1[1].11有机溶剂耐受性酵母细胞的脂肪酸组成分析

现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009，Vo1．25，No．5 有机溶剂耐受性酵母细胞的脂肪酸组成分析 侯雪丹’，吴培 ，张毅’，许喜林 (1．华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006) (2．华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640) 摘要：本丈以出发菌株酿酒酵母 (Saccharomyeescerevisiae)、筛选所得乙醇耐受~ ．Y-c．8和丙酮耐受菌株BIg．5为研究对象，分 析测定了三种不同菌株的脂肪酸组成，从而证实有机溶剂会引起酵母细胞脂肪酸成分发生改变，主要是合成更多长链不饱和脂肪酸以 适应不良环境 本研究为有机溶剂对微生物细胞的毒}生机制提供了理论支持，为有机介质中微生物全细胞催化的工业化应用提供了理 论支持。 关键词：酿酒酵母；有机溶剂耐受性；脂肪酸组成 中图分类号：Q814；文献标识码：A；文章篇号：1673．9078(2009)05．0573．05 Research on the Fatty Acid Composition in Organic Solvents T0lerated Yeast M utants HoU Xue-dan ，W U Pei ，ZHANG i ，XU)(i-Ⅱn (1．College ofBiological Science and Engineering，South China University ofTechnology,Guangzhou 510640，China) (2．College ofLight Industry and Food Sciences，South China University ofTechnology,Guangzhou 5 10640，China) Abstract：The fatty acid compositions ofSaccharomyces cerevisiae and its organic solvents tolerated mutants Y-c-·8 and B--g--5 were determined and compared．It was found that the amoun t oflong chain un saturated fatty acids in the organic solvents tolerated yeast mutants increased due to their adoptability to the harmful environment．As a theoretical research on the toxicity mechanism of organic solvent to microorganisms，this study may promote the industrial application ofmicrobe whole cell biocatalysis in organic solvents． Key words：Saccharomyces cerevisiae，solvents toleration，fatty acid composition 自1984年美国科学家 Klibanov在 ．Science上 首次报道了关于非水介质中脂肪酶的催化活性和热稳 定性的研究，非水介质中的酶促反应才受到了广泛关 注并取得了突破性的研究进展；应运而生的非水相酶 学 (Non．aqueous Enzymology)也逐渐成为酶工程领 域一个全新的学科方向，极大地拓宽了酶的应用范围 u 。 事实上，生物体内一些结合在膜上的酶也是在疏 水环境中进行其催化反应，近年来，为了满足需要， 利用微生物全细胞来代替一些体外酶的非水相转化研 究也逐渐兴起。早在l9世纪初，人们就利用酵母细胞 作为生物催化剂，其中，酵母细胞被广泛用于不对称 酮的还原L5J，包括最近报道的利用固定化近平滑假丝 酵母以及三角酵母、红酵母在水相、有机溶．水双相体 系以及离子液体一水双相体系中催化4一三甲基硅基一3一 丁炔一2一酮和对甲氧基苯乙酮的不对称还原反应，都取 得了良好的效果【6 J。