GB-T_14701-1993__饲料中维生素B2测定方法

中华人民共和国国家 饲料 中维生素 B:测定 Method for the determination of Vitamin B2 in feeds GB/T 14701一93 1 主内容与适用范围 本标准规定了饲料中维生素Bz测定方法。 本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B:的测定。待测液中维生素 B，检测浓度为。05^0.2 pg/mL. 2 引用标准 GB 6682 实验室用水规格 3 方法原理 维生素B2(即核黄素CuHzoN,06)在440 nm紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内其荧 光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内 标荧光强度的比值 计算祥品核黄素的含最。 4 试剂和溶液 除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。 4.1盐酸溶液，0. 1 mol/L:将8. 5 mL盐酸(GB 622)用水稀释至1 000 mL 4.2 盐酸溶液，1 mol/Lo 4. 3 氢氧化钠(GB 629)溶液，1 mol/L, 4.4 冰乙酸(GB 676) 4.5冰乙酸溶液，0. 02 mol/L:将1. 8 mL冰乙酸用水稀释至1 000 m1。 4. 6高锰酸钾(GB 643)溶液，40 g/L, 4. 7过氧化氢(HG 3-1082)溶液,100 mL/L。现用现配。 4. 8 核酸素标准溶液 4.8.1 核黄素贮备液工核黄素(中国药典参照标准)，于五氧化二磷千燥器中干燥24 h，称取 0. 050 0 g，溶解于。02 mol/1乙酸溶液((4. 5)中，在蒸汽浴上恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至 500 mLe盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，低温(4 0C)保存。 该溶液每毫升含。.1 mg核黄素。 4.8.2核黄素贮备液II:取核黄素贮备液1 (4.8. 1)10 mL用。.02 mol/L乙酸溶液稀释至100 mL，盛 于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温((4 C)保存 该溶液每毫升中含10 Ig核黄素。 4.8. 3核黄素标准工作液:取核黄素贮备液1 (4. 8. 2) 10 mL，用水稀释至100 mL。现用现配 该溶液每毫升中含1 Fig核黄素。 一 .~ 一一 一一 一 - - 户一，一 ~一 ，.一 - 州一 种一 一.一 一月一 一 一 - ~- 国家技术监督局1993一11一06批准 1994一06一01实施 GB/T 14701一93 4.9 荧光素标准溶液 4.9.1 荧光素贮备液:称取荧光素(Q/HG 22-786)0.050 0 g，用水稀释至1 000 mL,盛于棕色瓶中， 低温((4C)保存 该溶液每毫升中含50 pg荧光素。 4.9.2荧光素标准工作液:取荧光素贮备液((4.9.1)1 mL，用水定容至1 000 mL,盛入棕色瓶中，低温 保存。 该溶液每毫升中含。. 05 pg荧讹素。 4.10 澳钾酚绿pH指示剂:取澳钾酚绿(HGB 3386)0. 1 g，加氢氧化钠溶液(0. 05 mot/L)2. 8 mL使之 溶解，再加水稀释至200 mL。变色范围pH 3.6^ 5.2, 4. 11 连二亚硫酸钠(Na,S,O,)(Q/HG 2-001)，防止吸潮。 仪器、设备 荧光分光光度计。 分析天平:感量0. 000 1 g o 电热恒温水浴。 具塞玻璃刻度试管，15 mLe ?? ?? ?? ?? 试样的制备 采集具有代表性的样品至少500 g，四分法缩减至100 g，磨碎，通过。.28 mm孔筛，混匀，装入密闭 容器中，避光低温保存备用。 分析步驻 7.1 称样:单一饲料、配合饲料、浓缩饲料称取1-2 g,精确至。. 001 g。维生素预混料称取。.25- 0. 50 g，精确至。. 000 1 g，将试样置于100 mL容量瓶中。 7.2 样液的制备:向盛样品的容量瓶中加65 mL盐酸溶液((4.1)，于沸水浴中加热30 min,开始加热5 -^10 min时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于121-123'C 15磅高压釜中加热30 min。冷却至室温后， 用氢氧化钠溶液((4.3)凋节pH至6. 0-6.5，然后立即加稀盐酸溶液((4. 2)使pH值约为4.5(澳甲酚绿 指示剂变为草绿色)。用水稀释至刻度。 通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5^-10 mL溶液，收集滤液于100 mL锥形瓶中。取整份清液，滴 加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释到测量体积。对 高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为。. 1 pg/mL(以下操作避免紫外光 照射)。 7.3 杂质氧化:于a,b,c三支15 mL刻度试管(5.4)中各吸入样液(7.2)10mL，同时做平行，向试管a, c中各加入1 mL蒸馏水，向试管b中加入1 mL核黄素工作液((4.8.3)。然后各加人冰乙酸(4.4)1 m1， 旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液((4. 6) 0. 5 mL,旋摇混匀，静置2 min，再逐个加入过氧化氢溶液(4.7) 0. 5 mL旋摇，使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。 7.4 测定:用荧光素溶液((4.9.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激 发波长440 nm，发射波长525 nm，测定试管a,b的荧光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过10 so 在试管c中加入20 mg连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定其荧光强度作为空 白。若溶液出现浑浊，不能读数。 分析结果的计算和表述 8门 计算方法和公式 GB/T 14701一93 核黄素(维生素B,)含量以mg/kg(或g/kg)表示，按下式计算: 一 、 * 、 _ ， 、 A一C M V 核黄素(VBzm只/k又)=书‘于 X上X弃XR ’ 、.、一‘一创‘沛’ B一A’、m ‘ V,、、 式中:A— 试管a(样液加水)的荧光强度; B一一试管b(样液加标样)的荧光强度; c— 试管c(样液加连二亚硫酸钠)的荧光强度; M一一加入核黄素标样的量,Kg; V-一一样液的初始体积，mL; V 一一测定时分取样液的体积，mL; m— 试样质量，9。 R一一稀释倍数。 A-c二 、_， __ _、_ __ B-A值应在。·66-1.5·否则需调整样液的浓度。 8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。 9 重复性 同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值: 在核黄素含量小于或等于5. 0 mg/kg时，不得超过平均值的150o. 在核黄素含量大于5. 0 mg/kg时，不得超过平均值的loyo e 在核黄素含量大于50 mg/kg时不得超过平均值的5 % . 附加说明: 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。 本标准由国家词料质检中心(北京)负责起草。 本标准主要起草人陈必芳、李兰、俞巧玲、曹建民。 本标准参照采用AOAO 199。年版((970.65)测定方法。