双重荧光定量RT_PCR快速检测甲型和甲型H1N1流感病毒

·918· 疾病监测 2010 年 11 月 30 日第 25 卷第 11 期 Disease Surveillance，Nov. 30，2010，Vol. 25，No. 11 http://www． jbjc． org·DOI:10． 3784/ j． issn． 1003 - 9961． 2010． 11． 022 作者单位:湖州市疾病预防控制中心，浙江 湖州 313000 作者简介:沈月华，女，浙江省湖州市人，主要从事流感监测工作 通信作者:沈月华，Tel:0572 － 2760126，Email:hzcdcwsw@ 126． com 收稿日期:2010 － 08 － 11 ◇技术与方法◇ 双重荧光定量 RT-PCR快速检测甲型 和甲型 H1N1 流感病毒 沈月华，纪蕾，徐德顺，韩建康，吴晓芳，查赟峰，陈莉萍 摘要: 目的 建立双重荧光 RT-PCR 快速检测方法，用于甲型和甲型 H1N1 流感病毒的同时检测和鉴别诊断。 方法 针对甲型流感病毒 M基因和甲型 H1N1 流感病毒 NA基因的保守区序列分别设计特异性引物和 Taqman探 针，建立优化双重荧光 RT-PCR反应体系，评价所建双重 RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑 似流感或甲型 H1N1 流感含漱液标本检测。结果 该方法对甲型、甲型 H1N1 流感病毒检测具有高度特异性，检出 限分别为 0. 01 TCID50和 0. 1 TCID50，具有较好的稳定性。可从疑似流感或甲型 H1N1 流感患者含漱液中直接检测 到流感病毒核酸。结论 本研究建立的双重荧光定量 RT-PCR可以同时准确检测甲型和甲型 H1N1 流感病毒，灵 敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。 关键词: 甲型流感病毒;甲型 H1N1 流感病毒;双重荧光 RT-PCR;检测 中图分类号:R511. 7 文献标识码:A 文章编号:1003 － 9961(2010)11 － 0918 － 04 Simultaneous detection of influenza A viruses and 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus by multiplex real-time RT-PCR SHEN Yue-hua，JI Lei，XU De-shun，HAN Jian-kang，WU Xiao-fang，ZHA Yun-feng，CHEN Li-ping． Huzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention of Zhejiang Province，Huzhou 313000，Zhejiang，China Corresponding author:SHEN Yue-hua，Email:hzcdcwsw@ 126． com Abstract: Objective To establish a TaqMan-based multiplex real-time PCR assay for the rapid and simultaneous detection of influenza A viruses and 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus． Methods The specific primers and probes were designed in the conserved region of the M gene for influenza A viruses and the NA gene for 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus，respectively． The reaction conditions were optimized and the sensitivity，specificity and stability of the assay were evaluated． The clinical specimens collected from the patients were detected by this assay． Results The results showed that the assay possessed high specificity for influenza A viruses and 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus detection and the detection limit was up to 0. 01 TCID50 and 0. 