用微生物细胞进行生物催化有很 收稿日期：2008—12-27 作者简介：侯雪丹，女，在读硕士，从事非水相生物催化与转化研究 多优点，其中最主要的是微生物完整细胞中含有可催 化氧化还原反应的多种脱氢酶和辅酶，用细胞作为催 化剂可省去酶的分离纯化步骤，同时不需要额外添加 辅酶循环再生系统；天然细胞内的酶和辅酶被细胞环 境所保护，反应活性高。虽然微生物有改变自身条件 以适应环境的能力，但有些非天然底物和反应介质对 细胞仍有一定的毒性，需降低催化反应中底物的浓度， 这点大大限制了微生物全细胞转化反应的工业化应 用。因此，需要对反应介质，尤其是有机溶剂对微生 物细胞的影响及细胞的自我调节适应性机制进行深入 系统地研究。 目前认为，有机溶剂对细胞的毒性主要在于两个 方面：(1)破坏细胞的生物膜，间接导致微生物生长抑 制或死亡；(2)溶剂本身的自然毒性破坏基础代谢，直 接导致细胞死亡[8圳。而对于抗有机溶剂的微生物细胞 而言，其耐受能力主要借助于细胞膜的改变来实现。 例如，磷脂头部基团的改变，细胞膜脂肪酸组成的改 变，细胞阻止溶剂进出的物理障碍及溶剂的主动泵出 573 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009，Vo1．25，No．5 系统等。其中，脂肪酸组成水平上的改变是细胞对有 机溶剂产生适应性的最重要的机制。长短链脂肪酸的 变化，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸含量的改变以及正 反链脂肪酸的相互转化都是细胞耐受性的作用机理。 脂肪酸 (fatty acid，FA)是细胞膜的重要组成部 分，也是细胞膜流动性的主要调节因子，其组成的变 化直接影响细胞的功能和行为，在保持细胞的正常生 理功能、维持细胞的形态及其变化方面均起着重要的 作用。本文以乙醇和丙酮这两种有机溶剂作为选择压 力，从酿酒酵母出发，筛选出了具有较强耐受性的酵 母菌株Y-c一8和B—g一5，对其脂肪酸组成进行分析测定， 并将之与出发菌株的细胞脂肪酸组成进行比较，得出 有机溶剂对酵母细胞脂肪酸组成的影响规律，以助解 决非水相微生物全细胞生物转化中的关键限制点。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 试验菌株 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(中科院微生 物研究所；编号AS2．599)；本实验室筛选所得乙醇耐 受性菌株 Y-c．8和丙酮耐受性菌株 B—g．5。 1．1．2 主要仪器设备 电热恒温培养箱 (I-IH．B11，上海)；超净工作台 (苏州)；YX．280型手提式压力蒸汽消毒器 (江阴)； 连续可调微量移液器 (10．100 L、100．1000 la L，德 国 eppendorf Reference)；6890型气相色谱仪 (美国 Agilent公司)；色谱柱 (25m~0．2ram 苯甲基硅胶熔 融硅毛细管柱)； 1．1．3 培养基与主要试剂 麦芽汁培养基；琼脂粉；氢氧化钠；甲醇；乙醇； 丙酮；浓盐酸；乙烷；甲基一3一丁基醚；溶液 I(45 g 氢氧化钠，150 mL甲醇，加 150 mL蒸馏水)；溶液 IIf325 rnL6．0M的盐酸溶液，275 mL甲醇)；溶液III (200 mL乙烷，200 mL甲基．3．丁基醚)；溶液IV(IO．8 g氢氧化钠，溶于 900 mL蒸馏水)。所用试剂皆为市 售分析纯。 1．2 方法 1．2．1 GC待测样品预处理 (脂肪酸衍生化) 首先在放有细胞的每个试管中加入 1．0 mL溶液 I，管口用带特富龙衬垫的盖子密封。管子短暂振摇 后放入沸水浴中5 min，取出后剧烈振摇 5-10 S，放回 水浴中完成 30 min的皂化过程。待管子冷却后开盖加 入2 mL溶液II，加盖后短暂振摇。然后严格地在 8O ±1℃条件下加热 10~1 min进行脂肪酸甲基化处 574 理。等管子冷却后加入 1．25 mL溶液II1，封盖后在医 用摇台上轻轻翻转 10 min，开盖将管底的水相部分抽 出抛弃。最后用 3 mL试剂Ⅳ加入试管中剩下的有机 相中进行碱洗，封盖，医用摇台上翻转 5 min。开盖 后，将2／3有机相加入密封的气相色谱样品管中待测。 