酒精和冷冻处理对肌肉组织基因组DNA提取的影响

第 27卷 第 1期 2012年 3月 西 南 科 技 大 学 学 报 Journal of Southwest University of Science and Technology Vo1．27 No．1 Mill"．2012 酒精和冷冻处理对肌肉组织基因组 DNA提取的影响 汪虹英 (西南科技大学材料科学与工程学院 四川绵阳 621010) 摘要：提取基因组DNA的质量对于后续的基因扩增、酶切以及测序等分子生物学研究具有关键的影响，对肌肉组织 进行不同的酒精和冷冻处理会显著影响提取 DNA的质量。经过 一80℃超低温冷冻数日的黄鳝样品解冻，取肌肉 组织放入75％酒精处理后提取的基因组 DNA完整性差、降解厉害；经过一80℃超低温冷冻数日的黄鳝样品直接 取肌肉组织提取的基因组DNA比较完整、降解程度低；活体采取的黄鳝新鲜肌肉组织样品经过75％酒精处理，在 一 80 超低温冷冻数Et然后提取的基因组 DNA质量也较好，电泳条带明晰而锐利，弥散降解带较少。后两种处理 方法对黄鳝肌肉组织中DNA酶活性降低显著，因此提取的肌肉组织基因组DNA质量较高，可以有力支持后续的酶 切、PCR扩增等分子生物学实验。 关键词：酒精和冷冻处理 黄鳝肌肉组织 基因组DNA提取 中图分类号：Q781 文献标志码：A 文章编号：1671—8755(2012)01—0077—05 Effects of Ethanol an d Cryopreservation on the Extraction of Genomic DNA from Muscle Tissue WANG Hong—ying (School ofMaterials Science and Engineering，Southwest Unive~ity ofScience and Technology， Mianyang 621010，S&huan，China) Abstract：The quality of extracted genomic DNA exhibits key effects on such molecular biological expefi— ments as gene amplification，restriction endonuclease digestion and genome sequencing．Although tradi— tional methods are effectively used to isolate genomic DNA from muscle tissues，yet different processing of muscle tissues of swamp eel with ethanol and cryopreservation have significant effects 0n the quality of ex— tracted genomic DNA．The muscle tissues of swamp eel cryopreserved at一8O ℃ for several days were thawed and processed with 75％ ethanol，from which genomic DNA extracted with traditional methods was severely degraded．However，genomic DNA directly isolated from tissue of swamp eel cryopreserved at一 8O cI=for several days was slightly degraded and comparatively integra1．In other experiment ． fresh muscle tissue from sample of swamp eel were immersed in 75％ ethanol and cryopreserved at一80 cc for several days，from which genomic DNA isolated was also of higher quality with sharp while slightly dispersed bands in electrophoresis detection．