吸烟对精子DNA碎片的影响

吸烟对精子 DNA碎片的影响 李 芃，李 丹，赵丽芬，宋世威，许 蓬，孙龙浩 ( 沈阳东方医疗集团菁华医院生殖中心，沈阳 110005) 摘 要: 目的 探讨男性不育症患者吸烟对精子 DNA碎片的影响。方法 采用精子染色质扩散 ( SCD) 实验 383 例男性不育患者精子 DNA碎片的比率，根据吸烟多少分组并进行比较研究。结果 吸烟 ＞ 20 支 /天组患者与吸烟≤20 支 / 天组患者及不吸烟组患者相比 DNA碎片率显著升高 ( P ＜ 0. 05) 。吸烟≤20 支 /天组患者与不吸烟组患者相比 DNA碎片率 没有明显差别。结论 吸烟对 DNA碎片率有影响，且吸烟量越大、时间越长、精子 DNA碎片率越高。 关键词: 吸烟; 精子 DNA碎片 中图分类号: R698. 2 文献标识码: B 文章编号: 1006 － 9534 ( 2011) 04 － 0100 － 02 不育症是一个重要的社会问题，最近的数据显示约 10% ～15%的育龄夫妇正面临这样的问题。男性不育占不孕不 育症的 40%。其中部分患者可能是由于精子 DNA或染色质 缺陷所致。精子 DNA结构损伤的比例增高预示着生育出现 异常或不育。DNA碎片比例如果在 30%以上，就可能是男 性不育的重要因素，有时尽管能够受孕发育成胚胎，但大多 数在早期发生自然流产。因此，对男性不育患者精子进行 DNA碎片，有助于探讨不育的原因，提供诊断依据。 关于吸烟和不育的关系的研究已有很多，研究者发现吸 烟与精液参数异常之间存在显著相关性，例如，吸烟可致精 子存活率下降、精子形态异常以及精子密度降低［1］。但目前 吸烟与精子 DNA碎片的关系报道较少，本研究对男性不育 症患者进行精子染色质扩散 ( sperm chromatin dispersion， SCD) 实验检测精子 DNA 碎片比率，并进行比较研究，以探 讨吸烟对精子 DNA碎片的影响。 资料与方法 一、临床资料 2009年 6 月 ～ 2010 年 6 月前来我院就诊的男性不育患 者 383 例，年龄 23 ～ 51 岁，平均( 32． 6 ± 5． 5) 岁，不育年限平 均( 6 ± 2． 6) 年。精液常规分析各项指标均符合 WHO 手册 中精液正常。有精索静脉曲张、酗酒、吸毒、生活或工作 环境有污染( 如高温、职业与化学有毒物质相关等) 的患者除 外。吸烟者烟龄均在 1 年以上。分为吸烟 ＞ 20 支 /天组; 吸 烟≤20 支 /天组;不吸烟组。 二、实验方法 采用 halosperm精子 DNA碎片检测试剂盒，其操作步骤 简述如下: ( 1 ) 精液标本用 PBS 稀释到 10 × 106 / ml ，取 40μl精液与琼脂凝胶按 1∶ 1 比例混匀，置于 1． 5 ml Eppen- dorf管内。( 2) 吸取 20μl 以上配置的精液置于冷却的载玻 片上，盖上盖玻片 4 ℃放置 5 min。( 3) 去除盖玻片，室温下 加入精子裂解液孵育 25 min。( 4) 标本片置于冲洗液冲洗 5 min。( 5) 然后置于按比例配置的乙醇中脱水。( 6 ) 空气自 然干燥后加入 Wright' s 染色剂染色，荧光显微镜下观察结 果。正常的精子 DNA产生扩散的光晕，而损伤的精子 DNA 则不产生或产生很小的光晕。 结果判断:计数 500 个精子，观察精子光晕大小。根据 光晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无光晕 4 个 等级，大和中光晕表示精子 DNA完整无碎片，小和无光晕表 示精子 DNA断裂为碎片。判断标准: 光晕与精子头直径比 例 ＞ 2 /3 为大光晕; 光晕与精子头直径比例 ＞ 1 /4，而≤2 /3 为中光晕;光晕与精子头直径比例≤1 /4 为小光晕［2］。 三、统计学分析 采用 SPSS 12. 0 软件系统，经 F 检验进 行统计处理。P ＜ 0. 05 为有显著性差异。 结 果 吸烟 ＞ 20 支 /天组患者 DNA 碎片率显著高于吸烟≤20 支 /天组患者及不吸烟组( P ＜ 0. 05) 。吸烟≤20 支 /天组患 者与不吸烟组患者相比 DNA碎片率有所升高但未达统计学 显著性差异。具体结果见表 1。 表 1 各组患者 DNA碎片率 组别 n DNA碎片率( % ) 吸烟 ＞ 20 支 /天( 1) 96 40． 7 ± 13． 9 吸烟≤20 支 /天( 2) 83 27． 3 ± 10． 4 不吸烟( 3) 204 22． 