1．2．2 GC分析检测条件 温度编程，坡道式从 170℃到 270℃每分钟升 高5℃。每个分析结束后，弹道式升温到300℃并保 持2 rain清洁柱子。采用火焰离子检测器，氢气为载 气，氮气为 “遮蔽”气，空气用来支持火焰燃烧。同 时采用自动采样装置。 2 结果与讨论 55 50 45 薯 40 35 3O 25 2．5 5 7．5 l0 l2．5 15 17．5 m ln 图 1标准样品的色谱分析图 Fig．1 Gas Chromatogram of fatty acid samples 1各脂肪酸标准品的保留时间 Table 1 Retention time of Fatty acid samples 36 34 32 3O 28 26 24 22 2．5 5 7．5 l0 12．5 l5 l 7．6 rain 图2出发株的细胞脂肪酸色谱分析图 Fig．2 Gas Chromatogram of fatty acids in wild strain Saccharomyces cerevisiaeAS2．599 脂肪酸作为微生物细胞中含量丰富且稳定的一 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009，Vol·25，No·5 种化学组分，逐渐发展成为一种独特的微生物分类法， 总量的3．22％的C1o、C12和C14，且细胞中饱和脂肪酸 可广泛应用于微生物的分析和鉴定。酵母在脂肪酸的 含量很低，十碳烷酸、十二烷酸、棕榈酸和硬脂酸的 分布模式上相当单一，绝大多数酵母仅有 C16脂肪酸 总含量都只有7．08％。 1991年Bendova等人对20株 和 c】8脂肪酸，主要的饱和脂肪酸是软脂酸，主要的 酿酒酵母菌株的脂肪酸组成进行了分析，发现不同菌 单不饱和脂肪酸是油酸。但在酿酒酵母中最多的单不 株的脂肪酸图谱不同，但大多数以不饱和直连脂肪酸 饱和脂肪酸是棕榈油酸。油酸和亚油酸则一般与磷脂 棕榈酸和油酸的含量居多【J 。本研究所显示出的酿酒 细胞膜有关。中链脂肪酸 (12：0和 14：0)和长链脂肪 酵母脂肪酸图谱与该结果一致。而且该结果与酿酒酵 酸 (20：0、22：0和 24：0)及长链多不饱和脂肪酸一般 母中只有 A一9脂肪酸去饱和酶是相吻合的，在正常生 都以痕量存在 。¨1。本为首先通过对C9一C20各种饱和脂 长条件下，只合成单烯脂酸如棕榈油酸和油酸，而不像 肪酸标准品的色谱图分析，以确定各种饱和脂肪酸甲 其它真菌和植物可合成多烯脂酸如亚油酸和亚麻酸 酯的保留时问，结果如图 1和表 1．出发菌株的细胞脂 【J 1。 肪酸测定色谱图见图 2，有机溶剂耐受的 Y．c 8和 B．g一5酵母细胞脂肪酸气相色谱图分别见图3、4。经 分析计算，将三种菌株的细胞脂肪酸组成比较列入表 2。 50 45 40 35 30 25 l p-．霉 娶 g旨 ． ／ 2．5 5 7．5 l0 12．5 l5 17．5 min 图3 Y-c-8的细胞脂肪酸色谱分析图 Fig．3 Gas Chromatogram offatty acids in Saccharomyces cerevisiaeY-c-8 36 34 32 3O 28 26 24 22 ，羹妻 萋 运銎 暑誊^ 譬 ；兰 2．5 5 7．5 l0 12．5 15 l7．6 min 图 4 B—g_5的细胞脂肪酸色谱分析图 Fig．4 Gas Chromatogram offatty acids in Saccharomyces cerevisiaeB- 5 由表2可知，出发株的细胞脂肪酸主要由C】6和 C zs组成，且主要是不饱和脂肪酸如棕榈油酸和油酸， 含量分别为 72．83％和 19．24％。另含有少量占脂肪酸 表 2出发株与耐受性菌株细胞脂肪酸组成的比较 (％) Table 2Fattyacidcontentsofwild strainand strainswithhigh organic solvent endurance 注 ：不 饱 和 度 (A／too1)=[1 x(monoene％)+2×(diene％)+ 3×(triene％)]／100 乙醇耐受性菌株Y-c一8的脂肪酸组成与出发株差 异较大，首先脂肪酸碳链种类较单一，仅有 C C16 和 c s，更倾向于合成长链脂肪酸。