Therefore，the latter two experiments decreased the activity of DNAase and the extracted DNA of higher quality could be used for such molecular biology experiments as enzyme digestion and PCR amplification． Key words：Ethanol and cryopreservation；Muscle tissue of swamp eel；Genomic DNA；Quality of ex— tracted DNA 收稿日期：2011—10—21 基金项目：四川省教育厅重点项 目(08ZA010)。 作者简介：汪虹英(1975一)，女，助教，主要从事有机化学与生物化学研究。E—mail：wanghongying0816@126．coln。 万方数据 78 西 南 科 技 大 学 学 报 第27卷 在分子生物学实验中基因组 DNA的提取是进 一 步研究基因组结构、功能、指纹遗传标记等的第一 步，所提取 DNA的完整性和纯度是后续诸多复杂高 级实验分析成败的关键。目前从动物肌肉组织提取 DNA的经典方法已经很成熟。对于样品的要求最好 将获取的新鲜肌肉组织立即进行碎化处理后消化蛋 白 J。但是在科研工作中，直接在实验室获取动物 肌肉组织的样品较少，绝大多数具有较高科研价值 的样品是在远离实验室的地方获取。所以，如何从 各种方法保存的样本 中提取到高质最的基 因组 DNA，一直是动物分子生物学科研工作者关注的技 术问题 J。动物的肌肉、心脏、肝、肾、脾等器官组 织都是 DNA的良好来源．其中肝脏的 DNA虽然产 量最大，但肝脏中丰富的基因组 DNA酶对提取的 DNA降解比较严重，肌肉组织则由于具有相对少量 的DNA酶而使得提取的 DNA质量较好，尤其是新 鲜组织的DNA产量高，质量好 J。在野外，一般不 具备马上提取 DNA的条件，而且从外地将大量采集 的鲜活样品带到实验室十分困难或不可能，而合理 有效和简便易行的处理方法对于野外采集的动物组 织样品中 DNA的完整保存具有关键影响，因此科研 工作者探索了一些新鲜样品保存方法。Hillis等 (1990)认为新鲜组织最好的保存方法是冷冻，马上 和液氮或干冰保存在一起 J。Seutin等(1991)认为 含有 20％的二甲基亚砜和0．25 M EDTA的氯化钠 饱和溶液(pH 8．0)能够很好较长期地保存鸟类组 织样品，但是提取的基因组 DNA仍然有一定程度的 降解且这种溶液配制比较繁琐 J。Muralidharan和 Wemmer(1994)通过抑制样品中微生物与 DNA酶 的方法保存组织样，但是还是无法有效抑制DNA的 降解 J。Lea1．Klevezas等(2000)用 20％的乙二醇 一 丙二醇溶液(1：1)保护组织细胞，提取的DNA 质量较好且相对完整，但是不能长久保存 。王义 权等(1999)认为使用含50 mmolfL EDTA的75％乙 醇作为固定剂保存样品，不影响DNA的提取和扩增 结果 ]。刘保忠等(2001)研究明，海湾扇贝采用 冷冻保存和 75％乙醇固定的样品可以得到很好的 DNA，其质量和得率与鲜活样品没有显著差异 J。 张海琪等(2002)对大黄鱼肌肉样品的研究结果与 上述类似 1 。张建珍等(2004)认为保存完好的干 标本、一20℃冷冻标本和 100％乙醇浸泡标本是蝗 虫分子系统学研究中首选的 3种保存方式 。综 上所述，目前还没有找到肌肉组织样品的最佳处理 方法，本实验通过对肌肉组织的冷冻和酒精双重处 理及其分析提取基因组 DN A的质量来寻求肌肉组 织处理较理想的方法。 1 材料与方法 1．1 实验材料及其处理 野生黄鳝 15尾，从绵阳市青义镇周边水塘捕 捉。随机分为3组，每组 5尾，进行酒精和 一80℃ 超低温冷冻处理。第 1组：编号 1～5，直接将5尾 黄鳝个体 一8O℃超低温冷冻数 日，然后解冻、取肌 肉组织放人 75％酒精处理后提取基因组 DNA。第 2组：编号6一l0，直接将 5尾黄鳝个体 一80℃超低 温冷冻数 Et，直接取材提取基因组 DNA。第 3组： 编号 1I～15，活体采取的新鲜肌肉组织样品经过 75％酒精处理，在 一80％超低温冷冻数Et，然后提取 基因组 DNA。 1．2 实验试剂及其配方 (1)ddH O：超纯灭菌水。 (2)SE缓冲液：25 mM NaC1，75 mM EDTA(pH 8．0)，1％ (m／V)SDS。 (3)SDS(20％)：SDS 20 g，加 80 mL ddH2O，68 。【=加热溶解，定容至 100 mL，灭菌后室温保存。 (4)氯仿：国产分析纯。 (5)70％酒精：700 mL无水乙醇加 ddH20定容 至 1 000 mL。 (6)1×TE (pH 8．0)：10 mM Tris—Cl (pH 8．