1 TCID50 respectively． The viral RNA could be directly detected from the clinical specimens by this assay． Conclusion The multiplex real-time RT- PCR assay can provide rapid，sensitive and reliable detection of influenza A viruses and 2009 pandemic influenza A (H1N1)virus and is useful in the detection of influenza virus． Key words: influenza A viruses;2009 pandemic influenza A (H1N1)virus;multiplex real-time PCR;detection 流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、 危害重的主要是甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为 主，常可引起较大范围的流行［1 － 3］。近期流行的甲 型 H1N1 流感病毒的致病力类似于季节性流感，该 病毒是北美和欧亚两个地区猪流感病毒的混合体， 机体本身对其缺乏免疫保护能力，普通人群容易感 染和发病，患者需要及时隔离并进行治疗［4］，因此 对甲型 H1N1 流感和普通季节性流感的鉴别诊断尤 为重要。 目前检测流感病毒的方法除传统的病毒 ELISA 检测和病毒分离、定型方法外，还有基因芯片、实时 荧光 RT-PCR 等，特别常规的病毒培养法(9 ～ 11 d 龄鸡胚培养法与 MDCK 细胞培养法) ，虽然该方法 准确、可靠、稳定，但对标本中的病毒含量要求高， 必须达到鸡胚或 MDCK 培养法所需要的病毒含量， 而且对标本的采集，运输，保存的条件要求高，试验 繁琐，费时，要确诊至少要 10 ～ 15 d。故在实际应用 中每种方法都存在各自的局限性，多数方法不能同 时检测多个型别或亚型。本研究采用双重荧光定 量 RT-PCR 技术，建立了一种可同时进行甲型流感 病毒、甲型 H1N1 流感病毒快速鉴定的新技术，在实 际应用中取得了很好的效果。 1 材料与方法 1. 1 病毒株 流感病毒株 A3 /浙江南浔 /1120 / 疾病监测 2010 年 11 月 30 日第 25 卷第 11 期 Disease Surveillance，Nov. 30，2010，Vol. 25，No. 11 ·919· http://www． jbjc． org·DOI:10． 3784/ j． issn． 1003 - 9961． 2010． 11． 022 2009、B /吴 兴 区 /1106 /2010、B /浙 江 南 浔 /142 / 2010、 H1N1 /SWL184 /2010、H1N1 /SWL1613 /2009 由本中心实验室提供，A1 /北京 /56 /97、麻疹病毒 株、风疹病毒株、呼吸道合胞病毒、副流感病毒Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ等病毒株和 H5N1 流感病毒核酸由浙江省疾 病预防控制中心(CDC)提供。 临床标本检测由湖州市流感监测哨点医院和 各县 CDC采集的疑似流感病毒患者上呼吸道分泌 物标本 20 份、疑似甲型 H1N1 流感病毒患者上呼吸 道分泌物标本 20 份。 1. 2 主要试剂和仪器 ABI7300 实时荧光 RT-PCR 仪，RNA 提取试剂:RNeasy Mini Kit为德国 QIAGEN 公司产品，TaKaRa OneStep RNA PCR Kit 为宝生物 (大连)有限公司产品。 1. 3 引物探针的设计与合成 从 GenBank 上分别 下载甲型和甲型 H1N1 型流感病毒基因序列，作同 源性比对后，在甲型流感病毒的 M基因保守区设计 特异性引物和 TaqMan探针，探针 5' 端标记 FAM荧 光报告基团;在甲型流感病毒 H1N1 的 NA 基因保 守区设计特异性引物和 TaqMan 探针，探针 5'端标 记 ROX荧光报告基团。引物和探针均委托宝生物 工程(大连)有限公司合成，具体序列特征和探针标 记如表 1 所示。 表 1 荧光 PCR引物和探针 Table 1 Primer and probe oligonucleotides used for real-time PCR 目的基因 引物或探针 序列(5' ～ 3') M基因 甲型流感病毒 上游引物 AAG ACA AGA CCA ATY CTG TCA CCT CT 下游引物 TCT ACG YTG CAG TCC YCG CT 探针 ROX-TYA CGC TCA CCG TGC CCA GTG-TAMRA NA基因 甲型 H1N1 流感病毒 上游引物 GTT AAC ATC AGC AAC ACC AAC TTT G 下游引物 GAG AGG AAT TGC CCG CTA ATT 探针 FAM- TGC TGG ACG TCA GTG GTT TCC GTG-TAMRA 1. 4 RNA的提取 甲型和甲型 H1N1 流感病毒分 别选取代表毒株 A3 /浙江南浔 /1120 /2009、H1N1 / SWL184 /2010 分别滴定后(103 TCID50 /ml)作为参 考株，将其稀释至 1000、100、10、1、0. 