出发株中含有的 十碳烷酸、十二烷酸、十四碳烯酸在 Y-c一8中都没有， 但是 Y．c．8中新合成了肉豆蔻酸和亚油酸。前一种新 合成的脂肪酸的含量很低，在 l％以下，但新合成的 亚油酸的含量却高达 48．90％，说明在乙醇环境中生长 时细胞需要合成大量的不饱和脂肪酸来增强细胞的适 应性。与出发株相比，Y-c．8菌株的软脂酸、硬脂酸和 油酸的含量都有增加，尤以软脂酸含量的提高幅度最 大；但 Y-c-8中棕榈油酸的含量却大大低于出发株， 棕榈油酸在出发株中是含量最高的脂肪酸，高达 72．41％，但在 Y-c．8中却只有2．10％。总的说来，Y-c．8 中的最主要三种脂肪酸是软脂酸、油酸和亚油酸，含 量分别为 18．87％、26．69％和48．90％。且 Y_c一8的不饱 和度为 1．2756，高于出发株的0．9292。 575 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009，Vo1．25，No．5 丙酮耐受性菌株B．g．5的脂肪酸组成也与出发株 有很大差别，与Y-c一8一样脂肪酸碳链种类仅有C C16和 cl8，更倾向于合成长链脂肪酸。出发株中含有 的十碳烷酸、-t一二烷酸、十四碳烯酸在 B—g一5中也不 存在，新合成了两种脂肪酸肉豆蔻酸和亚油酸。肉豆 蔻酸的合成量较低，只有 1．22％，但亚油酸的合成量 却高达52．57％。三株菌共同含有的四种脂肪酸中，软 脂酸和油酸的含量较出发株高，但棕榈油酸和硬脂酸 的含量却比出发株要低。与Y-c．8类似，B—g．5中最主 要的三种脂肪酸是软脂酸、油酸和亚油酸，含量分别 为 18．50％、21．97％和 52．57％。且 B．g一5的不饱和度 是三株菌中最高的，为 1_3ll0。 通过以上的比较分析，可以看出无论是乙醇作为 选择压力还是丙酮作为选择压力，在细胞脂肪酸组成 的改变上，同一酿酒酵母菌株的细胞适应性机制是类 似的，虽然也存在一些细微的差别，但总体来看可以 归纳为以下几点： (1)长链脂肪酸的含量显著增加。在长期处于高 有机溶剂环境中的酵母细胞更倾向于合成碳链相对较 长的脂肪酸，如 Cl8，出发株与乙醇耐受性菌株和丙 酮耐受性菌株中 C18脂肪酸的总量分别为 20．14％、 76．75％和75．12％，即有机溶剂高耐受性菌株中C18的 含量几乎占了绝大多数。该结论与池振明等的研究一 致，他们认为细胞膜含有更多的长链脂肪酸可以增加 疏水区的表面积和范德华相互作用力，降低膜疏水区 的极性，从而恢复细胞膜的渗透性功能。而且长链脂 肪酸还可以增加疏水区的厚度，阻止有机溶剂进入疏 水区[ 。 (2)长链不饱和脂肪酸如油酸和亚油酸的含量增 加。目前广泛接受的观点是有机溶剂高耐受性强的菌 株长链不饱和脂肪酸的含量会较高，从而维持细胞膜 原有的流动性，对抗细胞膜通透性的增加，如能合成 较多的C 】脂肪酸。本实验证实了在长期高有机溶剂 条件下细胞会增加合成长链不饱和脂肪酸如油酸和亚 油酸，出发株中油酸和亚油酸含量为 19．24％和 0，乙 醇耐受性菌株中油酸和亚油酸含量为 26．69％和 48．90％，丙酮耐受性菌株中油酸和亚油酸含量为 2 1．87％和 52．57％，进一步证明了长链不饱和脂肪酸是 细胞对高浓度有机溶剂耐受l生的适应性机制之一。 (3)短链饱和脂肪酸棕榈酸和十四烷酸的含量增 加。迄今为止，有关不饱和脂肪酸 (UFA)与饱和脂肪 酸 (SFA)何者在酵母菌的有机溶剂耐受性中起决定 作用的问题，来自不同的研究尚未取得一致的看法，有 的认为UFA起决定作用，有的认为与SFA的关系密切， 576 但是，这些实验现象均发生于不同的菌株。本实验结果 表明，对于同一株酵母菌而言，在长期高有机溶剂条 件下细胞会增加合成短链饱和脂肪酸如棕榈酸和十四 烷酸，出发株中棕榈酸和十四烷酸的含量为 0和 3．81％，乙醇耐受性菌株中棕榈酸和十四烷酸的含量 分别为0．99％和 18．87％，丙酮耐受性菌株中棕榈酸和 十四烷酸的含量分别为 1．22％和 19．67％。充分表明短 链饱和脂肪酸量的增加一样可以提高膜的流动性，证 实了 SFA 与酵母的有机溶剂耐受性也有着密切的关 系，SFA与UFA在酵母菌耐有机溶剂中存在一定的共 同作用。 (4)新合成一些正常条件下不能合成的脂肪酸。 酿酒酵母中只有 A一9脂肪酸去饱和酶，因此只能合成 单烯脂肪酸，但长期的有机溶剂环境下会最终合成大 量的多烯脂肪酸，如亚油酸 (1 8：2)，说明细胞的生长 代谢发生了变化，甚至细胞内的酶系都发生了变化。 