现,在生物和非生物的作用下,用水萃取出的洛克砂砷在 48h内被转化成各种不同的含砷成分,进一步研究还发现微 生物在降解过程中起着主导作用.WoolsonEA等人对阿 散酸在土壤中的降解转化进行了比较深入的研究,他们通过模 拟实验研究了润湿土壤的厌氧和好氧条件下,阿散酸在湖底沙 泥土,Hagerstown淤泥土和Christiana泥土3种土壤中的降解 9 一—Q 0焉焉J异Q0扑 应用与环境生物ChinJApplEnvironBioll3卷 与变化情况,采用分光光度法测定总阿散酸和总砷含量,结果 发现在第0,2,4,8,16,24和32周提取的土壤中,总阿散酸 消除很快,32wk以后只有不到总量10%的阿散酸能从土壤 中提取.本研究中阿散酸开始降解较为缓慢,可能是微生物开 始生长较为迟缓,表现出对阿散酸的适应过程;降解第2周和 第3周遗传毒性的异常升高,可能是由于As”和As的相互 转化或者阿散酸苯环上氨基被还原成致癌性较强的硝基或亚 硝基等原因所致,之后由于微生物适应性生长,降解体系和毒 性变化均趋于稳定,这表明阿散酸与洛克沙砷在环境中的降解 机理可能是类似的. 表1阿散酸降解前后对蚯蚓体腔细胞的损伤 Table1DNAdamageofearthwormeoelomoeytesexposedtoarsanilicacidin vivobeforeandafterdegradation P<0.05;P<0.001.对空白对照进行多重比较,相同字母表示无差异(P>0.05)Thesamelettersshownosignificanceat 0.05level(P>0.05) 美国EPA对大鼠的急性毒性试验表明,阿散酸对大鼠的 半致死剂量为1461me/kg,Ames试验和小鼠微核试验表明阿 散酸并没有致突变作用,因此阿散酸作为一种安全高效的饲料 添加剂在世界范围内被广泛应用.但阿散酸作为一种含砷的有 机化合物,其含有的砷可能对环境产生大的危害效应,近年来 的研究已证明,砷暴露可以引起诸如皮肤色素异常,角化过度 以及心血管系统损坏等病症.在我国一些砷背景值较高的地区 经常发生由于饮用水或其它途径的长期砷暴露所导致的疾病. 砷的致突变性一直为人们所关注,砷化物通常被认为属于非致 突变剂,但却有许多有关人和动物体内或体外砷诱导的染色体 畸变,包括微核形成和姊妹染色体交换呈阳性的报道.李达圣 等人用单细胞凝胶电泳试验比较了砷对人体细胞DNA的 损伤,结果发现微量砷即可引起人体细胞不同程度的DNA损 伤.我们的研究也表明阿散酸降解液对蚯蚓体腔细胞有十分明 显的损伤作用,因此砷化物对生物细胞DNA的损伤作用是存 在的.同时阿散酸还含一个具有高化学反应活性的苯环,其降 解后产物的遗传毒性很可能因苯环的作用而增强. 畜禽粪便作为有机肥在农业生产中起着非常重要的作用, 然而若不在使用前加以处理,饲料中的添加剂,抗生素等药物 成份就会排入环境,将会影响环境中的微生物群落,同时导致 环境中的动物和植物富集大量药物,通过食物链最终进入人 体.据预测,一个万头猪场仅按商品猪日食粮中阿散酸100 me/kg的添加量,则每年需要360kg阿散酸,将向环境中的排 放约124kg砷,该万头猪场若连续使用砷制剂8a,那么就会 向周围排放1t砷.多种砷化物进入环境后,将参与砷的生 物化学循环并最终转化为砷在生态系统(土壤,水,空气)中的 背景值.综上所述,畜牧业当中使用砷制剂可能引起的环境污 染已经不是一个局部的环境问题,而是大的环境生态问题.砷 在环境中表现出复杂的地球化学性质,不同形态和价态的砷在 水体和土壤的迁移和富集及其相互作用受许多因素的制约,并 产生毒害程度不同的环境效应,因此,对于阿散酸的降解详细 过程,降解过程中微生物所起的作用以及降解产物的毒性作用 机理,还有待作进一步的研究和探讨. 4小结 在实验室条件下,阿散酸降解产物对蚯蚓体腔细胞DNA 有很大的损伤作用,表明阿散酸等砷制剂进入环境后,在生物 和非生物的作用下可能发生复杂的价态及形态转化,生成具有 遗传毒性的物质.单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)作为一种 敏感的化合物遗传毒性测试手段,不仅可以对复杂混合体系的 联合遗传毒性做出较为准确和快速的评价,而且也能根据毒性 变化情况从侧面反应出污染物在环境中的降解变化规律.阿散 酸作为一种应用广泛的有机胂制剂,其降解的结果必然会导致 毒性的增加,因此必须加强对含砷兽药,农药和防腐剂等砷化 物的使用管理,消除其对环境的潜在隐患. 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