1、0. 01、0. 001 TCID50每个反应管。病毒 RNA 的提取采用德国 QIAGEN 公司的 Reansy Mini Kit，按试剂盒说明 书提取。 1. 5 双重荧光 RT-PCR 方法的建立和条件优化 双重荧光RT-PCR 的反应体系参照 TaKaRa 公司的 One Step RNA PCR Kit说明书配制，采用 25 μl的反 应体系，将甲型和甲型 H1N1 流感病毒上、下游引物 及探针同时加入反应体系中，于 ABI7300 荧光定量 PCR仪上进行反应。引物和探针浓度分别选用 0. 2、0. 4、0. 6、0. 8 和 1. 0 μmol /L，利用矩阵法筛选 最佳引物、探针浓度比，以期对甲型和甲型 H1N1 流 感病毒核酸的检测都可获得较低的 Ct(Threshold cycle，Ct)值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。 1. 6 双重荧光 RT-PCR 方法的特异性试验 利用 建立起的双重荧光 RT-PCR 反应体系分别对 13 份 相关病毒核酸进行检测，其中 5 份甲型病毒核酸、2 份甲型 H1N1 病毒核酸和 8 份其他相关呼吸道病毒 核酸，验证其特异性。 1. 7 双重荧光 RT-PCR 方法的灵敏度检测 甲型 流感病毒代表毒株 A3 /浙江南浔 /1120 /2009、甲型 H1N1 流感病毒代表毒株 H1N1 /SWL1613 /2009 滴 定后(103 TCID50 /ml) ，分别将其进行 10 倍系列稀释 (0. 001 ～ 103TCID50 /ml)。提取病毒 RNA 后进行 RT-PCR检测，观察其最低的检测限。 1. 8 双重荧光 RT-PCR 方法的重复性试验 对 10 倍系列稀释的甲型、甲型 H1N1 流感病毒(1 ～ 103TCID50 /ml)每个稀释度平行重复 3 次，计算各稀 释度 Ct值的平均值及变异系数，以评价反应体系的 稳定性。 1. 9 双重荧光 RT-PCR 方法的临床标本验证 利 用所建立的双重荧光 RT-PCR方法对临床上疑似流 感或甲型 H1N1 流感的 40 份上呼吸道分泌物标本 进行检测。 2 结果 2. 1 双重荧光 RT-PCR 反应体系的条件优化 在 试剂盒推荐的反应参数基础上，通过比较不同引 物、探针浓度条件(0. 2 ～ 1. 0 μmol /L)扩增甲型和 甲型 H1N1 流感病毒核酸所得的 Ct 值及荧光强度 增加值。结果表明甲型和甲型 H1N1 引物浓度各 1. 0 μmol /L，探针浓度各 0. 2 μmol /L，扩增效果最 好;优化后的反应程序如下:42 ℃，30 min 反转录; 95 ℃，5 min终止反转录;95 ℃ 15 s，62 ℃ 31 s，扩 增 40 个循环，在 57 ℃进行 FAM 和 ROX 的双通道 荧光检测。 2. 2 双重荧光 RT-PCR方法的特异性 利用建立 起的双重荧光 RT-PCR反应体系分别对 13 份相关 病毒核酸进行检测，结果，5 份甲型流感病毒核酸 和 2 份甲型 H1N1 流感病毒核酸分别在 FAM 和 ROX检测通道出现的特异性荧光扩增曲线，呈阳 性反应。而其他 8 份其他相关呼吸道病毒核酸则 ·920· 疾病监测 2010 年 11 月 30 日第 25 卷第 11 期 Disease Surveillance，Nov. 30，2010，Vol. 25，No. 11 http://www． jbjc． org·DOI:10． 3784/ j． issn． 1003 - 9961． 2010． 11． 022 均没有荧光信号产生，为平直的线，判为阴性。 2. 3 双重荧光 RT-PCR 方法的检测灵敏度 将已 测定滴度的代表毒株 A3 /浙江南浔 /1120 /2009、甲 型 H1N1 流感病毒代表毒株 H1N1 /SWL1613 /2009 滴定后病毒培养液进行 10 倍系列稀释(0. 001 ～ 103TCID50 /ml) ，抽提核酸后进行双重荧光 RT-PCR 检测。结果显示，该方法检测甲型、甲型 H1N1 型流 感病毒的灵敏度分别达到 0. 01 TCID50 和 0. 1 TCID50。见图 1、2。 图 1 双重荧光 RT-PCR检测 A型流感病毒核酸灵敏度 Figure 1 Sensitivity of multiplex real-time quantitative PCR to detect influenza A viruses 注:1:1000 TCID50;2:100 TCID50;3:10 TCID50;4:1 TCID50; 5:0. 1 TCID50;6:0. 01 TCID50 图 2 双重荧光 RT-PCR检测甲型 H1N1 流感病毒核酸灵敏度 Figure 2 Sensitivity of multiplex real-time quantitative PCR to detect influenza A and 2009 pandemic influenza A(H1N1)viruses 注:1:1000 TCID50;2:100 TCID50;3:10 TCID50;4:1 TCID50; 5:0. 1 TCID50 2. 