5 ± 11． 7 F 23. 17* q 1: 2 4． 58* q 1: 3 5． 62* * P ＜ 0. 05 讨 论 男性不育可由精液异常或激素改变的生物学损伤引起。 香烟烟雾中含有各种物质，包括尼古丁、一氧化碳、镉、苯并 吡、萘、放射性钋及其他致癌物质和诱变剂等，不仅可以造成 体细胞遗传物质的损伤，还可以透过血 －睾屏障影响生精细 胞发育，可导致精子 DNA链断裂增加［3］。 本组研究表明吸烟 ＞ 20 支 /天组患者 DNA 碎片率显著 高于吸烟≤20 支 /天组患者及不吸烟组，且吸烟量越大、时间 越长、精子 DNA碎片率越高。可能是长期大量吸烟，香烟中 的有害物质通过吸收进入血循环，经长期积累而致血循环中 的有害物质浓度逐渐增高，并干扰睾丸及附睾微循环和内环 境的物质交换，影响睾丸生精细胞的发育过程，改变了精子 在附睾中成熟所必须的生化条件，从而使精子本身的超微结 构发生改变，精子头部 DNA双螺旋结构发生断裂和解体［4］。 应用 SCD法检测不育患者精子 DNA碎片 ，具有重要的 临床意义和实用价值。但目前吸烟对精子 DNA碎片影响的 研究尚少，其作用机理仍不十分清楚，还有待进一步研究。 ( 下转第 58 页) ·001· 中国优生与遗传杂志 2011 年第 19 卷第 4 期 1 瘦素在子宫内膜表达存在差异( P ＜ 0. 01) ，异症组阴性结 果比对照组 1 计数明显增多，而随着阳性表达中，+ + +表 达计数要少于对照组 1。结果见表 2。 表 2 两组子宫内膜瘦素蛋白表达结果比较 组别 n 子宫内膜组织中瘦素 － + + + + + + 异症组 40 11 14 9 6 对照组 1 40 2 14 11 13 注:两组比较非参数检验 Mann － Whitney U法 P = 0. 007 3．内异症患者腹腔液瘦素水平与 AFS分期的关系 根据 AFS分期和结合临床实际情况，将内异症组患者Ⅰ ～Ⅱ期分为轻度亚组，腹腔液瘦素水平 634. 4 ± 42. 9。内异 症组患者Ⅲ ～Ⅳ期分为重度亚组，腹腔液瘦素水平 700. 9 ± 43. 9。两组水平进行比较有差异( P ＜ 0. 01 ) 。腹腔液瘦素 水平与轻度亚组和重度亚组进行两变量相关分析，相关系数 为 － 0. 641，P ＜ 0. 01。 讨 论 EMs是妇科常见病、多发病，以盆腔疼痛和不孕为主要 临床表现，病理过程复杂，发病机制至今仍未阐明。现在的 认为本病为多病因多基因的疾病，具免疫相关的慢性炎症表 现。瘦素由肥胖基因编码，分子量为 16kD，由 167 个氨基酸 残基组成，属于多肽激素，具有复杂广泛的生物学效应，国内 外的研究资料表明［5 － 8］瘦素与多系统疾病包含生殖系统疾 病相关，瘦素系统可在正常的子宫内膜表达，而 EMS 患者 中，瘦素系统表达可与正常子宫内膜表达情况不一致。由于 瘦素分子内部具长链螺旋结构，与 IL － 6、IL － 2、IL － 12 等炎 症因子相似，而且瘦素受体属于Ⅰ类细胞因子受体超家族成 员，与 gp130 信号转导亚单位及 LIF － R、G － CSF具高度同源 性，可借助激酶结构的连接蛋白，通过 JAK /STAT 途径进行 信号转导。通过信号转导瘦素可调节体内脂肪组织的含量， 进而对性激素水平进行间接调控，这一过程可能最终影响 EMS的发生、发展。而同时瘦素可通过各种内分泌、旁分泌、 自分泌的方式作用于多种组织上的特异性受体而发挥作用。 特别是通过对 EMS 腹腔微环境的免疫调节、对异位病灶侵 袭性生长的调节、对新生血管形成的调节、对 EMs 细胞凋亡 敏感性调节等影响 EMS疾病的发生和发展。 本研究结果表明瘦素血清水平在子宫内膜异位症患者 与对照组 1、2 水平并无大的差异，因此推测血清瘦素水平并 不是影响内异症发生及发展的根本原因。但腹腔液瘦素水 平则与对照组 1 出现明显差异( 对照组 2 因涉及医学伦理及 研究对象依从性问题并未做对应检测) 。通过对对照组 1 的 原始数据进行均数 + 1. 96 标准差推算，发现异位症患者水平 明显高于该数值，由此推测并非水平波动引起的统计学差 异，异位症患者腹腔液瘦素水平的确升高，这可能是因为子 宫内膜异位灶在腹腔液有效刺激因子的作用下出现分化并 获得分泌瘦素的能力。随后进行了腹腔液瘦素水平与 AFS 分期的关系分析，发现其呈负相关水平，( 相关系数为 － 0. 641，P ＜ 0. 01) 。