0)，1 mM EDTA(pH 8．0)(配置方法：10 mL 1M Tris—C1(pH 8．0)，2 mL 0．5 M EDTA加至0 800 mL ddH：O中，充分混匀，定容至 1 L)。 (7)EB(10 mg／mE)：1 g EB，ddH2O 100 mL，旋 涡振荡器上充分振荡 3 h以上至完全溶解后，1．5 mI 离心管分装，遮光保存。 (8)5×TBE：Tris 54 g，0．5％ EDTA(pH 8．0) 20 mL，27．5 g硼酸，ddH2O 800 mL，完全溶解后，定 容至 1 000 mL，灭菌后室温保存(工作液稀释成 1×)。 1．3 处理后肌肉基因组 DNA的提取 肌肉基因组 DNA的提取参照 Cai等(2007)所 用方法 ¨。 (1)从每一尾黄鳝剪下的肌肉组织用灭菌的超 纯水洗涤一次，用剪刀将肌肉组织剪碎，并加入 sE 万方数据 第 1期 汪虹英：酒精和冷冻处理对肌肉组织基因组 DNA提取的影响 79 缓冲溶液500 IxL，充分震荡摇匀。 (2)在每个样品中加入 l6 L的蛋白酶 K，60 。I=水浴消化 5 h后，加入 165 IzL预热的6 mol／mL NaC1溶液，充分混合。 (3)将样品放在冰上，加入氯仿500 txL，将离心 管用手摇动 10 min。 (4)在4℃，11 000 r／rain的高速冷冻离心机中 离心 10 min后取出。 (5)可以看到离心管中分为 3层，上面的水相 用移液枪小心转移到另一无菌的离心管中，编号，加 入低温处理的无水乙醇(加满为止)，轻轻上下晃 动，直到 DNA析出，再置于冰上 20 min。 (6)再在4℃，14 000 r／min的高速冷冻离心机 中离心 10 rain，取出，倒掉上层液体，再加人70％无 水乙醇用手指弹起在底部的 DNA，进行充分洗涤。 (7)重复洗涤一次，将离心管倒置干燥约 2 h。 (8)加入 100 IxL灭菌超纯水，保存于 4℃的冰 箱中12 h以上，使其完全溶解待测。 1．4 提取基因组 DNA的质量检测 (1)琼脂糖凝胶电泳检测 取 1 IzL基 因组 DNA提取产物，加 1 溴酚蓝在 1％琼脂糖凝胶上 电泳，然后在凝胶成像系统拍摄电泳图谱。 (2)紫外分光光度检测 取 2 IxL基因组 DNA 提取产物，稀释 100倍用紫外可见分光光度计 (澳 大利亚GBC科学仪器有限公司GBC一916型)，测 定样品的 OD260 nm及 OD280 lln3值。 2 结果与讨论 2．1 不同处理方法的肌肉组织 DNA提取效果比较 9尾黄鳝个体的新鲜肌肉组织提取的 DNA电 泳图谱来 自以前的实验结果(未发表)。本次实验 1 2 3 4 5 6 7 8 9 l0 11 12 中 l5尾黄鳝个体的肌肉组织用 3种方法处理后用 经典方法提取肌肉组织基因组 DNA，提取过程中有 1个个体样品由于离心管破裂而丢失，因此成功提 取 DNA的有 14个个体的样品，通过 1％的琼脂糖 凝胶电泳检测可以看出提取基因组 DNA完整性和 降解程度 (图 1)。 直接取材的新鲜肌肉组织提取的基因组 DNA 完整性好，电泳后9个个体的电泳图谱中DNA条带 完整、锐利，没有拖带或弥散带(图 1 A)。经过 一80 ℃超低温冷冻数日的黄鳝样品解冻，取肌肉组织放 入75％酒精处理后提取的基因组 DNA完整性差、 降解厉害，尤其是2号和4号个体的DNA几乎被全 部降解 (图 1 B)。经过 一80℃超低温冷冻数日的 黄鳝样品，直接取肌肉组织提取的基因组 DNA比较 完整、降解程度低，其中8，9和10号个体的DNA完 整性较好 (图 1 C)。活体采取的黄鳝新鲜肌肉组 织样品经过75％酒精处理，在一8O℃超低温冷冻数 日，然后提取的基因组 DNA质量也较好，电泳条带 明晰而锐利，弥散降解带较少，12—14号样品中，只 有12号的DNA有一定程度的降解，其余3个样品 的DNA完整性较好 (图 1 D)。 总之，与新鲜肌肉组织中DNA提取效果比较， 酒精和冷冻处理后提取的黄鳝肌 肉组织基 因组 DNA均有一定程度降解，电泳图谱中拖带或弥散带 较明显。 采用紫外分光光度检测的结果可以看出，以上 3 种方法处理后提取 DNA样品的OD 260 nm／OD 280 nln 值基本在1．8～2．0之间，DNA的纯度较高 (表1)。 因为3种方法处理后肌肉基因组 DNA提取的方法为 经典方法-3 J，所以提取DNA的纯度较高，上述不同的 样品处理方法不会影响提取DNA的纯度。 1 3 14 】5 16 l7 】8 】9 20 2】 22 23 隧圈闺 注：1 23：不同的黄鳝个体；A：新鲜的肌 肉组织样品提取的基因组DNA；B：经过一8O℃超低温冷冻的样品解冻．