4 多重荧光 RT-PCR 方法的重复性 同一次实 验中，对 10 倍系列稀释的甲型、甲型 H1N1 型流感 病毒 RNA(1 ～ 103TCID50 /ml)进行双重荧光 RT- PCR检测，每个稀释度各做 3 个平行反应管，结果 每个稀释度核酸样品的 3 个平行反应获得的 Ct 值 变异系数(CV)均在 2. 05%以下(表 2)。说明本研 究所建立的双重荧光 RT-PCR 检测方法重复性较 好，可对甲型、甲型 H1N1 流感病毒进行稳定、可靠 的检测。 表 2 双重荧光 RT-PCR检测甲型、甲型 H1N1 流感病毒的重复性 Table 2 Repeatability of multiplex real-time quantitative PCR to detect influenza A and 2009 pandemic influenza A (H1N1)viruses specimens TCID50 /ml Replicate(Ct value) Ct1 A H1N1 Ct2 A H1N1 Ct3 A H1N1 Ct mean A H1N1 CV(%) A H1N1 1000 20. 36 21. 13 20. 06 21. 22 20. 15 21. 04 20. 19 21. 25 0. 15 0. 17 100 24. 70 23. 85 24. 99 24. 26 24. 47 23. 66 24. 72 23. 92 0. 26 0. 31 10 27. 39 27. 56 28. 24 26. 14 26. 14 28. 00 27. 25 27. 23 1. 06 0. 97 1 29. 77 31. 40 30. 47 28. 03 28. 03 31. 74 29. 42 30. 39 1. 25 2. 05 2. 5 多重荧光 RT-PCR 方法的临床标本验证 用 本文建立的双重荧光 RT-PCR 对 20 份临床上疑似 流感和 20 份疑似甲型 H1N1 流感的呼吸道分泌物 标本进行检测，分别检测到甲型流感阳性 9 份，甲型 H1N1 流感 6 份。用《甲型 H1N1 流感病毒实验室 检测技术》推荐的方法进行单重荧光定量 RT- PCR方法检测，与双重荧光 RT-PCR 完全相符。这 进一步说明本文建立的双重荧光 RT-PCR能应用于 临床标本的检测。 3 讨论 作为负链分节段 RNA病毒，甲型流感病毒基因 组由 8 个片段组成，分别负责编码 RNA 聚合酶 (PB2、PB2、PA)、表面抗原血凝素(HA)、核蛋白 (NP)、表面抗原神经氨酸酶(NA)以及基质蛋白 (M)和非结构蛋白(NS)。其中 M 蛋白和 NP 蛋白 是流感病毒分型的主要依据，具有型特异性。表面 抗原 HA和 NA 是甲型流感病毒分亚型的依据，目 前已发现有 15 种亚型的 HA(H1 ～ H15)和 9 种亚 型的 NA(N1 ～ N9) ，其中 H1N1、H2N2、H3N2 亚型 主要感染人类，其他亚型的自然宿主是多种禽类和 动物［5］。由于甲型流感病毒表面抗原极易发生变 异，并且不同亚型的病毒之间还可发生基因片段的 重组，因而甲型流感病毒常可造成世界范围内的流 感大流行。2009 年世界范围内暴发的甲型 H1N1 流感病毒即是人源、禽源和猪源甲型流感病毒基因 疾病监测 2010 年 11 月 30 日第 25 卷第 11 期 Disease Surveillance，Nov. 30，2010，Vol. 25，No. 11 ·921· http://www． jbjc． org·DOI:10． 3784/ j． issn． 1003 - 9961． 2010． 11． 022 片段的重组体，根据对其全基因组序列进行分析， 发现其 HA和 NA基因序列分别与北美猪 H1N1 和 欧洲猪 H1N1 同源性最高［6］。 由于新近流行的甲型 H1N1 流感病毒在世界范 围内传播速度较快，感染范围较广，少数病例还可 由于严重的并发症发生死亡，目前中国将其纳入乙 类传染病并按甲类传染病管理。因此对甲型 H1N1 流感疑似患者进行病原学的快速检测及排查，对于 及时隔离患者对其进行对症治疗以及控制病毒传 播具有重要意义。目前大部分实验室对甲型 H1N1 流感病毒的检测主要是参照《甲型 H1N1 流感病毒 实验室检测技术方案》推荐的检测程序，首先利用 甲型流感病毒通用引物对疑似标本进行检测，阳性 标本再进一步用各亚型特异性引物进行分型。为 了对甲型流感病毒和新近流行的甲型 H1N1 流感病 毒进行特异性的快速检测，本研究分别选取甲型流 感病毒具有型特异性的 M基因和亚型特异性的 NA 基因作为检测靶序列，建立了可同时对甲型和甲型 H1N1 流感病毒进行检测的双重荧光 RT-PCR 检测 方法，能够在 2 ～ 3 h 内非常准确地对甲型和甲型 H1N1 流感病毒进行鉴定分型，与传统的鸡胚分离 法和普通 RT-PCR 相比具有更高的灵敏度［7，8］。特 异性试验表明该检测方法可成功检出人季节性 H1N1、人季节性 H3N2、新型甲型 H1N1 以及 H5N1 流感病毒，并且可同步对甲型 H1N1 流感病毒进行 准确的筛选定型，与乙型流感病毒及其他常见的呼 吸道相关病毒无交叉反应;灵敏度结果显示该方法 对甲型流感病毒和甲型 H1N1 流感病毒的最低检出 限分别可达 0. 01 TCID50和 0. 