其原因可能是瘦素能呈剂量依赖的方 式显著刺激异位内膜基质细胞表达其 mRNA，从而在异位灶 内形成正反馈，而中度、重度度内异症的异位内膜基质细胞 被显著抑制，轻度内异症患者正反馈作用反而因抑制不明 显，正反馈作用强导致。而对于子宫内膜瘦素蛋白表达结果 进行同步分析发现，虽然与对照组 1 存在差异( P ＜ 0. 01 ) ， 但表达并未出现明显规律性表现，特别是未出现随着病变的 严重程度出现表达呈对应改变的趋势。如果将异位症患者 表达为阴性和( + ) 阳性总和例数相加为 25，而( + + ) 阳性 和( + + + ) 阳性总和例数相加为 15，不太符合 1 ∶ 1 比例。 笔者考虑的原因为一、研究样本数量偏少导致的统计学检验 效能降低，二、子宫内膜瘦素蛋白表达可影响 EMS 的发生发 展，但并不是最终决定因素，因为该蛋白表达同时受到多因 素影响。 本研究的最终结果认为瘦素在 EMS 的发生发展起作 用，但由于影响瘦素表达的影响因素较多，其血清水平和该 蛋白在子宫内膜表达并不与疾病的病情严重程度一致，仅腹 腔液瘦素水平与病情严重程度比较一致，可结合临床用于 EMS的辅助诊断。 参 考 文 献 ［1］Oztekin E，Mogulkoc R，Baltaci AK，et al． The effect of estradiol and progesterone application on leptin concentration in ovariectomized rats ［J］． Acta Physiol Hung，2005，92( 1) : 27 － 31． ［2］Schulz LC，Widmaier EP． The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion［J］． Biol Reprod，2004，71( 6) : 1963 － 1967． ［3］魏晓强，张怡，唐猛．子宫内膜异位症血清及腹腔液瘦素水平的比 较分析［J］．实用妇产科杂志，2006，22( 1) : 34． ［4］America Fertility Society． Revised American Fertility sociery classifi- cation of endometriosis: 1985［J］． Fertil Steril，1985，43: 351 － 354． ［5］张娟，梁超，杨培荣．子宫内膜异位症患者子宫内膜中瘦素的表达 及意义［J］．中国妇幼保健，2010，25( 4) : 545 － 547． ［6］Tanaka T，Utsunomiya T，Bai T，et al． Leptin inhibits decidualization and enhances cell viability of normal human endometrial stromal cells ［J］． Int J Mol Med，2003，12: 95 － 98． ［7］Ramos MP，Rueda BR，Leavis PC，et al． Leptin serves as an upstream activator of an obligatory signaling cascade in the embryoimplantation process［J］． Endocrinology，2005，146( 2) : 694 － 701． ［8］黄宏思，黄卫彤．女性不孕症的血清瘦素检测及其临床意义［J］． 检验医学与临床，2007，4( 12) : 1147 － 1148． 收稿日期: 櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀 2010 － 11 － 08 ( 上接第 100 页) 参 考 文 献 ［1］王光荣，周曾娣，葛争鸣．吸烟对精子凋亡的影响［J］．现代医院， 2005，5( 5) : 25 － 26． ［2］邱毅，等．精子染色质扩散实验检测男性不育患者精子 DNA碎片 ［J］．国际生殖健康 /生育，2008，27( 6) : 387 － 389． ［3］张金萍，孟庆余，张雷家，等．吸烟对男性精液质量的影响及相关 性研究［J］．中华男科学，2002，8( 1) : 35 － 37． ［4］魏莎莉，周生建，王瑶，等．吸烟对男性精液参数、精子功能及睾酮 影响的研究［J］．中国男科学，2000，14( 4) : 237 － 239． 收稿日期: 2010 － 11 － 04 ·85· 中国优生与遗传杂志 2011 年第 19 卷第 4 期