取材放入 75％ 酒精处理后提取基因组DNA；C：~L~-80℃超低温冷冻的样品直接取材提取基因组 DNA；D：活体采取的新鲜样品经过75％ 酒精 处理，在-80℃超低 温冷冻数 日．然后提 取基 因组 DNA。 图 1酒精和冷冻不同处理方法对黄鳝肌肉组织 DNA提取效果的影晌 万方数据 西 南 科 技 大 学 学 报 第27卷 表 1 酒精和冷冻处理提取的黄鳝基因组 DNA测定结果 2．2 不同处理方法对 DNA提取影响的原因分析 DNA的质量包括完整性和纯度。DNA提取前 后的核酸酶的作用及 DNA提取过程中的机械剪切 等都会造成 DNA降解，从而影响提取的 DNA的完 整性。细胞内DNA的降解，主要是一种内源性核酸 内切酶的作用，发生在生物死亡后的几个小时内。 提取过程中的生物降解、过酸、过碱、机械剪切、高温 等有害因素都会造成 DNA的降解。机械剪切力是 主要的物理降解因素，包括强力高速的溶液震荡、搅 拌、使溶液快速地通过狭长的孔道、细胞突然置于低 渗液中、细胞爆炸式的破裂以及 DNA样品的反复冻 融 。因此，DNA提取过程中动作应尽量缓慢轻 柔，在保证去除蛋白的前提下，尽量减少酚／氯仿抽 提次数，简化操作步骤，缩短提取过程，存储的DNA 尽量减少反复冻融次数，从各个环节最大限度减少 对 DNA的破坏 。 肌肉组织含有许多肌纤维，因此，肌肉组织提取 的DNA蛋白质含量会明显高于肝脏组织提取的结 果。由于肌肉组织比肝脏组织含有较少的降解DNA 的核酸酶，所以更容易得到更大片段的高质量 DNA。乙醇作为常用固定剂，能较快地渗人细胞内 部，促使蛋白质变性，各种水解酶很快失活，从而达 到保存 DNA的作用。本实验第 1种处理方法中， 一 8O℃超低温冷冻的样品在解冻过程中DNA核酸 酶仍然有活性会导致部分 DNA降解，而且在后续 75％酒精处理时，没有及时渗入细胞就开始碎化组 织处理，此过程中仍然有DNA降解。第2种处理方 法中，经过 一80℃超低温冷冻的样品直接取材碎化 组织处理提取基因组 DNA，此过程有效抑制了DNA 酶的活性，待样品解冻时已经加入了蛋白裂解液。 第3种处理方法中，活体采取的新鲜样品经过75％ 酒精处理时酒精渗入了细胞，接着在一80℃超低温 冷冻数日，然后提取基因组DNA，此过程中的酒精 和低温也有效抑制了 DNA酶的活性。但是与第 2 种方法相比较，第 3种方法对于 DNA酶活性的抑制 效果更佳，因为新鲜样品从取材到提取的整个过程 中均有效抑制DNA降解，而第2种方法中取材后的 样品在被冷冻以及解冻过程中仍会有 DNA酶发挥 降解作用。总之，后两种处理方法对黄鳝肌肉组织 中DNA酶活性降低显著，因此提取的肌肉组织基因 组DNA质量较高，可以有力支持后续的酶切、PCR 扩增等分子生物学实验，此结果与罗晨玲等(2001) 关于乙醇对DNA没有或仅有较弱的降解作用的研 究结果一致 引。 3 结论 本研究证明对于肌肉组织进行不同的酒精和冷 冻处理会显著影响提取 DNA的完整性，但是不会影 响 DNA的纯度。经过 一80℃超低温冷冻数 日的黄 鳝样品解冻，取材放人75％酒精处理后提取的基因 组 DNA完整性差、降解厉害。经过 一80℃超低温 冷冻数 日的黄鳝样品直接取材提取的基因组 DNA 比较完整、降解程度低。活体采取的黄鳝新鲜肌肉 组织样品经过75％酒精处理，在一8O℃超低温冷冻 数 Et，然后提取的基因组 DNA质量也较好，电泳条 带明晰而锐利，弥散降解带较少。 参考文献 [1] CAI X，GOU X，ZENG F，et a1．Mitochondrial DNA Di． versity of MonopterLl$albus from the Siehuan Basin of China[J]．Biochemical Genetics，2008，46(9一10)： 583—589． [2] 董明，宫月华，王兰，等．DNA提取的应用与相关技 术分析 [J]．遗传，2003，25(2)：205—207． [3] 陈宏．基因工程实验技术(面向21世纪课程教材) [M]．中国农业出版社，2005． [4] HILLIS D M，MORITZ C．Molecular Systematics[M]． Sinauer Associates Inc： Sundedand， Massachusetts， USA，1990：36—38． [5] SEUTIN G，WHITE B N，BOAG P T．Preservation of a． 万方数据 第 1期 汪虹英：酒精和冷冻处理对肌肉组织基因组 DNA提取的影响 81 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