1 TCID50，并且检测结 果稳定、可靠。 我们利用本研究建立的双重荧光 RT-PCR 方法 和方案推荐的检测程序，分别对 40 份收集到的流感 和甲型 H1N1 流感疑似病例的上呼吸道分泌物标本 进行检测，结果显示两种方法的检测结果符合率为 100%。而利用本研究建立的双重荧光 RT-PCR 反 应体系，通过单管反应即可对疑似病例标本进行甲 型流感病毒的检测并同步对存在的甲型 H1N1 流感 病毒进行筛选定型，大大缩短了检测时间，提高了 甲型 H1N1 流感疑似病例实验室排查的检测效率。 以上研究表明，本研究建立的甲型和甲型 H1N1 流感病毒双重荧光 RT-PCR 检测技术特异性 好、灵敏度高，并且检测快速、操作简单，可用于临 床甲型流感病毒和甲型 H1N1 流感病毒暴发中疑似 病例的快速排查，对于有效控制流感疫情及其流行 病学监测具有重要的实用价值。 参 考 文 献 ［1］ Wang H，Huang QH，Peng CM，et al． Application of fluorescent real-time polymerase chain reaction in detecting influenza A virus ［J］． Journal of Tropical Medicine，2006，6(10) :1077 － 1080． (in Chinese) 王海，黄茜华，彭春梅，等．实时荧光 PCR方法在 A 型流感病毒 检测中的应用［J］．热带医学杂志，2006，6(10) :1077 － 1080． ［2］ Yan XG，Peng GW，Zhang X，et al． Influenza activity and antigenic characterization in Guangdong in 2003［J］． Chinese Journal of Public Health，2005，21 (10) :1174 － 1175． (in Chinese) 鄢心革，彭国文，张欣，等 . 2003 年广东省流感病毒的流行概况 及特征［J］．中国公共卫生，2005，21(10) :1174 － 1175． ［3］ Liu Y，Lu EJ，Yang WL，et al． Surveillance of influenza virus in Guangzhou，2004［J］． Chinese Journal of Epidemiology，2006， 27(2) :182 － 183． (in Chinese) 刘远，鲁恩洁，杨卫路，等． 广州市 2004 年流感病毒监测分析 ［J］．中华流行病学杂志，2006，27(2) :182 － 183． ［4］ Clavijo A，Tresnan DB，Jolie R，et al． Comparison of embryonated chicken eggs with MDCK cell culture for the isolation of swine influenza virus［J］． Can J Vet Res，2002，66:117 － 121． ［5］ Nicholson KG，Wood JM，Zamnon M． Influenza［J］． Lancet， 2003，362:1733 － 1745． ［6］ Yin JH，Xie JX，Han L，et al． Recombination analysis of full- length genomic sequences of novel influenza virus A /H1N1 in 2009 pandemic ［J］． Academic Journal of Second Military Medical University，2009，6(30) :637 － 640． (in Chinese) 殷建华，谢佳新，韩磊，等 . 2009 年新型甲型 H1N1 流感病毒全 基因组序列重组分析［J］． 第二军医大学学报，2009，6 (30) :637 － 640． ［7］ Lu YY，Yan JY，Xu CP，et al． TaqMan-MGB-based real-time RT- PCR assay for quick detection of influenza A virus［J］． Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2007，17(1) :46 － 48． (in Chinese) 卢亦愚，严菊英，徐昌平，等． TaqMan-MGB 荧光定量反转录聚 合酶链反应快速检测 A 型流感病毒［J］． 中国卫生检验杂志， 2007，17(1) :46 － 48． ［8］ Lu YY，Yan JY，Feng Y，et al． TaqMan-based real-time PCR assay for quick detection of influenza B virus［J］． Zhejiang Journal of Preventive Medicine，2005，17(3) :1 － 3．(in Chinese) 卢亦愚，严菊英，冯燕，等． 荧光定量 RT-PCR 快速检测乙型流 感病毒核酸［J］．浙江预防医学，2005，17(3) :1 － 3．