此现象少有报道，只有胡纯铿等人曾在乙醇条件下在 酵母细胞中检测到了亚油酸的存在ll列。 (5)两种不同的有机溶剂乙醇和丙酮在改变细胞 脂肪酸组成上存在共性。可以看到，乙醇耐受性菌株 和丙酮耐受性菌株的脂肪酸组成较出发株而言变化趋 势基本相同，所含脂肪酸的种类一致，只是含量略有 差异。丙酮耐受性菌株中硬脂酸和油酸的含量略低一 点，其它种类脂肪酸的含量都稍高一些，但丙酮耐受 性菌株的不饱和度更高。说明丙酮较之乙醇对细胞的 作用更强，迫使细胞产生更明显的调节机制，从而显 示了不同有机溶剂的作用差异。为我们进一步探讨其 它有机溶剂对细胞的毒性作用奠定了一定的基础。 3 结论 本文对细胞脂肪酸进行了定性定量分析，发现乙 醇、丙酮耐受性菌株与出发菌株相比细胞脂肪酸组成 发生了变化，从而证实有机溶剂会引起酵母细胞脂肪 酸成分发生改变，主要是合成更多长链不饱和脂肪酸 以适应不良环境。通过研究进一步阐明了酵母细胞有 机溶剂高耐受f生与菌株脂肪酸种类含量之间的关系。 参考文献 【1】 Klibanov A．M．Answering the question：why did biocatalysis in organic media not take offin the 1930[J]．TmTECH, 2000，18(1)：85·86 [2] Zaks A．；Klibanov A．M．Enzyme catalysis in organic media at 100℃ [J]．Science，1984，224(4654)：1249—1251 (下转第565页) 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2009，Vo1．25，No．5 3 讨论 3．1 流动相的选择 分别以甲醇一水、甲醇．水一磷酸、乙腈．水、乙腈． 水一磷酸为流动相比较分离效果。其中甲醇 水一磷酸为 流动相时可以达到最佳分离效果，故采用甲醇一水一磷 酸为流动相L6J。 3_2 流动相的pH值对分离的影响 流动相的pH值对分离的影响较大，以甲醇和磷酸 水溶液作为流动相，pH值越低，分离效果越好，考虑 到色谱柱对pH值的耐受性，因此选择体积分数为0．2％ 的磷酸水溶液。 3-3 提取方法的选择 分别考察超声提取和回流提取两种方法。结果表 明，超声提取的效果较好，峰面积较大，含量较高， 故选择超声提取方法。 3．4 提取溶剂的选择 精密称取了哥王25 g共3份，分别置于锥形瓶中， 称定重量，加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯各100 mL，超 声处理45 min，放至室温，加溶剂补足重量，滤过， 取续滤液作为供试品溶液，测得西瑞香素含量分别为 0．45，O．36，0．25 gg／g。甲醇提取物中西瑞香素含量 较高，杂质对分离度干扰小，供试品峰的分离效果好， 故采用甲醇作为提取溶剂。 3．5 提取时间的选择 精密称取了哥T25 g共4份，分别置于锥形瓶中， 各加入甲醇100 mL，称定重量，分别超声处理2O、30、 45和60 min，放至室温，加溶剂补足重量，滤过，取 续滤液作为供试品溶液，测得西瑞香素分别为 0．1 9、 0．24、0．45~t10．42．g／g，故选用45 min提取时间。 4 结论 目前，对了哥王化学成分的研究文献报道的很少。 本实验研究表明西瑞香素为了哥王中可控成分之一， 故将其作为药材中的指标性成分进行含量测定，可有 效地控制了哥王的质量。 参考文献 [1] 卫生部药典委员会编．中华人民共和国药典(第1版)[M]． 北京：人民卫生出版社，1978 【2] 贝新法，江凤鸣．有毒中草药的鉴别与中毒救治(第1版)[1vI]． 北京：中国中医药出版社，1997 [3】 国家中医药管理局．中华本草(第五册)[M】．上海：上海科学 技术出版社，1999 [4] 谢 培山，吴崇 明．了哥王化 学成分的研 究[J】．中草药通 讯，1979，(8)：6 [5]5 谢培山，杨景鹏，梁少华，等．了哥王化学成分的研究【J]．中草 药通讯，1978，3：1 [6】 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